Name: mitigation of blood borne cell attachment to metal implants through cd47-derived peptide immobilization
Uploaded: 2020-12-03T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization at JoVE.com

이 논문에 제시된 프로토콜 개발 및 연구는 IF및 SJS에 NIH (NBIB) R01 자금 조달 (# EB023921) 및 NIH (NHLBI) R01 자금 조달 (# HL137762)에 의해 IF 및 RJL에 지원되었다.

이 실험을 위한 모든 인간 적인 견본은 필라델피아의 아동 병원의 IRB에 따라 얻어졌습니다. 모든 동물 실험은 필라델피아 아동 병원의 IACUC의 승인에 따라 수행되었습니다.
1. PEI-PDT로 베어 메탈 표면 코팅
<ol><li>스테인레스 스틸 호일 쿠폰(1cm x 1cm 또는 0.65cm x 1cm) 또는 스테인레스 스틸 메쉬 디스크를 셰이커(60°C, 200rpm)에 2-이소프로판올로 5분 간 세척합니다. 이 ?...

<ol>
	<li>Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+managing+in-stent+restenosis:+a+review+of+clinical+data,+from+pathogenesis+to+treatment.">Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment.</a> Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).</li><li>van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacles+in+haemocompatibility+testing.">Obstacles in haemocompatibility testing.</a> Scientifica. 2013, 392584 (2013).</li><li>Mitra, A. K., Agrawal, D. 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A serial intravascular ultrasound study.</a> Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).</li><li>Stefanini, G. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+biocompatibility+of+CD47-functionalized+vascular+stents.">Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents.</a> Biomaterials. 87, 82-92 (2016).</li><li>Finley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+and+activation+of+platelets+and+neutrophils+with+CD47+functionalized+blood+contacting+surfaces.">Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces.</a> Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).</li><li>Stachelek, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+CD47+modified+polymer+surfaces+on+inflammatory+cell+attachment+and+activation.">The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation.</a> Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).</li><li>Inamdar, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+bioactivity+of+pepCD47+attachment+on+stainless+steel+surfaces.">Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces.</a> Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).</li><li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+delivery+of+gene+vectors+from+bare-metal+stents+by+use+of+a+biodegradable+synthetic+complex+inhibits+in-stent+restenosis+in+rat+carotid+arteries.">Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries.</a> Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).</li><li>Moser, K. V., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+rat+monocytes+migrate+through+a+BCEC-monolayer+and+express+microglia-markers+at+the+basolateral+side.">Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side.</a> Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).</li><li>vander Giessen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marked+inflammatory+sequelae+to+implantation+of+biodegradable+and+nonbiodegradable+polymers+in+porcine+coronary+arteries.">Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries.</a> Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).</li><li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphosphonate-mediated+gene+vector+delivery+from+the+metal+surfaces+of+stents.">Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).</li><li>Mouro-Chanteloup, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+red+cell+skeleton+protein+4.2+interacts+with+the+Rh+membrane+complex+member+CD47.">Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47.</a> Blood. 101 (1), 338-344 (2003).</li><li>Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+signaling+mechanisms+associated+with+CD47+modified+surfaces.">Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces.</a> Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).</li><li>Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+the+ex+vivo+Chandler+Loop+Apparatus+to+assess+the+biocompatibility+of+modified+polymeric+blood+conduits.">The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).</li></ol>

우리는 혈액에서 발견되는 염증 세포로 표면의 반응성을 줄이는 가장 중요한 목표를 가지고 스테인레스 스틸 표면에 치료 펩티드 모에티를 더하는 비교적 새로운 화학 전략을 시연하고 설명합니다. 본 명세서에 기재된 비스포스포네이트 화학은 PABT의 금속 산화물 과 비스포스포네이트 그룹 간의 결합 형성을 조정하는 것을 포함한다. 금속 표면에 형성된 폴리비스포산 단층의 두께는 5nm<sup class="x...

경피 관상 동맥 개입은 관상 동맥 질환을 치료하는 치료의 첫 번째 라인입니다 (CAD) 주로 병은 동맥을 스텐팅 포함. 그러나 스텐트 내 레스텐소증(ISR) 및 스텐트 혈전증은 스텐트 배치1과관련된 일반적인 합병증이다. 혈액-스텐트 인터페이스에서의 혈액 상호 작용은 금속 표면에 혈장 단백질을 거의 즉각적으로 흡착한 후 혈소판 및 염증성 세포 부착 및 활성화2를특징으로 한다. 활성 염증 세포에서 염증성 사이토카인및 케모킨의 방출은 튜니카 미디어에서 혈관 매끄러운 근육 세포 (VSMC)의 페노티픽 변형으로 이어지고 동식물 구획으로의 원심 이동을 유발합니다. 친밀감에서 활성화 된 VSMC의 확산은 친밀감 층 두껍게, 루멘 협착 및 스텐트 레스텐트3을초래한다. 약물 용출 스텐트 (DES)는 VSMC 확산을 방지하기 위해 개발되었다; 그러나, 이들 약물은 내피세포에대한 오프표적 세포독성 효과가4,5. 따라서, 늦은 스텐트 혈전증은 DES6,,7과관련된 일반적인 합병증이다. 폴리 L-lactide와 같은 생분해성 폴리머로 만든 스텐트는 동물 실험과 초기 임상 시험에서 많은 약속을 보였지만, 결국 "실제" 임상 사용이3세대 DES8에대한 열등감을 입증했을 때 리콜되었다. 따라서, 더 나은 환자 결과를 위해 베어 메탈 스텐트의 생체 적합성을 개선할 필요가 있다.
CD47은 본선 수용체 신호 조절 단백질 알파(SIRPα)9에결합될 때 타고난 면역 반응을 억제하는 유비쿼터스로 발현된 대막 단백질이다. SIRPα 수용체는 면역 세포 티로신 억제 모티프(ITIM) 도메인및 SIRPα-CD47 상호작용에 따른 신호 발생을 가지며 궁극적으로 염증성 세포 활성화10,,11,12,,13의하향 조절을 초래한다., 우리의 실험실에서 연구는 재조합 CD47 또는 그 펩티드 유도체, CD47 (pepCD47)의 세포외 영역의 22 아미노산 Ig 도메인에 대응하는 것으로 나타났습니다, 임상적으로 관련된 생체 물질의 범위에 호스트 면역 반응을 감소시킬 수있습니다 14,,15,,16. 최근에는 pepCD47이 스테인레스 스틸 스텐트 표면에 고정되어 있으며 레스테인노시스와 관련된 병리생리학적 반응을 현저히 감소시킬 수 있음을 입증했습니다. 참고로, 펩CD47 변형 표면은 장기 저장 및 에틸렌 산화물멸균(17)과같은 관련 사용 조건에 따라 절단된다. 이를 위해 펩CD47은 혈관 내 스텐트의 임상적 한계를 해결하는 데 유용한 치료 대상이 될 수 있다.
금속 표면에 pepCD47의 공유 부착에 대한 전략은 금속 표면의 일련의 새로운 화학 적 변형을 포함한다. 금속 표면은 먼저 잠복 티올 그룹 (PABT)으로 폴리 에일라민 비스포스포네이트로 코팅된 다음 티올의 보호 및 설치된 피리딜디티오 그룹 (PDT)을 갖춘 폴리에틸렌네이민 (PEI)의 부착을 제거합니다. 비보호 된 PABT 티올과의 반응에서 소비되지 않은 PEI의 PDT 그룹은 다음 말단 시스테인 잔류물에 티올을 통합 pepCD47로 반응하여 이황화물 결합14,17,,18을통해 금속 표면에 결합 펩CD47을 초래한다.,17 우리는 펩티드의 최대 표면 고정을 초래하는 펩티드의 입력 농도를 결정하기 위해 플루오로포어 컨쥬게이드 펩CD47(TAMRA-pepCD47)을 사용했다. 마지막으로, 당사는 Chandler 루프 장치 및 단핵 부착/대식세포 팽창 분석등을 이용하여 펩CD47 코팅 금속 표면, 전 생체의 급성 및 만성 항염증 능력을 각각 평가하였다.
본 백서는 금속 표면에 티오라드 펩티드의 부착을 위한 체계적인 프로토콜을 제공한다; 펩티드의 최대 고정 밀도를 결정; 전혈 및 절연 단핵구에 노출된 pepCD47 코팅 금속 표면의 항염증 특성을 평가한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:834px;" width="833">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">1 M Tris-HCL</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">15567-027</td>
			<td style="width:239px;">pH - 7.5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">4% Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:184px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">16539-07</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">4% Sodium Citrate</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:129px;">S5770</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">ACK lysing buffer</td>
			<td style="width:184px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">118-156-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">202301</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">203501</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52)</td>
			<td style="width:184px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:129px;">550979</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1)</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:129px;">MCA341</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">201701</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Chloroform Certified ACS</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Dimethyl Formammide (DMF)</td>
			<td style="width:184px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:129px;">39117</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Embra stainless steel grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">E200-SS</td>
			<td>stainless steel mesh mesh disks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Ficoll Hypaque</td>
			<td style="width:184px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:129px;">17-1440-02</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:184px;">ACROS organic</td>
			<td style="width:129px;">148930025</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">goat anti-mouse IgG Alexa Fluor</td>
			<td style="width:184px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:129px;">A11030</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:184px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:129px;">402-01</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human pepCD47</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4099101</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">A426P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Metal adapters</td>
			<td style="width:184px;">Leur Fitting</td>
			<td style="width:129px;">6515IND</td>
			<td style="width:239px;">1 way adapter 316 ss 1/4&#34;-5/16&#34; hoes end</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Methanol</td>
			<td style="width:184px;">RICCA chemical company</td>
			<td style="width:129px;">4829-32</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Microscope</td>
			<td style="width:184px;">Nikon Eclipse</td>
			<td style="width:129px;">TE300</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pottasium Bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">P184-500</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">PVC tubes</td>
			<td style="width:184px;">Terumo-CVS</td>
			<td style="width:129px;">60050</td>
			<td style="width:239px;">1/4&#34; X 1/16 8&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride</td>
			<td style="width:184px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">11653</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:184px;">Bio-Rad laboratories</td>
			<td style="width:129px;">161-0302</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Sodum actetate (C2H3NaO2)</td>
			<td style="width:184px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:129px;">A13184</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Src peptide</td>
			<td>Bachem</td>
			<td style="width:129px;">4092599</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen</td>
			<td>Microgroup, Medway, MA</td>
			<td style="width:129px;">20097328</td>
			<td>1 cm X 6 mm OD</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Stainless steel foils (AISI 316L)</td>
			<td style="width:184px;">Goodfellow, Coraopolis, PA</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:239px;">100 mm X 100 mm X 0.05 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47)</td>
			<td>Bachem</td>
			<td style="width:129px;">4100277</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:282px;">TMB (3,3&#8217; ,5,5&#8217; -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PG82089</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Tween-20</td>
			<td style="width:184px;">Bio-Rad laboratories</td>
			<td style="width:129px;">170-6531</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">V12883</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitigation of blood borne cell attachment to metal implants through cd47-derived peptide immobilization

베어 메탈 스텐트와 약물 용출 스텐트와 관련된 주요 합병증은 각각 스텐트 내 레스타디스와 늦은 스텐트 혈전증입니다. 따라서 금속 스텐트의 생체 적합성을 개선하는 것은 여전히 중요한 과제입니다. 이 프로토콜의 목표는 혈관 내 스텐트를 포함하여 혈액 접촉 의료 임플란트의 생체 적합성을 높이기 위해 생물학적활성 펩티드에 의한 금속 표면 변형의 견고한 기술을 설명하는 것입니다. CD47은 면역학적 종별 자가 마커이며 항염증 성질을 갖는다. 연구 결과에 따르면 세포외 영역(pepCD47)에서 CD47의 Ig 도메인에 대응하는 22개의 아미노산 펩티드가 전길이 단백질과 같은 항염증 성질을 갖는다. 쥐의 생체 내 연구, 그리고 우리의 실험실에서 토끼와 인간의 혈액 실험 시스템에서 전 생체 연구 는 펩CD47 금속에 고정 염증 세포 부착 및 활성화를 방지 하 여 그들의 생체 적합성을 향상 입증 했다. 이 백서는 금속 표면 및 펩타이드 부착의 기능화를 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다. 금속 표면은 잠복 티올 그룹(PABT)을 사용한 폴리알리알라민 비스포스페이트(polyallylamine bisphosphate)를 사용하여 수정한 다음, 피리딜디티오 군(PEI-PDT)으로 설치된 폴리에틸렌네이민과의 반응을 통해 티올의 보호 및 티올 반응성 부위의 증폭을 한다. 마지막으로, 펩CD47은 이중 8-아미노-3,6-디옥사 옥타노일 스페이서를 통해 코어 펩타이드 서열에 연결된 말단 시스테인 잔류물을 통합하여, 디설파이드 결합을 통해 금속 표면에 부착된다. 금속 표면에 대한 펩타이드 부착의 이 방법론은 효율적이고 상대적으로 저렴하므로 여러 금속 생체 재료의 생체 적합성을 향상시키기 위해 적용 될 수있다.

금속 표면은 도 1에도시된 바와 같이 일련의 화학 적 변형을 통해 펩타이드 부착에 대한 티올 반응성 렌더링된다. PEI-PDT 처리뒤에 PABT 인큐베이션은 펩티드 부착을 위해 금속 표면을 가능하게 합니다. 펩타이드 CD47(pepCD47)은 C-terminus에서 시스테인 잔류물을 함유하고 있으며, 유연한 듀얼 AEEAc 브리지를 통해 코어 펩CD47 서열에 결합되어 이설화 결합을 통해 티올 반응성 표면에 ...

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Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

여기에 제시된 펩티드 CD47(pepCD47)을 다비스포산 화학을 이용한 금속 스텐트에 대한 프로토콜이 제시된다. pepCD47을 사용하여 금속 스텐트의 기능화는 염증 세포의 부착 및 활성화를 방지하므로 생체 적합성을 향상시키게 합니다.

CD47 유래 펩타이드 고정화를 통해 금속 임플란트에 대한 혈액 매개 세포 부착 완화

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, ...

이 프로토콜은 금속 표면에 치료 펩티드를 추가하는 새로운 화학 전략을 포함하고, 금속 생체 재료의 넓은 범위의 생체 적합성을 향상시킬 수있는 잠재력을 가지고있다. 이것은 생체 임플란트의 맨금속 표면에 펩티드와 치료 단백질을 부수는 보편적이고 강력한 기술입니다. 우리는 스텐팅에 의해 유발되는 염증 반응을 방지하기 위해 CD47 펩티드를 부속시킴으로써 금속 스텐트의 생체 적합성을 개선하기 위해이 기술을 사용했습니다.스테인레스 스틸 호일 쿠폰 이나 메쉬 디스크를 셰이커에 2-이소프로판올을 5 분 동안 세척하. 이 세척을 두 번 수행한 다음 세척당 10 분 동안 클로로포름으로 샘플을 두 번 씻으시다. 정화된 스테인리스 스틸 샘플을 섭씨 220도에서 30분간 오븐에 놓습니다.구운 호일 이나 메쉬 디스크를 PABT의 0.5% 수성 용액으로 담그고 1시간 동안 셰이커에 인큐베이션합니다. 폐기된 증류수로 PABT 변형 샘플을 5회 세척합니다. 시편을 새로운 바이알로 옮기고 세근을 반복합니다.셰이커의 실온에서 샘플을 TCEP로 15분 동안 처리합니다. 디가스 는 리오필라이저와 같은 진공 생성 장치로 둥근 바닥 플라스크에서 증류수를 분해하고, 호일 또는 메쉬 디스크를 탈가스물로 5회 세척한다. 샘플을 새 바이알로 옮기고 세서스를 반복합니다.주식 PEI-PDT의 212.5 마이크로리터와 125 마이크로리터의 0.4 마이크로리터를 탈가스 수역에서 아세테이트1%의 PEI-PDT 용액 5밀리리터를 준비한다. 세척된 스테인리스 스틸 시편을 1%PEI-PDT로 배양합니다. 공기를 아르곤 가스로 교체하고, 유리병을 밀폐밀봉하고, 셰이커에 1시간 동안 섞습니다.펩타이드 컨쥬게이션으로 즉시 진행하거나 최대 1주일 동안 섭씨 4도에 샘플을 저장하십시오. 밀리리터 인간 펩타이드 CD47 스톡 용액을 탈가시 50% 아세트산으로 용해한 다음, 500마이크로리터를 탈가스 PBS4.5 밀리리터로 용해시켜 작업 용액을 준비한다. 세척된 PEI-PDT 코팅 시료를 실온에서 펩타이드 CD47의 작동 용액과 함께 1시간 동안 흔들어 줍니다.완료되면 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 펩타이드 CD47 코팅 샘플을 세척한다. 펩타이드 CD47 또는 스크램블 펩타이드로 금속 호일을 코팅한 후, 분기 인치 PVC 튜브를 38센티미터 길이의 3개로 자르고 수정되지 않은 스크램블 펩타이드 또는 펩타이드 CD47 수정 금속 호일을 3개의 다른 튜브에 삽입합니다. 어떤 항 혈소판 약물무료 건강한 인간 기증자로부터 혈액의 30 밀리리터를 수집, 수집 된 혈액의 응고를 방지하기 위해 4 %의 나트륨 구연산나트륨의 한 밀리리터와 주사기를 미리로드.10 밀리리터 주사기를 사용하여 각 튜브에 10 밀리리터의 혈액을 넣고 끝을 금속 어댑터와 연결합니다. Chandler 루프 장치의 바퀴에 피가 가득한 튜브를 놓고 4 시간 동안 섭씨 37도에서 바퀴 회전으로 금속 호일을 따라 혈액을 전달합니다. 튜브에서 혈액을 배출하고 IRB 요구 사항에 따라 폐기 한 다음 메스로 튜브를 잘라 포일을 회수합니다.염화 나트륨 0.1과 나트륨 cacodylate 버퍼에 70% 용액을 희석하여 2% 글루타랄데히드 용액을 준비합니다. 2% 글루타랄데히드 용액을 15분 동안 배양하고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 보관하십시오. 금속 호일을 분석하기 전에 PBS로 세 번 씻으시기를 바하십시오.섭씨 37도의 수조에서 PBS8 밀리리터를 따뜻하게 합니다. 10 밀리머 CFDA 염료 재고 용액을 하나의 CFDA 바이알에 90 마이크로리터를 추가하여 10 밀리미터 CFDA 염료 스톡 솔루션을 준비한 다음, 따뜻한 PBS에 주식 CFDA의 75 마이크로리터를 추가하여 작업 용액을 준비합니다. 튜브를 몇 번 반전하여 알루미늄 호일로 혼합하고 덮습니다.각 호일을 CFDA 염료 1밀리리터에 24웰 플레이트에 넣습니다. 알루미늄 호일로 접시를 덮고 접시를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양한 다음 PBS에서 포일을 세 번 씻은 다음 형광 현미경으로 이미지를 만듭니다. 공자된 TAMRA 공주 펩타이드 CD47의 농도는 금속 표면상에 펩타이드의 최대 고정 밀도를 결정하기 위해 정량화되었다.최대 펩티드 보존은 밀리리터당 100 마이크로그램의 입력 농도로 달성된 약 180 나노그램의 센티미터 제곱이었습니다. 변형된 금속 표면에 TAMRA 컨쥬게이드 펩타이드 CD47의 고정은 형광 현미경 검사법에 의해 더욱 확증되었고, 이는 TAMRA 컨쥬게이트 펩타이드 CD47 처리 메쉬 디스크의 표면에서 방출되는 균일한 형광을 보였다. 변형이 부족한 제어 매시 표면에서 최소한의 형광만 검출되어, 비특이적으로 결합된 TAMRA 공주 펩티드 CD47을 형광의 주요 원천으로 배제한다.또한 펩타이드 CD47 코팅 표면이 스크램블 수정 및 수정되지 않은 펩티드 컨트롤에 비해 혈액 매개 세포 부착의 급격한 감소를 보이는 것으로 확인되었다. 쥐 버피 코트 세포로부터 분리된 단핵구는 베어 메탈및 펩타이드 CD47 변형 스테인리스 스틸 호일에 배양되었다. 급성 단세포 부착의 58% 감쇠, 대식세포로의 변환 및 대식세포 증식은 기능화된 표면에서 관찰되었다.이 프로토콜을 시도하는 동안, 가능한 한 빨리 수행될 탈가스 물 또는 시약을 포함하는 단계를 수행하고 산소에 대한 노출을 최소화하는 것이 매우 중요합니다. 당사의 기술은 금속 표면과의 세포 상호 작용을 선택적으로 조절하고 RT-PCR, 유동 세포측정 및 면역 형광과 같은 전형적인 세포 유형 식별 분석법은 이 기술과 호환됩니다. 다양한 생체 활성 펩티드를 위해 개발될 때, 이 기술은 조직 재료 인터페이스에서 생체 적합성을 증가시켜 기악할 수 있다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs

Nanoformulated Antiretroviral 약물의 혈액 본 대식 세포 캐리지를위한 방법 개발

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To ...

연구

생체공학

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

원자 힘 현미경에 의해 영상에 대한 세균 고정

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

단계 성장 PEG-펩타이드 Hydrogels에서 β-세포 Spheroids의 생성 및 복구

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Graphene Coatings for Biomedical Implants

생명을 주입 Graphene 코팅

Atomically smooth graphene as a surface coating has potential to improve implant properties. This demonstrates a method for coating nitinol alloys with ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Microcontact 인쇄를 통해 정렬 기능 심근 조직의 생성

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention

내피 세포 캡처 및 유지에 대한 강자성 베어 메탈 스텐트

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

향상된 세포 접착 폴리 테트라 플루오로 에틸렌에 젖은 화학 및 펩티드 고정화

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

뼈 Morphogenetic 단백질의 2 고체 표면에 화학 클릭 하 여 사이트 감독 동원 정지

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

다단계 가닥 변위 리소 그래피를 사용 하 여 유전자의 기능 표면-동원 정지

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...