Name: mitigation of blood borne cell attachment to metal implants through cd47-derived peptide immobilization
Uploaded: 2020-12-03T14:30:00
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本論文で発表されたプロトコルの開発と研究は、IFおよびSJSへのNIH(NBIB)R01資金(#EB023921)、IFおよびRJLへのNIH(NHLBI)R01資金(#HL137762)によって支えられました。

この実験のためのすべてのヒトサンプルは、フィラデルフィア小児病院のIRBに従って得られた。すべての動物実験は、フィラデルフィア小児病院のIACUCの承認を得て行われました。
1. PEI-PDT でベアメタル表面をコーティング
<ol><li>ステンレス箔クーポン(1cm x 1cmまたは0.65 cm x 1cm)または2-イソプロパノールを使用したステンレス鋼メッシュディスクをシェーカ?...

<ol>
	<li>Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+managing+in-stent+restenosis:+a+review+of+clinical+data,+from+pathogenesis+to+treatment.">Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment.</a> Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).</li><li>van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacles+in+haemocompatibility+testing.">Obstacles in haemocompatibility testing.</a> Scientifica. 2013, 392584 (2013).</li><li>Mitra, A. K., Agrawal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+stent+restenosis:+bane+of+the+stent+era.">In stent restenosis: bane of the stent era.</a> Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).</li><li>Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+stents:+historical+development,+current+status+and+future+directions.">Coronary stents: historical development, current status and future directions.</a> British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).</li><li>Hoffmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+and+mechanisms+of+in-stent+restenosis.+A+serial+intravascular+ultrasound+study.">Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study.</a> Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).</li><li>Stefanini, G. G., Windecker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stent+thrombosis:+no+longer+an+issue+with+newer-generation+drug-eluting+stents.">Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents.</a> Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).</li><li>Palmerini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+with+bioabsorbable+polymer-+versus+durable+polymer-based+drug-eluting+and+bare-metal+stents:+evidence+from+a+comprehensive+network+meta-analysis.">Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).</li><li>Omar, W. A., Kumbhani, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Current+Literature+on+Bioabsorbable+Stents:+a+Review.">The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review.</a> Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).</li><li>Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+the+Inflammatory+Response+to+Clinically+Relevant+Polymers+by+Manipulating+the+Host+Response+Using+ITIM+Domain-Containing+Receptors.">Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors.</a> Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).</li><li>Oldenborg, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD47+as+a+marker+of+self+on+red+blood+cells.">Role of CD47 as a marker of self on red blood cells.</a> Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).</li><li>vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+'self'+recognition:+a+role+for+CD47-SIRPalpha+interactions+in+hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation.</a> Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).</li><li>Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+CD47-modified+biomaterials+to+mitigate+the+immune+response.">The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response.</a> Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).</li><li>Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self+inhibition+of+phagocytosis:+the+affinity+of+'marker+of+self'+CD47+for+SIRPalpha+dictates+potency+of+inhibition+but+only+at+low+expression+levels.">Self inhibition of phagocytosis: the affinity of 'marker of self' CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).</li><li>Slee, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+biocompatibility+of+CD47-functionalized+vascular+stents.">Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents.</a> Biomaterials. 87, 82-92 (2016).</li><li>Finley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+and+activation+of+platelets+and+neutrophils+with+CD47+functionalized+blood+contacting+surfaces.">Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces.</a> Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).</li><li>Stachelek, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+CD47+modified+polymer+surfaces+on+inflammatory+cell+attachment+and+activation.">The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation.</a> Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).</li><li>Inamdar, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+bioactivity+of+pepCD47+attachment+on+stainless+steel+surfaces.">Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces.</a> Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).</li><li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+delivery+of+gene+vectors+from+bare-metal+stents+by+use+of+a+biodegradable+synthetic+complex+inhibits+in-stent+restenosis+in+rat+carotid+arteries.">Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries.</a> Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).</li><li>Moser, K. V., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+rat+monocytes+migrate+through+a+BCEC-monolayer+and+express+microglia-markers+at+the+basolateral+side.">Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side.</a> Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).</li><li>vander Giessen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marked+inflammatory+sequelae+to+implantation+of+biodegradable+and+nonbiodegradable+polymers+in+porcine+coronary+arteries.">Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries.</a> Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).</li><li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphosphonate-mediated+gene+vector+delivery+from+the+metal+surfaces+of+stents.">Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).</li><li>Mouro-Chanteloup, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+red+cell+skeleton+protein+4.2+interacts+with+the+Rh+membrane+complex+member+CD47.">Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47.</a> Blood. 101 (1), 338-344 (2003).</li><li>Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+signaling+mechanisms+associated+with+CD47+modified+surfaces.">Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces.</a> Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).</li><li>Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+the+ex+vivo+Chandler+Loop+Apparatus+to+assess+the+biocompatibility+of+modified+polymeric+blood+conduits.">The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).</li></ol>

我々は、血液中に見られる炎症細胞に対する表面の反応性を低下させるという包括的な目標を持つステンレス鋼表面に治療ペプチド部分を付加する比較的新しい化学戦略を実証し、記述する。本明細書に記載されるビスホスホネート化学は、PABTの金属酸化物とビスホスホネート基との間の協調結合形成を含む。金属表面に形成されるポリビスホスホネート単層の厚さは5nm18?...

経皮的冠動脈介入は、冠動脈疾患(CAD)を治療するための治療の第一行であり、主に疾患のある動脈をステント化することを含む。しかし、ステント内のレステノーシス(ISR)およびステント血栓症は、ステント展開1に関連する一般的な合併症である。血液ステント界面での血液相互作用は、金属表面上の血漿タンパク質のほぼ即時吸着によって特徴付け、その後に血小板および炎症性細胞の付着および活性化2が続く。活性化された炎症細胞からの炎症性サイトカインおよびケモカインの放出は、チュニカ培地における血管平滑筋細胞(VSMC)の表皮修飾をもたらし、その遠心性インティカルコンパートメントへの移行を引き起こす。インティマにおける活性化VSMCの増殖は、インティミカル層の肥厚、内腔狭化およびステントレステノーシス3をもたらす。VSMCの増殖を防ぐために、薬物溶出ステント(DES)が開発されました。しかしながら、これらの薬物は、内皮細胞44,55に対するオフターゲット細胞傷害作用を有する。したがって、後期ステント血栓症は、DES66,77に関連する一般的な合併症である。ポリ-L-ラクチドのような生分解性ポリマーで作られたステントは、動物実験および初期臨床試験において多くの約束を示したが、「現実の」臨床使用が第3世代DES8に劣っていることを示した時に最終的にリコールされた。したがって、より良い患者の転帰のためにベアメタルステントの生体適合性を改善する必要がある。
CD47は、その同結合受容体シグナル調節タンパク質α(SIRPα)9に結合した場合に自然免疫応答を阻害する、ユビキタスに発現する膜貫通タンパク質である。SIRPα受容体は、免疫細胞チロシン阻害モチーフ(ITIM)ドメインとSIRPα-CD47相互作用のシグナル伝達事象を有し、最終的には炎症性細胞活性化10、11、12、13,12,のダウンレギュレーションをもたらす。10,13我々の研究室での研究は、組換えCD47またはそのペプチド誘導体が、CD47の細胞外領域の22アミノ酸Igドメイン(pepCD47)に相当し、臨床的に関連する生体材料14、15、16,15,16の範囲に対する宿主免疫応答を低下させることができることを示している。最近、pepCD47をステンレス鋼のステント表面に固定化し、修復に伴う病態生理学的応答を大幅に低下させることができることを実証した。なお、pepCD47改質面は、長期保存やエチレンオキシド滅菌法17などの関連する使用条件に適している。そのために、pepCD47は、血管内ステントの臨床的限界に対処するのに有用な治療標的であり得る。
pepCD47を金属表面に共有結合させる戦略は、金属表面の一連の新しい化学修飾を伴う。金属表面は、まずポリアリンアミンビスホスホネートを潜伏チオール基(PABT)でコーティングし、続いてチオールの脱保護とピリジルジチオ基(PDT)を搭載したポリエチレンイミン(PEI)の付着物を施した。脱保護PABTチオールとの反応で消費されないPEIのPDT基は、次いで、末端システイン残基にチオールを組み込んだpepCD47と反応し、ジスルフィド結合14、17、18,17,18を介してpepCD47を金属表面に結合させる。ペプチドの最大表面固定化をもたらすペプチドの入力濃度を求めるフルオロフォア共役pepCD47(TAMRA-pepCD47)を用いた。最後に、pepCD47被覆金属表面の急性および慢性抗炎症能力を評価し、ex vivo、チャンドラーループ装置、及び単球接続/マクロファージ拡張アッセイを用いてそれぞれ評価した。
本論文は、金属表面へのチオラ化ペプチドの付着のための系統的なプロトコルを提供する。ペプチドの最大固定化密度を決定する;全血および単球に曝露されたpepCD47被覆金属表面の抗炎症特性を評価する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:834px;" width="833">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">1 M Tris-HCL</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">15567-027</td>
			<td style="width:239px;">pH - 7.5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">4% Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:184px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">16539-07</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">4% Sodium Citrate</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:129px;">S5770</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">ACK lysing buffer</td>
			<td style="width:184px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">118-156-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">202301</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">203501</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52)</td>
			<td style="width:184px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:129px;">550979</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1)</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:129px;">MCA341</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">201701</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Chloroform Certified ACS</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Dimethyl Formammide (DMF)</td>
			<td style="width:184px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:129px;">39117</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Embra stainless steel grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">E200-SS</td>
			<td>stainless steel mesh mesh disks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Ficoll Hypaque</td>
			<td style="width:184px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:129px;">17-1440-02</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:184px;">ACROS organic</td>
			<td style="width:129px;">148930025</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">goat anti-mouse IgG Alexa Fluor</td>
			<td style="width:184px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:129px;">A11030</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:184px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:129px;">402-01</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human pepCD47</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4099101</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">A426P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Metal adapters</td>
			<td style="width:184px;">Leur Fitting</td>
			<td style="width:129px;">6515IND</td>
			<td style="width:239px;">1 way adapter 316 ss 1/4&#34;-5/16&#34; hoes end</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Methanol</td>
			<td style="width:184px;">RICCA chemical company</td>
			<td style="width:129px;">4829-32</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Microscope</td>
			<td style="width:184px;">Nikon Eclipse</td>
			<td style="width:129px;">TE300</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pottasium Bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">P184-500</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">PVC tubes</td>
			<td style="width:184px;">Terumo-CVS</td>
			<td style="width:129px;">60050</td>
			<td style="width:239px;">1/4&#34; X 1/16 8&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride</td>
			<td style="width:184px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">11653</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:184px;">Bio-Rad laboratories</td>
			<td style="width:129px;">161-0302</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Sodum actetate (C2H3NaO2)</td>
			<td style="width:184px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:129px;">A13184</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Src peptide</td>
			<td>Bachem</td>
			<td style="width:129px;">4092599</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen</td>
			<td>Microgroup, Medway, MA</td>
			<td style="width:129px;">20097328</td>
			<td>1 cm X 6 mm OD</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Stainless steel foils (AISI 316L)</td>
			<td style="width:184px;">Goodfellow, Coraopolis, PA</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:239px;">100 mm X 100 mm X 0.05 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47)</td>
			<td>Bachem</td>
			<td style="width:129px;">4100277</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:282px;">TMB (3,3&#8217; ,5,5&#8217; -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PG82089</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Tween-20</td>
			<td style="width:184px;">Bio-Rad laboratories</td>
			<td style="width:129px;">170-6531</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">V12883</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitigation of blood borne cell attachment to metal implants through cd47-derived peptide immobilization

ベアメタルステントと薬物溶出ステントに関連する主要な合併症は、それぞれステント内のレステノーシスと後期ステント血栓症です。したがって、金属ステントの生体適合性の向上は依然として重要な課題である。このプロトコルの目的は、血管内ステントを含む医療インプラントに接触する血液の生体適合性を高めるために生物学的に活性なペプチドによる金属表面修飾の堅牢な技術を記述することです。CD47は、自己の免疫学的種特異的マーカーであり、抗炎症特性を有する。研究は、細胞外領域におけるCD47のIgドメインに対応する22アミノ酸ペプチド(pepCD47)が、全長タンパク質のような抗炎症特性を有することを示している。ラットのインビボ研究、および私たちの研究室からのウサギおよびヒト血液実験システムにおけるex vivo研究は、金属に対するpepCD47固定化が炎症性細胞の付着および活性化を防ぐことによって生体適合性を向上させることを実証した。本論文では、金属表面の機能化とペプチド付着のステップバイステッププロトコルについて説明する。金属表面は、ポリアリアアミンビスリン酸を使用して修飾され、後にチオールの脱保護およびピリジルジチオ基(PEI-PDT)を搭載したポリエチレンイアミンとの反応によるチオール反応性部位の増幅が続く。最後に、pepCD47は、二重8-アミノ-3,6-dioxa-オクタノイルスペーサーを介してコアペプチド配列に接続された末端システイン残基を組み込んで、ジスルフィド結合を介して金属表面に結合される。この金属表面へのペプチド付着の方法論は効率的で比較的安価であり、したがって、いくつかの金属生体材料の生体適合性を改善するために適用することができる。

図 1に示すように、金属表面は、一連の化学修飾によってペプチドの付着に対してチオール反応性をレンダリングします。PABTインキュベーションに続いてPEI-PDT処理を行うと、金属表面がペプチドの付着に適しています。C末流でシステイン残基を含むペプチドCD47(pepCD47)は、フレキシブルな二重AEEAcブリッジを介してコアpepCD47配列に結合し、ジスルフィド結合を介してチ?...

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Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

ここで提示されるペプチドCD47(pepCD47)をポリビスフォスフォネート化学を用いて金属ステントに付加するためのプロトコルです。pepCD47を用いた金属ステントの機能化は、炎症細胞の付着および活性化を防止し、生体適合性を向上させる。

CD47由来ペプチド固定化による金属インプラントへの血液媒介性細胞の取り付けの軽減

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, ...

このプロトコルは、金属表面に治療用ペプチドを付加する新しい化学的戦略を含み、幅広い金属生体材料の生体適合性を改善する可能性を秘めています。これは、バイオインプラントのベアメタル表面にペプチドや治療タンパク質を付加するための普遍的かつ堅牢な技術です。この技術を用いて、ステントで引き起こされる炎症反応を防ぐために、CD47ペプチドを付加して金属ステントの生体適合性を向上させた。2-イソプロパノールを用いたステンレス箔クーポンまたはメッシュディスクをシェーカーで5分間洗浄します。この洗浄を2回行い、その後、1回の洗浄につき10分間クロロホルムでサンプルを2回洗浄します。クレンジングしたステンレス鋼のサンプルをオーブンに220°Cで30分間置きます。焼いたホイルやメッシュディスクをPABTの0.5%水溶液に浸し、シェーカーに1時間インキュベートします。脱イオン蒸留水でPABT修飾サンプルを5回洗浄します。標本を新しいバイアルに移し、その後の繰り返しを行います。シェーカーで室温で15分間、TCEPでサンプルを処理します。脱気した蒸留水を、凍結乾燥機などの真空発生装置を用いた丸底フラスコで脱気し、脱気水でホイルやメッシュディスクを5回洗浄します。サンプルを新しいバイアルに移し、その後の繰り返しを行います。212.5マイクロリットルのストックPEI-PDTと125マイクロリットルの0.4モル酢酸ナトリウムを脱気水に希釈して、1%PEI-PDT溶液の5ミリリットルを調製します。洗浄したステンレス鋼の標本を1%PEI-PDTでインキュベートします。空気をアルゴンガスに置き換え、バイアルを気密に密封し、シェーカーに1時間混ぜます。ペプチドの結合をすぐに進めるか、最大1週間摂氏4度でサンプルを保存します。ヒトペプチドCD47粉末を脱気50%酢酸に溶解させて、1ミリリットルのヒトペプチドCD47ストック溶液につき1ミリグラムを調製し、4.5ミリリットルの脱ガスPBSで500マイクロリットルのストックを溶解して作業溶液を調製する。洗浄されたPEI-PDT被覆試料を、室温でペプチドCD47の働く溶液で1時間振盪してインキュベートする。終了したら、テキスト原稿に記載されているように、ペプチドCD47コーティングサンプルを洗浄します。ペプチドCD47またはスクランブルペプチドで金属箔をコーティングした後、4分の1インチのPVCチューブを38センチメートルの長さの部分にカットし、最大8つの未改変、スクランブルペプチド、またはペプチドCD47改変金属箔を3つの異なるチューブに挿入します。健康なヒトドナーから30ミリリットルの血液を収集し、抗血小板薬を含まない、採取した血液の凝固を防ぐために4%クエン酸ナトリウムの1ミリリットルで注射器を事前にロードする。10ミリリットルの注射器を使用して各チューブに10ミリリットルの血液を入れ、金属アダプターで端を接続します。チャンドラーループ装置の車輪に血液で満たされたチューブを置き、4時間摂氏37度で車輪の回転によって金属箔に沿って血液を渡します。チューブから血液を排出し、IRB要件に従ってそれを処分し、その後、ホイルを取り出すためにメスでチューブを切断します。0.1モル塩化ナトリウムでカコチル酸ナトリウムバッファーに70%溶液を希釈することにより、2%グルタルアルデヒド溶液を調製します。2%グルタルアルデヒド溶液中のホイルを15分間インキュベートし、一晩摂氏4度で貯蔵します。金属箔を分析する前に、PBSで3回洗浄してください。37°Cの水浴でPBSの8ミリリットルを温めます。1つのCFDAバイアルに90マイクロリットルのDMSOを加えて10ミリモルCFDA染料ストック溶液を調製し、その後、75マイクロリットルのストックCFDAを暖かいPBSに加えて作業溶液を調製する。チューブを数回反転して、アルミニウム箔で混ぜて覆います。各ホイルを24ウェルプレートに入れるCFDA染料を1ミリリットルに入れる。プレートをアルミホイルで覆い、37°Cでプレートを15分間インキュベートし、ホイルをPBSで3回洗浄し、蛍光顕微鏡で画像化します。共有結合したTAMRAコンジュゲートペプチドCD47の濃度を定量し、金属表面上のペプチドの最大固定化密度を決定した。最大ペプチド保持量は約180ナノグラム/センチメートル平方メートルで、1ミリリットル当たり100マイクログラムの入力濃度で達成された。改変金属表面上のTAMRA共役ペプチドCD47の固定化は、蛍光顕微鏡法によってさらに裏付けられた、TAMRA共役ペプチドCD47処理メッシュディスクの表面から放出される均一な蛍光を示した。この修飾を欠いた対照メッシュの表面で最小蛍光のみが検出され、それによって非特異的に結合したTAMRA結合ペプチドCD47を蛍光の主な供給源として除外した。また、ペプチドCD47被覆表面は、スクランブル修飾および未改変ペプチド制御と比較して、血液媒介性細胞の付着物が大幅に減少することを確認した。ラットバフィーコート細胞から単球を培養し、ペプチドCD47修飾ステンレス箔を用いて培養した。急性単球付着の58%の減衰、マクロファージへのそれらの変換、およびマクロファージの増殖が機能的な表面に観察された。このプロトコルを試みている間、できるだけ速く行われる脱ガス水または試薬を含むステップを実行し、酸素への暴露を最小限に抑えることが非常に重要です。当社の技術は、金属表面との細胞相互作用を選択的に調節し、RT-PCR、フローサイトメトリー、免疫蛍光などの典型的な細胞型同定アッセイは、この技術と互換性があります。この技術は、様々な生理活性ペプチドのために開発された場合、組織材料界面での生体適合性を高めるのに役立ちます。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs

Nanoformulated抗レトロウイルス薬の血液媒介マクロファージのキャリッジのための方法の開発

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To ...

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Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

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ステップ成長PEG-ペプチドハイドロゲルからβ細胞のスフェロイドの発生と復旧

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人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

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改善された細胞接着のためのポリテトラフルオロエチレンにウェットケミストリーおよびペプチドの固定化

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Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

骨形成タンパク質 2 固体表面にクリックケミストリーによるサイト向け固定

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多段鎖変位リソグラフィーを用いた遺伝子の機能的な面を固定化

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...