Name: mitigation of blood borne cell attachment to metal implants through cd47-derived peptide immobilization
Uploaded: 2020-12-03T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization at JoVE.com

O desenvolvimento de protocolos e estudos apresentados neste artigo foram apoiados pelo financiamento do NIH (NBIB) R01 (# EB023921) para IF e SJS, e financiamento do NIH (NHLBI) R01 (# HL137762) para IF e RJL.

Todas as amostras humanas para este experimento foram obtidas de acordo com o IRB do Hospital Infantil da Filadélfia. Todos os experimentos em animais foram realizados mediante aprovação do IACUC do Hospital Infantil da Filadélfia.
1. Revestimento de superfícies metálicas nuas com PEI-PDT
<ol><li>Lave os cupons de papel alumínio inoxidável (1 cm x 1 cm ou 0,65 cm x 1 cm) ou discos de malha de aço inoxidável com 2 isopropanol em um shaker (60 °C, velocidade de 200 ...

<ol>
	<li>Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+managing+in-stent+restenosis:+a+review+of+clinical+data,+from+pathogenesis+to+treatment.">Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment.</a> Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).</li><li>van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacles+in+haemocompatibility+testing.">Obstacles in haemocompatibility testing.</a> Scientifica. 2013, 392584 (2013).</li><li>Mitra, A. K., Agrawal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+stent+restenosis:+bane+of+the+stent+era.">In stent restenosis: bane of the stent era.</a> Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).</li><li>Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+stents:+historical+development,+current+status+and+future+directions.">Coronary stents: historical development, current status and future directions.</a> British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).</li><li>Hoffmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+and+mechanisms+of+in-stent+restenosis.+A+serial+intravascular+ultrasound+study.">Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study.</a> Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).</li><li>Stefanini, G. G., Windecker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stent+thrombosis:+no+longer+an+issue+with+newer-generation+drug-eluting+stents.">Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents.</a> Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).</li><li>Palmerini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+with+bioabsorbable+polymer-+versus+durable+polymer-based+drug-eluting+and+bare-metal+stents:+evidence+from+a+comprehensive+network+meta-analysis.">Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).</li><li>Omar, W. A., Kumbhani, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Current+Literature+on+Bioabsorbable+Stents:+a+Review.">The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review.</a> Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).</li><li>Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+the+Inflammatory+Response+to+Clinically+Relevant+Polymers+by+Manipulating+the+Host+Response+Using+ITIM+Domain-Containing+Receptors.">Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors.</a> Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).</li><li>Oldenborg, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD47+as+a+marker+of+self+on+red+blood+cells.">Role of CD47 as a marker of self on red blood cells.</a> Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).</li><li>vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+'self'+recognition:+a+role+for+CD47-SIRPalpha+interactions+in+hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation.</a> Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).</li><li>Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+CD47-modified+biomaterials+to+mitigate+the+immune+response.">The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response.</a> Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).</li><li>Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self+inhibition+of+phagocytosis:+the+affinity+of+'marker+of+self'+CD47+for+SIRPalpha+dictates+potency+of+inhibition+but+only+at+low+expression+levels.">Self inhibition of phagocytosis: the affinity of 'marker of self' CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).</li><li>Slee, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+biocompatibility+of+CD47-functionalized+vascular+stents.">Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents.</a> Biomaterials. 87, 82-92 (2016).</li><li>Finley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+and+activation+of+platelets+and+neutrophils+with+CD47+functionalized+blood+contacting+surfaces.">Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces.</a> Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).</li><li>Stachelek, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+CD47+modified+polymer+surfaces+on+inflammatory+cell+attachment+and+activation.">The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation.</a> Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).</li><li>Inamdar, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+bioactivity+of+pepCD47+attachment+on+stainless+steel+surfaces.">Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces.</a> Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).</li><li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+delivery+of+gene+vectors+from+bare-metal+stents+by+use+of+a+biodegradable+synthetic+complex+inhibits+in-stent+restenosis+in+rat+carotid+arteries.">Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries.</a> Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).</li><li>Moser, K. V., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+rat+monocytes+migrate+through+a+BCEC-monolayer+and+express+microglia-markers+at+the+basolateral+side.">Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side.</a> Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).</li><li>vander Giessen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marked+inflammatory+sequelae+to+implantation+of+biodegradable+and+nonbiodegradable+polymers+in+porcine+coronary+arteries.">Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries.</a> Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).</li><li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphosphonate-mediated+gene+vector+delivery+from+the+metal+surfaces+of+stents.">Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).</li><li>Mouro-Chanteloup, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+red+cell+skeleton+protein+4.2+interacts+with+the+Rh+membrane+complex+member+CD47.">Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47.</a> Blood. 101 (1), 338-344 (2003).</li><li>Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+signaling+mechanisms+associated+with+CD47+modified+surfaces.">Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces.</a> Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).</li><li>Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+the+ex+vivo+Chandler+Loop+Apparatus+to+assess+the+biocompatibility+of+modified+polymeric+blood+conduits.">The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).</li></ol>

Demonstramos e descrevemos uma estratégia química relativamente nova para anexar moieties de peptídeos terapêuticos a uma superfície de aço inoxidável com o objetivo abrangente de reduzir a reatividade da superfície com células inflamatórias encontradas no sangue. A química de bisfosfonato aqui descrita envolve a formação de vínculos coordenados entre os óxidos metálicos e os grupos de bisfosfonato de PABT. A espessura da monocamada de polifosfosfonato formada na superfície metálica não excede 5 nm<sup...

A intervenção coronária percutânea é a primeira linha de terapia para tratar doenças da artéria coronária (CAD) e envolve principalmente o stent das artérias doentes. No entanto, a restenose do stent (ISR) e a trombose do stent são complicações comuns associadas à implantação do stent1. A interação sanguínea na interface sangue-stent é caracterizada por uma adsorção quase imediata de proteínas plasmáticas na superfície metálica, seguida por apego e ativação celular plaquetária e inflamatória2. A liberação das citocinas inflamatórias e quimiocinas de células inflamatórias ativadas leva à modificação fenotípica das células musculares lisas vasculares (VSMCs) na mídia tunica e desencadeia sua migração centrípeta para o compartimento intimal. A proliferação de VSMC ativado na intimação resulta em espessamento de camada intimal, estreitamento do lúmen e restenose in-stent3. Os stents de eluição de drogas (DES) foram desenvolvidos para evitar a proliferação do VSMC; no entanto, essas drogas têm um efeito citotóxico fora do alvo nas células endoteliais4,5. Portanto, trombose do stent tardio é uma complicação comum associada ao DES6,7. Stents feitos de polímeros biodegradáveis, como o poli-L-lactide, mostraram muita promessa nos experimentos animais e ensaios clínicos iniciais, mas acabaram sendo lembrados quando o uso clínico "da vida real" demonstrou sua inferioridade à3ª geração do DES8. Portanto, é necessário melhorar a biocompatibilidade dos stents metálicos nus para melhores resultados do paciente.
CD47 é uma proteína transmembrana onipresentemente expressa que inibe a resposta imune inata quando vinculada ao seu receptor cognato Signal Regulatory Protein alfa (SIRPα)9. O receptor SIRPα possui um motivo inibidor de tyrosina de células imunes (ITIM) e os eventos de sinalização sobre a interação SIRPα - CD47 acabam resultando na queda da ativação celular inflamatória10,,11,,12,13. Pesquisas em nosso laboratório mostraram que cd47 recombinante ou seu derivado peptídeo, correspondente ao domínio de 22 aminoácidos Ig da região extracelular de CD47 (pepCD47), pode reduzir a resposta imune do hospedeiro a uma gama de biomateriais clinicamente relevantes14,,15,,16. Recentemente, demonstramos que o pepCD47 pode ser imobilizado para superfícies de stent de aço inoxidável e reduzir significativamente a resposta fisiopatológica associada à restenose. Note-se que as superfícies modificadas pepCD47 são favoráveis a condições de uso relevantes, como armazenamento a longo prazo e esterilização de óxido de etileno17. Para isso, o pepCD47 pode ser um alvo terapêutico útil para lidar com as limitações clínicas dos stents endovasculares.
A estratégia para a fixação covalente de pepCD47 a uma superfície metálica envolve uma série de novas modificações químicas da superfície metálica. As superfícies metálicas são primeiro revestidas com bisfosfonato de poliallavina com grupos de tiol latentes (PABT), seguidos pela desproteção dos tiols e apego da polietileneimina (PEI) com grupos piridyldithio instalados (PDT). Grupos de PDT de PEI não consumidos na reação com thiols PABT desprotegidos são então reagidos com pepCD47 incorporando thiols nos resíduos de cisteína terminal, resultando em pepCD47 de ligação à superfície metálica através de uma ligação de dissulfeto14,,17,18. Utilizamos um pepCD47 conjugado fluoróforo (TAMRA-pepCD47) para determinar a concentração de entrada de peptídeo que resulta na imobilização máxima da superfície do peptídeo. Finalmente, avaliamos a capacidade anti-inflamatória aguda e crônica das superfícies metálicas revestidas de pepCD47, ex vivo, utilizando o aparelho de loop Chandler, e o ensaio de expansão de apego/macrófago monócito/ macrófago, respectivamente.
Este artigo fornece um protocolo sistemático para a fixação de peptídeos tiaolados à superfície metálica; determinando a densidade máxima de imobilização do peptídeo; e avaliando as propriedades anti-inflamatórias das superfícies metálicas revestidas pepCD47 expostas a sangue inteiro e monócitos isolados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:834px;" width="833">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">1 M Tris-HCL</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">15567-027</td>
			<td style="width:239px;">pH - 7.5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">4% Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:184px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">16539-07</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">4% Sodium Citrate</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:129px;">S5770</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">ACK lysing buffer</td>
			<td style="width:184px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">118-156-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">202301</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">203501</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52)</td>
			<td style="width:184px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:129px;">550979</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1)</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:129px;">MCA341</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">201701</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Chloroform Certified ACS</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Dimethyl Formammide (DMF)</td>
			<td style="width:184px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:129px;">39117</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Embra stainless steel grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">E200-SS</td>
			<td>stainless steel mesh mesh disks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Ficoll Hypaque</td>
			<td style="width:184px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:129px;">17-1440-02</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:184px;">ACROS organic</td>
			<td style="width:129px;">148930025</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">goat anti-mouse IgG Alexa Fluor</td>
			<td style="width:184px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:129px;">A11030</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:184px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:129px;">402-01</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human pepCD47</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4099101</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">A426P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Metal adapters</td>
			<td style="width:184px;">Leur Fitting</td>
			<td style="width:129px;">6515IND</td>
			<td style="width:239px;">1 way adapter 316 ss 1/4&#34;-5/16&#34; hoes end</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Methanol</td>
			<td style="width:184px;">RICCA chemical company</td>
			<td style="width:129px;">4829-32</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Microscope</td>
			<td style="width:184px;">Nikon Eclipse</td>
			<td style="width:129px;">TE300</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pottasium Bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">P184-500</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">PVC tubes</td>
			<td style="width:184px;">Terumo-CVS</td>
			<td style="width:129px;">60050</td>
			<td style="width:239px;">1/4&#34; X 1/16 8&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride</td>
			<td style="width:184px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">11653</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:184px;">Bio-Rad laboratories</td>
			<td style="width:129px;">161-0302</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Sodum actetate (C2H3NaO2)</td>
			<td style="width:184px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:129px;">A13184</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Src peptide</td>
			<td>Bachem</td>
			<td style="width:129px;">4092599</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen</td>
			<td>Microgroup, Medway, MA</td>
			<td style="width:129px;">20097328</td>
			<td>1 cm X 6 mm OD</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Stainless steel foils (AISI 316L)</td>
			<td style="width:184px;">Goodfellow, Coraopolis, PA</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:239px;">100 mm X 100 mm X 0.05 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47)</td>
			<td>Bachem</td>
			<td style="width:129px;">4100277</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:282px;">TMB (3,3&#8217; ,5,5&#8217; -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PG82089</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Tween-20</td>
			<td style="width:184px;">Bio-Rad laboratories</td>
			<td style="width:129px;">170-6531</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">V12883</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitigation of blood borne cell attachment to metal implants through cd47-derived peptide immobilization

As principais complicações associadas com stents metálicos nus e stents de eluição de drogas são restenose de stent e trombose do stent tardio, respectivamente. Assim, melhorar a biocompatibilidade dos stents metálicos continua sendo um desafio significativo. O objetivo deste protocolo é descrever uma técnica robusta de modificação da superfície metálica por peptídeos biologicamente ativos para aumentar a biocompatibilidade de implantes médicos de contato sanguíneo, incluindo stents endovasculares. CD47 é um marcador de auto-doença específico de espécies imunológicas e tem propriedades anti-inflamatórias. Estudos mostraram que um peptídeo de 22 aminoácidos correspondente ao domínio Ig de CD47 na região extracelular (pepCD47), tem propriedades anti-inflamatórias como a proteína de comprimento total. Estudos in vivo em ratos, e estudos ex vivo em sistemas experimentais de coelhos e sangue humanos do nosso laboratório demonstraram que a imobilização pepCD47 em metais melhora sua biocompatibilidade, impedindo a fixação e ativação de células inflamatórias. Este artigo descreve o protocolo passo a passo para a funcionalização de superfícies metálicas e acessório de peptídeo. As superfícies metálicas são modificadas usando bisfosfato de poliallavina com grupos de tiol latente (PABT), seguidos de desproteção de tiais e amplificação de sítios de tiol-reativos via reação com polietileneimina instalada com grupos piridyldithio (PEI-PDT). Finalmente, pepCD47, incorporando resíduos de cisteína terminal conectados à sequência de peptídeos do núcleo através de um espaçador duplo 8-amino-3,6-dioxa-octanoyl, são anexados à superfície metálica através de ligações de dissulfeto. Esta metodologia de apego de peptídeo à superfície metálica é eficiente e relativamente barata e, portanto, pode ser aplicada para melhorar a biocompatibilidade de vários biomateriais metálicos.

As superfícies metálicas são renderizadas thiol-reativas para fixação de peptídeos através de uma série de modificações químicas, conforme ilustrado na Figura 1. A incubação pabt seguida pelo tratamento PEI-PDT torna a superfície metálica favorável ao acessório de peptídeo. Peptídeo CD47 (pepCD47) contendo resíduo de cisteína no C-terminus juntou-se à sequência pepCD47 do núcleo através de uma ponte AEEAc dupla flexível é covalentemente anexada às superfícies de ...

Watch this Scientific Journal Video about Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization at JoVE.com

Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

Apresentado aqui é um protocolo para anexar peptídeo CD47 (pepCD47) a stents metálicos usando química polifosfosfonato. A funcionalidade dos stents metálicos utilizando pepCD47 impede o apego e ativação de células inflamatórias, melhorando assim sua biocompatibilidade.

Mitigação do apego de células transmitidas sanguíneas a implantes metálicos através da imobilização de peptídeos derivados do CD47

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, ...

Este protocolo inclui uma nova estratégia química para anexar peptídeos terapêuticos a superfícies metálicas, e tem o potencial de melhorar a biocompatibilidade de uma ampla gama de biomateriais metálicos. Esta é uma técnica universal e robusta para anexar peptídeos e proteínas terapêuticas às superfícies metálicas nuas de bioimplants. Usamos essa tecnologia para melhorar a biocompatibilidade dos stents metálicos, anexando peptídeos CD47, a fim de evitar as respostas inflamatórias que são desencadeadas pelo stent.Comece lavando os cupons de papel alumínio de aço inoxidável ou discos de malha com 2 isopropanol em um agitador por cinco minutos. Faça esta lavagem duas vezes e depois lave as amostras duas vezes com clorofórmio por 10 minutos por lavagem. Coloque as amostras de aço inoxidável limpas em um forno a 220 graus Celsius por 30 minutos.Mergulhe as folhas assadas ou discos de malha em uma solução aquosa de PABT e incuba-as em um shaker por uma hora. Lave as amostras modificadas pelo PABT com água destilada desionizada cinco vezes. Transfira os espécimes para um novo frasco e repita as lavagens.Trate as amostras com TCEP por 15 minutos em temperatura ambiente em um agitador. Degas desionizou água destilada em um frasco fundo redondo com um dispositivo gerador de vácuo, como um liofilizador, e lavar as folhas ou discos de malha com a água desgassada cinco vezes. Transfira as amostras para um novo frasco e repita as lavagens.Prepare cinco mililitros de solução PEI-PDT de 1%, diluindo 212,5 microliters do estoque PEI-PDT e 125 microliters de 0,4 acetato de sódio molar na água desgaseada. Incubar as amostras de aço inoxidável lavadas com 1%PEI-PDT. Substitua o ar por gás argônio, sele os frascos herméticos e misture-os em um agitador por uma hora.Prossiga imediatamente com a conjugação do peptídeo ou armazene as amostras a quatro graus Celsius por até uma semana. Prepare um miligrama por mililitro solução de estoque cd47 de peptídeo humano dissolvendo o peptídeo humano CD47 em pó em ácido desgassed 50% acético, em seguida, prepare a solução de trabalho dissolvendo 500 microliters do estoque em 4,5 mililitros de PBS degassed. Incubar as amostras revestidas pei-PDT lavadas com a solução de trabalho do peptídeo CD47 à temperatura ambiente com agitação por uma hora.Quando terminar, lave as amostras revestidas de peptídeos CD47, conforme descrito no manuscrito do texto. Depois de revestir as folhas metálicas com peptídeo CD47 ou peptídeo mexido, corte tubos de PVC de 45 cm em três peças de 38 centímetros de comprimento e insira até oito peptídeos não modificados, ou peptídeos CD47 modificados em três tubos diferentes. Coletar 30 mililitros de sangue de doadores humanos saudáveis livres de quaisquer medicamentos anti-plaquetas, pré-carregar a seringa com um mililitro de 4% de citrato de sódio para evitar a coagulação do sangue coletado.Coloque 10 mililitros de sangue em cada tubo usando uma seringa de 10 mililitros e conecte as extremidades com adaptadores metálicos. Coloque os tubos cheios de sangue sobre as rodas do aparelho de loop Chandler e passe o sangue ao longo das folhas metálicas por rotação de roda a 37 graus Celsius por quatro horas. Escorra o sangue dos tubos e descarte-o de acordo com os requisitos do IRB, em seguida, corte os tubos com um bisturi para recuperar as folhas.Prepare 2% solução de glutaraldeído diluindo a solução de 70% no tampão de cacodilato de sódio com cloreto de sódio molar de 0,1. Incubar as folhas na solução de 2%glutaraldeído por 15 minutos e armazená-las a quatro graus Celsius durante a noite. Antes de analisar as folhas metálicas, lave-as três vezes com PBS.Aqueça oito mililitros de PBS em um banho de água de 37 graus Celsius. Prepare a solução de estoque de corante CFDA de 10 milimoslar adicionando 90 microliters de DMSO a um frasco CFDA e, em seguida, prepare a solução de trabalho adicionando 75 microliters do estoque CFDA ao PBS quente. Inverta o tubo algumas vezes para misturar e cobri-lo com papel alumínio.Coloque cada folha em um mililitro de corante CFDA em uma placa de 24 poços. Cubra a placa com papel alumínio e incuba a placa a 37 graus Celsius por 15 minutos, depois lave as folhas três vezes em PBS e exploda-as com um microscópio de fluorescência. A concentração do peptídeo conjugado TAMRA CD47 foi quantificada para determinar a densidade máxima de imobilização do peptídeo na superfície metálica.A retenção máxima de peptídeos foi de aproximadamente 180 nanogramas por centímetro quadrado, o que foi alcançado com uma concentração de entrada de 100 microgramas por mililitro. A imobilização do peptídeo conjugado TAMRA CD47 nas superfícies metálicas modificadas foi corroborada ainda mais pela microscopia de fluorescência, que mostrou uma fluorescência uniforme emitida da superfície dos discos de malha conjugados CD47 conjugados da TAMRA. Apenas fluorescência mínima foi detectada na superfície das malhas de controle que não tinham a modificação, excluindo assim um PEPTídeo conjugado TAMRA não especificamente ligado CD47 como a principal fonte de fluorescência.Também foi confirmado que as superfícies revestidas de peptídeos CD47 mostram uma redução drástica no apego celular transportado pelo sangue em comparação com os controles de peptídeos modificados e não modificados. Monócitos isolados das células de casaco de rato foram cultivados em papel alumínio nu e peptídeos CD47-modified steel folhas. Observou-se atenuação de 58% do apego agudo de monócitos, sua conversão a macrófagos e proliferação de macrófagos nas superfícies funcionalizadas.Ao tentar este protocolo, é muito importante realizar as etapas envolvendo água desgaseada ou reagentes a serem realizadas o mais rápido possível e minimizar a exposição ao oxigênio. Nossa tecnologia modula seletivamente a interação celular com superfícies metálicas e um ensaio típico de identificação do tipo celular, como RT-PCR, citometria de fluxo e imunofluorescência, são compatíveis com essa técnica. Quando desenvolvida para uma gama de peptídeos bioativos, essa tecnologia pode ser fundamental para aumentar a biocompatibilidade na interface do material tecidual.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs

Métodos de Desenvolvimento de Sangue Transporte Macrófago Borne de Nanoformulated medicamentos anti-retrovirais

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To ...

Bioengenharia

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

A imobilização de bactérias for Imaging por Microscopia de Força Atômica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Geração e recuperação de β-esferóides de células a partir do passo de crescimento-PEG-péptido Hidrogéis

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Graphene Coatings for Biomedical Implants

Revestimentos de grafeno para implantes biomédicos

Atomically smooth graphene as a surface coating has potential to improve implant properties. This demonstrates a method for coating nitinol alloys with ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Geração de Alinhados tecido funcional do miocárdio através de impressão microcontact

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention

Ferromagnético Bare Metal Stent para captura de células endoteliais e Retenção

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Wet Chemistry and Peptide Imobilização em Polytetrafluoroethylene para Melhoria de adesão celular

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Imobilização local-dirigido da Proteína morfogenética óssea 2 para superfícies sólidas pela química do clique

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Superfície-imobilização funcional dos Genes usando várias etapas Strand deslocamento litografia

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...