Name: mitigation of blood borne cell attachment to metal implants through cd47-derived peptide immobilization
Uploaded: 2020-12-03T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization at JoVE.com

El desarrollo de protocolos y los estudios presentados en este documento fueron apoyados por la financiación de NIH (NBIB) R01 (EB023921) a IF y SJS, y la financiación NIH (NHLBI) R01 (HL137762) a IF y RJL.

Todas las muestras humanas para este experimento se obtuvieron de acuerdo con el IRB del Hospital de Niños de Filadelfia. Todos los experimentos con animales se realizaron previa aprobación de la IACUC del Hospital Infantil de Filadelfia.
1. Recubrimiento de superficies metálicas desnudas con PEI-PDT
<ol><li>Lavar los cupones de papel de aluminio de acero inoxidable (1 cm x 1 cm o 0,65 cm x 1 cm) o discos de malla de acero inoxidable con 2-isopropanol en una coctelera (60...

<ol>
	<li>Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+managing+in-stent+restenosis:+a+review+of+clinical+data,+from+pathogenesis+to+treatment.">Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment.</a> Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).</li><li>van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacles+in+haemocompatibility+testing.">Obstacles in haemocompatibility testing.</a> Scientifica. 2013, 392584 (2013).</li><li>Mitra, A. K., Agrawal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+stent+restenosis:+bane+of+the+stent+era.">In stent restenosis: bane of the stent era.</a> Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).</li><li>Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+stents:+historical+development,+current+status+and+future+directions.">Coronary stents: historical development, current status and future directions.</a> British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).</li><li>Hoffmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+and+mechanisms+of+in-stent+restenosis.+A+serial+intravascular+ultrasound+study.">Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study.</a> Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).</li><li>Stefanini, G. G., Windecker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stent+thrombosis:+no+longer+an+issue+with+newer-generation+drug-eluting+stents.">Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents.</a> Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).</li><li>Palmerini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+with+bioabsorbable+polymer-+versus+durable+polymer-based+drug-eluting+and+bare-metal+stents:+evidence+from+a+comprehensive+network+meta-analysis.">Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).</li><li>Omar, W. A., Kumbhani, D. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+CD47-modified+biomaterials+to+mitigate+the+immune+response.">The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response.</a> Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).</li><li>Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self+inhibition+of+phagocytosis:+the+affinity+of+'marker+of+self'+CD47+for+SIRPalpha+dictates+potency+of+inhibition+but+only+at+low+expression+levels.">Self inhibition of phagocytosis: the affinity of 'marker of self' CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).</li><li>Slee, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+biocompatibility+of+CD47-functionalized+vascular+stents.">Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents.</a> Biomaterials. 87, 82-92 (2016).</li><li>Finley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+and+activation+of+platelets+and+neutrophils+with+CD47+functionalized+blood+contacting+surfaces.">Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces.</a> Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).</li><li>Stachelek, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+CD47+modified+polymer+surfaces+on+inflammatory+cell+attachment+and+activation.">The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation.</a> Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).</li><li>Inamdar, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+bioactivity+of+pepCD47+attachment+on+stainless+steel+surfaces.">Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces.</a> Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).</li><li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+delivery+of+gene+vectors+from+bare-metal+stents+by+use+of+a+biodegradable+synthetic+complex+inhibits+in-stent+restenosis+in+rat+carotid+arteries.">Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries.</a> Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).</li><li>Moser, K. V., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+rat+monocytes+migrate+through+a+BCEC-monolayer+and+express+microglia-markers+at+the+basolateral+side.">Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side.</a> Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).</li><li>vander Giessen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marked+inflammatory+sequelae+to+implantation+of+biodegradable+and+nonbiodegradable+polymers+in+porcine+coronary+arteries.">Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries.</a> Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).</li><li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphosphonate-mediated+gene+vector+delivery+from+the+metal+surfaces+of+stents.">Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).</li><li>Mouro-Chanteloup, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+red+cell+skeleton+protein+4.2+interacts+with+the+Rh+membrane+complex+member+CD47.">Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47.</a> Blood. 101 (1), 338-344 (2003).</li><li>Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+signaling+mechanisms+associated+with+CD47+modified+surfaces.">Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces.</a> Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).</li><li>Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+the+ex+vivo+Chandler+Loop+Apparatus+to+assess+the+biocompatibility+of+modified+polymeric+blood+conduits.">The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).</li></ol>

Demostramos y describimos una estrategia química relativamente novedosa para anexar mitades de péptidos terapéuticos a una superficie de acero inoxidable con el objetivo general de reducir la reactividad de la superficie con las células inflamatorias que se encuentran en la sangre. La química del bisfosfonato descrita en el presente documento implica la formación coordinada de unión entre los óxidos metálicos y los grupos de bisfosfonato de PABT. El espesor de la monocapa de polibisfosfonato formado en la superf...

La intervención coronaria percutánea es la primera línea de terapia para tratar las enfermedades de las arterias coronarias (CAD) y consiste principalmente en stentar las arterias enfermas. Sin embargo, la restenosis in-stent (ISR) y la trombosis de stent son complicaciones comunes asociadas con el despliegue de stent1. La interacción sanguínea en la interfaz de la sangre-stent se caracteriza por una adsorción casi inmediata de proteínas plasmáticas en la superficie metálica, seguida de la unión plaquetaria y celular inflamatoria y la activación2. La liberación de las citoquinas inflamatorias y quimioquinas de las células inflamatorias activadas conduce a la modificación fenotípica de las células musculares lisas vasculares (VSMC) en los medios de la túnica y desencadena su migración centrípeta al compartimento intimal. La proliferación de VSMC activado en la intima da como resultado un engrosamiento de la capa intimal, estrechamiento de lúmenes y restenosis in-stent3. Se desarrollaron stents de elución de fármacos (DES) para prevenir la proliferación de VSMC; sin embargo, estos medicamentos tienen un efecto citotóxico fuera de la diana en las células endoteliales4,5. Por lo tanto, la trombosis tardía del stent es una complicación común asociada con DES6,,7. Los stents hechos de polímeros biodegradables, como el poli-L-lactide han demostrado mucha promesa en los experimentos con animales y los ensayos clínicos iniciales, pero finalmente fueron recordados cuando el uso clínico "de la vida real" demostró su inferioridad a la3a generación DES8. Por lo tanto, es necesario mejorar la biocompatibilidad de los stents de metal desnudo para obtener mejores resultados para los pacientes.
CD47 es una proteína transmembrana expresada omnipresentemente que inhibe la respuesta inmune innata cuando se une a su receptor cognado Signal Regulatory Protein alpha (SIRP)9. El receptor SIRP tiene un dominio de motivo inhibitorio de tirosina de células inmunitarias (ITIM) y los eventos de señalización en la interacción SIRP - CD47 resultan en última instancia en la regulación descendente de la activación celular inflamatoria10,11,12,13. La investigación en nuestro laboratorio ha demostrado que el CD47 recombinante o su derivado del péptido, correspondiente al dominio Ig de 22 aminoácidos de la región extracelular de CD47 (pepCD47), puede reducir la respuesta inmune del huésped a una gama de biomateriales clínicamente relevantes14,,15,,16. Recientemente, hemos demostrado que el pepCD47 puede ser inmovilizado a superficies de acero inoxidable y reducir significativamente la respuesta fisiopatológica asociada con la restenosis. Cabe destacar que las superficies modificadas pepCD47 son susceptibles a las condiciones de uso pertinentes, como el almacenamiento a largo plazo y la esterilización con óxido de etileno17. Con ese fin, pepCD47 puede ser una diana terapéutica útil para abordar las limitaciones clínicas de los stents endovasculares.
La estrategia para la fijación covalente de pepCD47 a una superficie metálica implica una serie de modificaciones químicas novedosas de la superficie metálica. Las superficies metálicas se recubren primero con bisfosfonato de poliallamina con grupos de tiol latentes (PABT) seguidos de la desprotección de los tioles y la unión de polietilenoimina (PEI) con grupos de piridilditioo instalados (PDT). Los grupos PDT de PEI no especificados en la reacción con tioles PABT desprotegidos reaccionan con pepCD47 incorporando tioles en los residuos terminales de cisteína, lo que resulta en la unión de pepCD47 a la superficie metálica a través de un enlace de disulfuro14,17,18. Utilizamos un fluoróforo conjugado pepCD47 (TAMRA-pepCD47) para determinar la concentración de entrada de péptido que resulta en la máxima inmovilización superficial del péptido. Finalmente, evaluamos la capacidad antiinflamatoria aguda y crónica de las superficies metálicas recubiertas de pepCD47, ex vivo, utilizando el aparato de bucle Chandler, y el ensayo de expansión de apego/macrofago de monocitos, respectivamente.
Este documento proporciona un protocolo sistemático para la fijación de péptidos tiolados a la superficie metálica; determinar la densidad máxima de inmovilización del péptido; y evaluar las propiedades antiinflamatorias de las superficies metálicas recubiertas de pepCD47 expuestas a sangre entera y monocitos aislados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:834px;" width="833">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">1 M Tris-HCL</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">15567-027</td>
			<td style="width:239px;">pH - 7.5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">4% Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:184px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">16539-07</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">4% Sodium Citrate</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:129px;">S5770</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">ACK lysing buffer</td>
			<td style="width:184px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">118-156-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">202301</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">203501</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52)</td>
			<td style="width:184px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:129px;">550979</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1)</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:129px;">MCA341</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">201701</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Chloroform Certified ACS</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Dimethyl Formammide (DMF)</td>
			<td style="width:184px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:129px;">39117</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Embra stainless steel grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">E200-SS</td>
			<td>stainless steel mesh mesh disks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Ficoll Hypaque</td>
			<td style="width:184px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:129px;">17-1440-02</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:184px;">ACROS organic</td>
			<td style="width:129px;">148930025</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">goat anti-mouse IgG Alexa Fluor</td>
			<td style="width:184px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:129px;">A11030</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:184px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:129px;">402-01</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human pepCD47</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4099101</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">A426P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Metal adapters</td>
			<td style="width:184px;">Leur Fitting</td>
			<td style="width:129px;">6515IND</td>
			<td style="width:239px;">1 way adapter 316 ss 1/4&#34;-5/16&#34; hoes end</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Methanol</td>
			<td style="width:184px;">RICCA chemical company</td>
			<td style="width:129px;">4829-32</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Microscope</td>
			<td style="width:184px;">Nikon Eclipse</td>
			<td style="width:129px;">TE300</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pottasium Bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">P184-500</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">PVC tubes</td>
			<td style="width:184px;">Terumo-CVS</td>
			<td style="width:129px;">60050</td>
			<td style="width:239px;">1/4&#34; X 1/16 8&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride</td>
			<td style="width:184px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">11653</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:184px;">Bio-Rad laboratories</td>
			<td style="width:129px;">161-0302</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Sodum actetate (C2H3NaO2)</td>
			<td style="width:184px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:129px;">A13184</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Src peptide</td>
			<td>Bachem</td>
			<td style="width:129px;">4092599</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen</td>
			<td>Microgroup, Medway, MA</td>
			<td style="width:129px;">20097328</td>
			<td>1 cm X 6 mm OD</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Stainless steel foils (AISI 316L)</td>
			<td style="width:184px;">Goodfellow, Coraopolis, PA</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:239px;">100 mm X 100 mm X 0.05 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47)</td>
			<td>Bachem</td>
			<td style="width:129px;">4100277</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:282px;">TMB (3,3&#8217; ,5,5&#8217; -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PG82089</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Tween-20</td>
			<td style="width:184px;">Bio-Rad laboratories</td>
			<td style="width:129px;">170-6531</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">V12883</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitigation of blood borne cell attachment to metal implants through cd47-derived peptide immobilization

Las complicaciones clave asociadas con los stents de metal desnudo y los stents eluyentes de fármacos son la restenosis en stent y la trombosis tardía del stent, respectivamente. Por lo tanto, la mejora de la biocompatibilidad de los stents metálicos sigue siendo un desafío importante. El objetivo de este protocolo es describir una técnica robusta de modificación de la superficie metálica mediante péptidos biológicamente activos para aumentar la biocompatibilidad de los implantes médicos que contactan con la sangre, incluidos los stents endovasculares. CD47 es un marcador inmunológico específico de especies de sí mismo y tiene propiedades antiinflamatorias. Los estudios han demostrado que un péptido de 22 aminoácidos correspondiente al dominio Ig de CD47 en la región extracelular (pepCD47), tiene propiedades antiinflamatorias como la proteína de longitud completa. Estudios in vivo en ratas, y estudios ex vivo en sistemas experimentales de sangre humana y conejo de nuestro laboratorio han demostrado que la inmovilización pepCD47 en metales mejora su biocompatibilidad al prevenir la unión y activación de células inflamatorias. Este artículo describe el protocolo paso a paso para la funcionalización de superficies metálicas y fijación de péptidos. Las superficies metálicas se modifican utilizando bisfosfato de poliallamina con grupos de tiol latentes (PABT) seguidos de desprotección de tioles y amplificación de sitios tiol-reactivos a través de la reacción con polietilenimina instalada con grupos de piridildithio (PEI-PDT). Por último, pepCD47, que incorpora residuos terminales de cisteína conectados a la secuencia de péptidos del núcleo a través de un espaciador dual 8-amino-3,6-dioxa-octanoyl, se unen a la superficie metálica a través de enlaces de disulfuro. Esta metodología de fijación de péptidos a la superficie metálica es eficiente y relativamente económica y, por lo tanto, se puede aplicar para mejorar la biocompatibilidad de varios biomateriales metálicos.

Las superficies metálicas se vuelven tiol-reactivas para la fijación de péptidos a través de una serie de modificaciones químicas, como se ilustra en la Figura 1. La incubación PABT seguida del tratamiento PEI-PDT hace que la superficie metálica sea susceptible de fijación de péptidos. El péptido CD47 (pepCD47) que contiene residuos de cisteína en C-terminus unidos a la secuencia pepCD47 del núcleo a través de un puente AEEAc dual flexible se une covalentemente a las superficies...

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Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

Aquí se presenta un protocolo para añadir péptido CD47 (pepCD47) a stents metálicos utilizando la química de polibisfosfonato. La funcionalización de los stents metálicos mediante pepCD47 evita la unión y activación de las células inflamatorias mejorando así su biocompatibilidad.

Mitigación de la fijación de células de flujo sanguíneo a implantes metálicos a través de la inmovilización de péptidos derivados de CD47

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, ...

Este protocolo incluye una novedosa estrategia química para añadir péptidos terapéuticos a superficies metálicas, y tiene el potencial de mejorar la biocompatibilidad de una amplia gama de biomateriales metálicos. Esta es una técnica universal y robusta para añadir péptidos y proteínas terapéuticas a las superficies metálicas desnudas de los bioimplantes. Hemos utilizado esta tecnología para mejorar la biocompatibilidad de los stents metálicos añadiendo péptidos CD47 con el fin de prevenir las respuestas de inflamación que se desencadenan por el stent.Comience lavando los cupones de papel de aluminio inoxidable o discos de malla con 2-isopropanol en una coctelera durante cinco minutos. Realice este lavado dos veces y luego lave las muestras dos veces con cloroformo durante 10 minutos por lavado. Coloque las muestras de acero inoxidable limpias en un horno a 220 grados Celsius durante 30 minutos.Sumerja las láminas horneadas o los discos de malla en una solución acuosa del 0,5% de PABT y escóndalas en una coctelera durante una hora. Lave las muestras modificadas por PABT con agua destilada desionizada cinco veces. Transfiera las muestras a un vial nuevo y repita los lavados.Tratar las muestras con TCEP durante 15 minutos a temperatura ambiente en una coctelera. Desgasaizó el agua destilada en un matraz de fondo redondo con un dispositivo generador de vacío, como un liofilizador, y lave las láminas o discos de malla con el agua desgasificada cinco veces. Transfiera las muestras a un vial nuevo y repita los lavados.Preparar cinco mililitros de solución 1%PEI-PDT diluyendo 212,5 microlitros de la población PEI-PDT y 125 microlitros de 0,4 molar de acetato de sodio en el agua desgasal. Incubar las muestras de acero inoxidable lavadas con 1%PEI-PDT. Reemplace el aire con gas de argón, selle los viales herméticos y mezcle en una coctelera durante una hora.Proceda inmediatamente con la conjugación del péptido o almacene las muestras en cuatro grados Celsius durante un máximo de una semana. Preparar un miligramo por mililitro de solución de péptido humano CD47 disolviendo el péptido humano CD47 polvo en ácido acético desgasificación 50%, luego preparar la solución de trabajo disolviendo 500 microlitros de la acción en 4.5 mililitros de PBS desgased. Incubar las muestras lavadas con PEI-PDT con la solución de trabajo del péptido CD47 a temperatura ambiente con agitación durante una hora.Cuando haya terminado, lave las muestras recubiertas con péptido CD47 como se describe en el manuscrito de texto. Después de recubrir las láminas de metal con péptido CD47 o péptido revuelto, corte tubos de PVC de cuarto de pulgada en tres piezas de 38 centímetros de largo e inserte hasta ocho láminas metálicas no modificadas, péptidos revueltos o péptidos cd47, en tres tubos diferentes. Recoger 30 mililitros de sangre de donantes humanos sanos libres de cualquier medicamento antiplaquetario, precargando la jeringa con un mililitro de 4%citrato de sodio para evitar la coagulación de la sangre recogida.Coloque 10 mililitros de sangre en cada tubo con una jeringa de 10 mililitros y conecte los extremos con adaptadores metálicos. Coloque los tubos llenos de sangre en las ruedas del aparato de bucle Chandler y pase la sangre a lo largo de las láminas metálicas por rotación de la rueda a 37 grados Celsius durante cuatro horas. Escurra la sangre de los tubos y deséchela de acuerdo con los requisitos de la IRB, luego corte los tubos con un bisturí para recuperar las láminas.Preparar una solución de glutaraldehído al 2%mediante la dilución de la solución del 70% en tampón de cacodilato sódico con cloruro de sodio molar 0,1. Incubar las láminas en la solución de glutaraldehído al 2% durante 15 minutos y almacenarlas a cuatro grados centígrados durante la noche. Antes de analizar las láminas metálicas, lávelas tres veces con PBS.Caliente ocho mililitros de PBS en un baño de agua de 37 grados Centígrados. Preparar 10 solución de material de tinte CFDA milimio añadiendo 90 microlitros de DMSO a un vial CFDA, luego prepare la solución de trabajo agregando 75 microlitros de la acción CFDA al PBS caliente. Invierta el tubo un par de veces para mezclarlo y cubrirlo con papel de aluminio.Coloque cada lámina en un mililitro de tinte CFDA en una placa de 24 pozos. Cubra la placa con papel de aluminio e incubar la placa a 37 grados Celsius durante 15 minutos, luego lave las láminas tres veces en PBS e pídalas con un microscopio de fluorescencia. La concentración de péptido conjugado TAMRA unido covalentemente CD47 se cuantificó para determinar la densidad máxima de inmovilización del péptido en la superficie metálica.La retención máxima de péptidos fue de aproximadamente 180 nanogramos por centímetro cuadrado, lo que se logró con una concentración de entrada de 100 microgramos por mililitro. La inmovilización del péptido conjugado TAMRA CD47 en las superficies metálicas modificadas fue corroborada por microscopía de fluorescencia, que mostró una fluorescencia uniforme emitida desde la superficie de los discos de malla conjugados con péptidos conjugados TAMRA CD47. Sólo se detectó una fluorescencia mínima en la superficie de las mallas de control que carecía de la modificación, excluyendo así un péptido conjugado TAMRA no específicamente enlazado CD47 como la principal fuente de fluorescencia.También se confirmó que las superficies recubiertas de péptido CD47 muestran una reducción drástica en la fijación celular transmitida por la sangre en comparación con los controles de péptido modificados y no modificados revueltos. Los monocitos aislados de las células de la capa de rata se cultivaron en láminas de acero inoxidable modificadas en metal desnudo y péptidos CD47. Se observó una atenuación del 58% de la unión aguda de monocitos, su conversión a macrófagos y la proliferación de macrófagos en las superficies funcionalizadas.Al intentar este protocolo, es muy importante realizar los pasos que implican agua desgasificación o reactivos que se realizarán lo más rápido posible y minimizar la exposición al oxígeno. Nuestra tecnología modula selectivamente la interacción celular con superficies metálicas y un ensayo típico de identificación de tipo celular, como RT-PCR, citometría de flujo e inmunofluorescencia, son compatibles con esta técnica. Cuando se desarrolla para una gama de péptidos bioactivos, esta tecnología puede ser fundamental para aumentar la biocompatibilidad en la interfaz del material tisular.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs

Métodos de desarrollo para el transporte de macrófagos transmitidas por la sangre de los medicamentos antirretrovirales Nanoformulated

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To ...

Investigación

Bioingeniería

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Inmovilización de bacterias para tratamiento de imágenes de microscopía de fuerza atómica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of &#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generación y Recuperación de β-células esferoides de PEG-péptido de crecimiento Paso hidrogeles

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Graphene Coatings for Biomedical Implants

Revestimientos de grafeno para Implantes Biomédicos

Atomically smooth graphene as a surface coating has potential to improve implant properties. This demonstrates a method for coating nitinol alloys with ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Generación de tejido funcional del miocardio Alineados través de la impresión por microcontacto

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Método mejorado para la preparación de una base de células, Contacto Modelo Humano de la barrera hematoencefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention

Ferromagnético Bare Metal stent para la captura de la célula endotelial y Retención

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Química húmeda y el péptido Inmovilización de politetrafluoroetileno para la adhesión celular mejorada

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Dirigida la inmovilización de la proteína ósea morfogenética 2 a superficies sólidas por química del tecleo

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Superficie-Inmovilización funcional de Genes utilizando litografía de desplazamiento de varias fases de la cadena

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...