Name: mitigation of blood borne cell attachment to metal implants through cd47-derived peptide immobilization
Uploaded: 2020-12-03T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization at JoVE.com

Protokollutvikling og studier presentert i denne artikkelen ble støttet av NIH (NBIB) R01-finansiering (# EB023921) til IF og SJS, og NIH (NHLBI) R01-finansiering (# HL137762) til IF og RJL.

Alle menneskelige prøver for dette eksperimentet ble innhentet i samsvar med IRB av Children's Hospital of Philadelphia. Alle dyreforsøk ble utført ved godkjenning fra IACUC ved Children's Hospital of Philadelphia.
1. Belegg nakne metalloverflater med PEI-PDT
<ol><li>Vask rustfritt stål folie kuponger (1 cm x 1 cm eller 0,65 cm x 1 cm) eller rustfritt stål mesh disker med 2-isopropanol i en shaker (60 ° C, hastighet på 200 rpm) i 5 min. Utfør dette trinnet 2x. Vask d...

<ol>
	<li>Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+managing+in-stent+restenosis:+a+review+of+clinical+data,+from+pathogenesis+to+treatment.">Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment.</a> Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).</li><li>van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacles+in+haemocompatibility+testing.">Obstacles in haemocompatibility testing.</a> Scientifica. 2013, 392584 (2013).</li><li>Mitra, A. K., Agrawal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+stent+restenosis:+bane+of+the+stent+era.">In stent restenosis: bane of the stent era.</a> Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).</li><li>Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+stents:+historical+development,+current+status+and+future+directions.">Coronary stents: historical development, current status and future directions.</a> British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).</li><li>Hoffmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+and+mechanisms+of+in-stent+restenosis.+A+serial+intravascular+ultrasound+study.">Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study.</a> Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).</li><li>Stefanini, G. G., Windecker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stent+thrombosis:+no+longer+an+issue+with+newer-generation+drug-eluting+stents.">Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents.</a> Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).</li><li>Palmerini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+with+bioabsorbable+polymer-+versus+durable+polymer-based+drug-eluting+and+bare-metal+stents:+evidence+from+a+comprehensive+network+meta-analysis.">Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).</li><li>Omar, W. A., Kumbhani, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Current+Literature+on+Bioabsorbable+Stents:+a+Review.">The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review.</a> Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).</li><li>Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+the+Inflammatory+Response+to+Clinically+Relevant+Polymers+by+Manipulating+the+Host+Response+Using+ITIM+Domain-Containing+Receptors.">Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors.</a> Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).</li><li>Oldenborg, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD47+as+a+marker+of+self+on+red+blood+cells.">Role of CD47 as a marker of self on red blood cells.</a> Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).</li><li>vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+'self'+recognition:+a+role+for+CD47-SIRPalpha+interactions+in+hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation.</a> Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).</li><li>Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+CD47-modified+biomaterials+to+mitigate+the+immune+response.">The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response.</a> Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).</li><li>Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self+inhibition+of+phagocytosis:+the+affinity+of+'marker+of+self'+CD47+for+SIRPalpha+dictates+potency+of+inhibition+but+only+at+low+expression+levels.">Self inhibition of phagocytosis: the affinity of 'marker of self' CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).</li><li>Slee, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+biocompatibility+of+CD47-functionalized+vascular+stents.">Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents.</a> Biomaterials. 87, 82-92 (2016).</li><li>Finley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+and+activation+of+platelets+and+neutrophils+with+CD47+functionalized+blood+contacting+surfaces.">Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces.</a> Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).</li><li>Stachelek, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+CD47+modified+polymer+surfaces+on+inflammatory+cell+attachment+and+activation.">The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation.</a> Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).</li><li>Inamdar, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+bioactivity+of+pepCD47+attachment+on+stainless+steel+surfaces.">Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces.</a> Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).</li><li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+delivery+of+gene+vectors+from+bare-metal+stents+by+use+of+a+biodegradable+synthetic+complex+inhibits+in-stent+restenosis+in+rat+carotid+arteries.">Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries.</a> Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).</li><li>Moser, K. V., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+rat+monocytes+migrate+through+a+BCEC-monolayer+and+express+microglia-markers+at+the+basolateral+side.">Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side.</a> Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).</li><li>vander Giessen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marked+inflammatory+sequelae+to+implantation+of+biodegradable+and+nonbiodegradable+polymers+in+porcine+coronary+arteries.">Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries.</a> Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).</li><li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphosphonate-mediated+gene+vector+delivery+from+the+metal+surfaces+of+stents.">Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).</li><li>Mouro-Chanteloup, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+red+cell+skeleton+protein+4.2+interacts+with+the+Rh+membrane+complex+member+CD47.">Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47.</a> Blood. 101 (1), 338-344 (2003).</li><li>Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+signaling+mechanisms+associated+with+CD47+modified+surfaces.">Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces.</a> Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).</li><li>Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+the+ex+vivo+Chandler+Loop+Apparatus+to+assess+the+biocompatibility+of+modified+polymeric+blood+conduits.">The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).</li></ol>

Vi demonstrerer og beskriver en relativt ny kjemisk strategi for å legge terapeutisk peptid moieties til en rustfritt stål overflate med det overordnede målet om å redusere overflatens reaktivitet med inflammatoriske celler som finnes i blod. Bisfosfonatkjemien som er beskrevet her, innebærer koordinering av bindingsdannelse mellom metalloksider og bisfosfonatgrupper av PABT. Tykkelsen av polybisfosfonat monolag dannet på metalloverflaten overstiger ikke 5 nm18, og er derfor ubetydelig for d...

Perkutan koronar intervensjon er den første linjen av terapi for å behandle koronarsykdom (CAD) og innebærer først og fremst stenting de syke arteriene. In-stent restenosis (ISR) og stenttrombose er imidlertid vanlige komplikasjoner forbundet med stentutplassering1. Blodinteraksjon ved blod-stent grensesnittet er preget av en nesten umiddelbar adsorpsjon av plasmaproteiner på metalloverflaten, etterfulgt av blodplate og inflammatorisk cellevedlegg og aktivering2. Utgivelsen av de inflammatoriske cytokinene og kjemokinene fra aktiverte inflammatoriske celler fører til fenotypisk modifisering av vaskulære glatte muskelceller (VSMCer) i tunikamediet og utløser deres sentripetalmigrasjon til det intimale rommet. Spredning av aktivert VSMC i intima resulterer i intimal lag fortykning, lumen innsnevring og in-stent restenosis3. Legemiddeluttet stenter (DES) ble utviklet for å forhindre VSMC-spredning; Disse stoffene har imidlertid en off-target cytotoksisk effekt på endotelcellene4,5. Derfor er sen stenttrombose en vanlig komplikasjon forbundet med DES6,7. Stenter laget av biologisk nedbrytbare polymerer, som poly-L-lactide har vist mye løfte i dyreforsøk og innledende kliniske studier, men ble til slutt tilbakekalt da den "virkelige" kliniske bruken viste deres mindreverdighet til tredjegenerasjon DES8. Derfor er det behov for å forbedre biokompatibiliteten til nakne metallstenter for bedre pasientutfall.
CD47 er et allestedsnærværende uttrykt transmembraneprotein som hemmer den medfødte immunresponsen når det erbundettil sin kognatreseptor Signal Regulatory Protein alpha (SIRPα) 9 . SIRPα-reseptoren har et immunsystemcelle tyrosinhemmersomt motiv (ITIM) domene og signalhendelsene på SIRPα - CD47 interaksjon til slutt resultere i nedregulering av inflammatorisk celleaktivering10,11,12,13. Forskning i vårt laboratorium har vist at rekombinant CD47 eller dets peptidderivat, tilsvarende 22 aminosyreN IG-domenet i den ekstracellulære regionen CD47 (pepCD47), kan redusere vertens immunrespons mot en rekke klinisk relevantebiomaterialer 14,,15,,16. Nylig har vi vist at pepCD47 kan immobiliseres til rustfritt stål stent overflater og redusere patofysiologisk respons forbundet med restenose. Vær oppmerksom på at de pepCD47 modifiserte overflatene er mottagelige for relevante bruksforhold som langsiktig lagring og etylenoksidsterilisering17. For dette formål kan pepCD47 være et nyttig terapeutisk mål for å løse de kliniske begrensningene av endovaskulære stenter.
Strategien for kovalent vedlegg av pepCD47 til en metalloverflate innebærer en rekke nye kjemiske modifikasjoner av metalloverflaten. Metalloverflatene er først belagt med polylaminbisfosfonat med latente tiolgrupper (PABT) etterfulgt av debeskyttelse av tioler og vedlegg av polyetylenimin (PEI) med installerte pyridyldithiogrupper (PDT). PDT grupper av PEI upontbyrdet i reaksjonen med debeskyttede PABT thiols blir deretter reagert med pepCD47 inkorporere thiols i terminalen cystein rester, noe som resulterer i binding pepCD47 til metalloverflaten via en disulfid bånd14,17,18. Vi brukte en fluoroforkonjugert pepCD47 (TAMRA-pepCD47) for å bestemme inngangskonsentrasjonen av peptid som resulterer i maksimal overflateimmobilisering av peptidet. Til slutt evaluerte vi den akutte og kroniske antiinflammatoriske kapasiteten til de pepCD47-belagte metallflatene, ex vivo, ved hjelp av Chandler-sløyfeapparatet og monocytttilbehør / makrofagutvidelsesanalyse.
Dette papiret gir en systematisk protokoll for vedlegg av thiolated peptider til metalloverflaten; bestemme den maksimale immobiliseringstettheten av peptidet; og vurdere de antiinflammatoriske egenskapene til pepCD47 belagte metalloverflater utsatt for fullblod og isolerte monocytter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:834px;" width="833">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">1 M Tris-HCL</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">15567-027</td>
			<td style="width:239px;">pH - 7.5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">4% Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:184px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">16539-07</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">4% Sodium Citrate</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:129px;">S5770</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">ACK lysing buffer</td>
			<td style="width:184px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">118-156-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">202301</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">203501</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52)</td>
			<td style="width:184px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:129px;">550979</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1)</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:129px;">MCA341</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">201701</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Chloroform Certified ACS</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Dimethyl Formammide (DMF)</td>
			<td style="width:184px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:129px;">39117</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Embra stainless steel grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">E200-SS</td>
			<td>stainless steel mesh mesh disks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Ficoll Hypaque</td>
			<td style="width:184px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:129px;">17-1440-02</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:184px;">ACROS organic</td>
			<td style="width:129px;">148930025</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">goat anti-mouse IgG Alexa Fluor</td>
			<td style="width:184px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:129px;">A11030</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:184px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:129px;">402-01</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human pepCD47</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4099101</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">A426P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Metal adapters</td>
			<td style="width:184px;">Leur Fitting</td>
			<td style="width:129px;">6515IND</td>
			<td style="width:239px;">1 way adapter 316 ss 1/4&#34;-5/16&#34; hoes end</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Methanol</td>
			<td style="width:184px;">RICCA chemical company</td>
			<td style="width:129px;">4829-32</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Microscope</td>
			<td style="width:184px;">Nikon Eclipse</td>
			<td style="width:129px;">TE300</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pottasium Bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">P184-500</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">PVC tubes</td>
			<td style="width:184px;">Terumo-CVS</td>
			<td style="width:129px;">60050</td>
			<td style="width:239px;">1/4&#34; X 1/16 8&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride</td>
			<td style="width:184px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">11653</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:184px;">Bio-Rad laboratories</td>
			<td style="width:129px;">161-0302</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Sodum actetate (C2H3NaO2)</td>
			<td style="width:184px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:129px;">A13184</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Src peptide</td>
			<td>Bachem</td>
			<td style="width:129px;">4092599</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen</td>
			<td>Microgroup, Medway, MA</td>
			<td style="width:129px;">20097328</td>
			<td>1 cm X 6 mm OD</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Stainless steel foils (AISI 316L)</td>
			<td style="width:184px;">Goodfellow, Coraopolis, PA</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:239px;">100 mm X 100 mm X 0.05 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47)</td>
			<td>Bachem</td>
			<td style="width:129px;">4100277</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:282px;">TMB (3,3&#8217; ,5,5&#8217; -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PG82089</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Tween-20</td>
			<td style="width:184px;">Bio-Rad laboratories</td>
			<td style="width:129px;">170-6531</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">V12883</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitigation of blood borne cell attachment to metal implants through cd47-derived peptide immobilization

De viktigste komplikasjonene forbundet med bare metallstenter og legemiddeluttårne er henholdsvis in-stent restenose og sen stenttrombose. Dermed er forbedring av biokompatibiliteten til metallstenter fortsatt en betydelig utfordring. Målet med denne protokollen er å beskrive en robust teknikk for metalloverflatemodifikasjon av biologisk aktive peptider for å øke biokompatibiliteten til blodkontakting av medisinske implantater, inkludert endovaskulære stenter. CD47 er en immunologisk artsspesifikk markør for selv og har antiinflammatoriske egenskaper. Studier har vist at en 22 aminosyre peptid tilsvarer Ig domenet av CD47 i den ekstracellulære regionen (pepCD47), har antiinflammatoriske egenskaper som full lengde protein. In vivo studier på rotter, og ex vivo studier på kanin og humant blod eksperimentelle systemer fra vårt laboratorium har vist at pepCD47 immobilisering på metaller forbedrer deres biokompatibilitet ved å hindre inflammatorisk celle vedlegg og aktivering. Dette papiret beskriver den trinnvise protokollen for funksjonalisering av metalloverflater og peptidtilbehør. Metalloverflatene er modifisert ved hjelp av polylaminbisfosfat med latente tiolgrupper (PABT) etterfulgt av deprotection av tioler og forsterkning av tiolreaktive steder via reaksjon med polyetylenimin installert med pyridyldithio grupper (PEI-PDT). Til slutt, pepCD47, som omfatter terminal cystein rester koblet til kjernen peptid sekvens gjennom en dobbel 8-amino-3,6-didioxa-octanoyl spacer, er festet til metalloverflaten via disulfid bindinger. Denne metodikken for peptidtilbehør til metalloverflaten er effektiv og relativt billig, og kan dermed brukes til å forbedre biokompatibiliteten til flere metalliske biomaterialer.

Metalloverflatene gjengis tiolreaktive for peptidtilbehør via en rekke kjemiske modifikasjoner, som vist i figur 1. PABT inkubasjon etterfulgt av PEI-PDT behandling gjør metalloverflaten mottagelig for peptid vedlegg. Peptid CD47 (pepCD47) som inneholder cysteinrester ved C-terminus som er koblet til kjernepepCD47-sekvensen gjennom en fleksibel dobbel AEEAc-bro er kovalent festet til de tiolreaktive overflatene via disulfidbindinger. Ved hjelp av denne protokollen har vi vist at pepCD47 fo...

Watch this Scientific Journal Video about Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization at JoVE.com

Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

Presentert her er en protokoll for å legge peptid CD47 (pepCD47) til metall stenter ved hjelp av polybisfosfonat kjemi. Funksjonalisering av metallstenter ved hjelp av pepCD47 forhindrer vedlegg og aktivering av inflammatoriske celler og forbedrer dermed deres biokompatibilitet.

Reduksjon av blodbårne celletilbehør til metallimplantater gjennom CD47-avledet peptidimmobilisering

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, ...

Denne protokollen inneholder en ny kjemisk strategi for å legge terapeutiske peptider til metalliske overflater, og har potensial til å forbedre biokompatibiliteten til et bredt spekter av metalliske biomaterialer. Dette er en universell og robust teknikk for å tilføye peptider og terapeutiske proteiner til de nakne metalloverflatene av bioimplanter. Vi har brukt denne teknologien til å forbedre biokompatibiliteten til metalliske stenter ved å legge til CD47-peptider for å forhindre betennelsesresponsene som utløses av stenting.Begynn med å vaske rustfritt stål folie kuponger eller mesh plater med 2-isopropanol i en shaker i fem minutter. Utfør denne vasken to ganger, vask deretter prøvene to ganger med kloroform i 10 minutter per vask. Legg de rensede prøvene i rustfritt stål i en ovn ved 220 grader Celsius i 30 minutter.Senk de bakte foliene eller nettingskivene i 0,5 % vandig oppløsning av PABT og inkuber dem i en shaker i en time. Vask pabt-modifiserte prøver med deionisert destillert vann fem ganger. Overfør prøvene til et nytt hetteglass og gjenta vaskene.Behandle prøvene med TCEP i 15 minutter ved romtemperatur på en shaker. Degas deionisert destillert vann i en rund bunnkolbe med en vakuumgenererende enhet, for eksempel en lyofilisator, og vask foliene eller nettingskivene med avgasset vann fem ganger. Overfør prøvene til et nytt hetteglass og gjenta vaskene.Forbered fem milliliter med 1% PEI-PDT-oppløsning ved å fortynne 212,5 mikroliter av lageret PEI-PDT og 125 mikroliter på 0,4 molarnatriumacetat i avgasset vann. Inkuber de vasket prøvene i rustfritt stål med 1%PEI-PDT. Bytt ut luft med argongass, forsegle hetteglassene lufttett, og bland dem på en shaker i en time.Fortsett umiddelbart med peptidbedømmingen eller lagre prøvene ved fire grader Celsius i opptil en uke. Forbered ett mg per milliliter humant peptid CD47 lagerløsning ved å oppløse humant peptid CD47 pulver i avgassede 50% eddiksyre, og klargjør deretter arbeidsløsningen ved å oppløse 500 mikroliter av bestanden i 4,5 milliliter av avgassede PBS. Inkuber de vasket PEI-PDT-belagte prøvene med arbeidsløsningen av peptid CD47 ved romtemperatur med risting i en time.Når du er ferdig, vask peptidET CD47-belagte prøver som beskrevet i teksten manuskriptet. Etter belegg metallfolie med enten peptid CD47 eller kryptert peptid, kutt kvart tomme PVC rør i tre 38 centimeter lange stykker og sett inn opptil åtte umodifiserte, kryptert peptid, eller peptid CD47-modifiserte metallfolie i tre forskjellige rør. Samle 30 milliliter blod fra friske menneskelige donorer uten noen anti-blodplate medisiner, pre-lasting sprøyten med en milliliter av 4% natriumsitrat for å hindre koagulasjon av det innsamlede blodet.Sett 10 milliliter blod i hvert rør ved hjelp av en 10 milliliter sprøyte og koble endene med metalladaptere. Plasser de blodfylte rørene på hjulene på Chandler-sløyfeapparatet og send blodet langs metallfoliene ved hjulrotasjon ved 37 grader Celsius i fire timer. Tøm blodet fra rørene og kast det i henhold til IRB-kravene, og kutt deretter rørene med en skalpell for å hente foliene.Forbered 2% glutaraldehydoppløsning ved å fortynne 70% oppløsningen i natriumkacodylatbuffer med 0,1 molarnatriumklorid. Inkuber foliene i 2% glutaraldehydløsning i 15 minutter og lagre dem ved fire grader Celsius over natten. Før du analyserer metallfoliene, vask dem tre ganger med PBS.Varm åtte milliliter PBS i et 37 grader Celsius vannbad. Forbered 10 millimolar CFDA fargelagerløsning ved å legge til 90 mikroliter DMSO til ett CFDA hetteglass, og klargjør deretter arbeidsløsningen ved å legge til 75 mikroliter av aksjen CFDA til den varme PBS. Inverter røret et par ganger for å blande og dekke det med aluminiumsfolie.Legg hver folie i en milliliter CFDA-fargestoff i en 24-brønns plate. Dekk platen med aluminiumsfolie og inkuber platen ved 37 grader Celsius i 15 minutter, vask deretter foliene tre ganger i PBS og bilde dem med et fluorescensmikroskop. Konsentrasjonen av kovalent bundet TAMRA konjugert peptid CD47 ble kvantifisert for å bestemme maksimal immobiliseringstetthet av peptidet på metalloverflaten.Maksimal peptidretensjon var ca. 180 nanogram per centimeter kvadrert, som ble oppnådd med en inngangskonsentrasjon på 100 mikrogram per milliliter. Immobilisering av TAMRA konjugert peptid CD47 på modifiserte metalloverflater ble ytterligere bekreftet av fluorescensmikroskopi, som viste en jevn fluorescens som slippes ut fra overflaten av TAMRA konjugert peptid CD47-behandlet mesh plater. Bare minimal fluorescens ble oppdaget på overflaten av kontrollmaskene som manglet modifikasjonen, og dermed unntatt en ikke-spesifikt bundet TAMRA konjugert peptid CD47 som den viktigste kilden til fluorescens.Det ble også bekreftet at peptid CD47-belagte overflater viser en drastisk reduksjon i blodbåren celletilbehør sammenlignet med de krypterte modifiserte og umodifiserte peptidkontrollene. Monocytter isolert fra rottebuffy coat celler ble dyrket på bart metall og peptid CD47-modifisert rustfritt stål folier. En 58% demping av akutt monocytt vedlegg, deres konvertering til makrofager, og makrofag spredning ble observert på de funksjonaliserte overflatene.Mens du prøver denne protokollen, er det svært viktig å utføre trinnene som involverer avgasset vann eller reagenser som skal utføres så raskt som mulig og for å minimere eksponeringen for oksygen. Vår teknologi modulerer selektivt cellulær interaksjon med metalloverflater og en typisk celletypeidentifikasjonsanalyse, for eksempel RT-PCR, strømningscytometri og immunofluorescens, er kompatible med denne teknikken. Når den er utviklet for en rekke bioaktive peptid, kan denne teknologien være medvirkende til å øke biokompatibiliteten ved vevsmaterialegrensesnittet.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Produksjon og gjenoppretting av β-celle sfæroider Fra Step-vekst PEG-peptid Hydrogeler

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Graphene Coatings for Biomedical Implants

Graphene Belegg for Biomedical Implantater

Atomically smooth graphene as a surface coating has potential to improve implant properties. This demonstrates a method for coating nitinol alloys with ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Generasjon av alliansefrie Funksjonell Myocardial Tissue Gjennom Microcontact Printing

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Forbedret fremgangsmåte for fremstilling av en human cellebasert kontakt Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention

Ferromagnetisk Bare Metal Stent for endotelcelle Capture og oppbevaring

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Wet kjemi og Peptide Immobilisering på Polytetrafluoroethylene for Forbedret Cell-adhesjon

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Nettsted rettet immobilisering av bein Morfogenetiske proteinet 2 Solid overflater av Klikk kjemi

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Funksjonell overflaten-immobilisering av gener bruker må Strand forskyvning Litografi

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...