Name: mitigation of blood borne cell attachment to metal implants through cd47-derived peptide immobilization
Uploaded: 2020-12-03T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization at JoVE.com

Protokollutveckling och studier som presenterades i detta dokument stöddes av NIH (NBIB) R01 finansiering (# EB023921) till IF och SJS, och NIH (NHLBI) R01 finansiering (# HL137762) till IF och RJL.

Alla mänskliga prover för detta experiment erhölls i enlighet med IRB av Children's Hospital of Philadelphia. Alla djurförsök utfördes efter godkännande från IACUC av Children's Hospital of Philadelphia.
1. Beläggning av kala metallytor med PEI-PDT
<ol><li>Tvätta de rostfria foliekupongerna (1 cm x 1 cm eller 0,65 cm x 1 cm) eller nätskivor i rostfritt stål med 2-isopropanol i en shaker (60 °C, hastighet på 200 varv/min) i 5 min. Utför detta steg 2x. Tvätta s...

<ol>
	<li>Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+managing+in-stent+restenosis:+a+review+of+clinical+data,+from+pathogenesis+to+treatment.">Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment.</a> Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).</li><li>van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacles+in+haemocompatibility+testing.">Obstacles in haemocompatibility testing.</a> Scientifica. 2013, 392584 (2013).</li><li>Mitra, A. K., Agrawal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+stent+restenosis:+bane+of+the+stent+era.">In stent restenosis: bane of the stent era.</a> Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).</li><li>Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+stents:+historical+development,+current+status+and+future+directions.">Coronary stents: historical development, current status and future directions.</a> British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).</li><li>Hoffmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+and+mechanisms+of+in-stent+restenosis.+A+serial+intravascular+ultrasound+study.">Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study.</a> Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).</li><li>Stefanini, G. G., Windecker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stent+thrombosis:+no+longer+an+issue+with+newer-generation+drug-eluting+stents.">Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents.</a> Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).</li><li>Palmerini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+with+bioabsorbable+polymer-+versus+durable+polymer-based+drug-eluting+and+bare-metal+stents:+evidence+from+a+comprehensive+network+meta-analysis.">Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).</li><li>Omar, W. A., Kumbhani, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Current+Literature+on+Bioabsorbable+Stents:+a+Review.">The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review.</a> Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).</li><li>Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+the+Inflammatory+Response+to+Clinically+Relevant+Polymers+by+Manipulating+the+Host+Response+Using+ITIM+Domain-Containing+Receptors.">Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors.</a> Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).</li><li>Oldenborg, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD47+as+a+marker+of+self+on+red+blood+cells.">Role of CD47 as a marker of self on red blood cells.</a> Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).</li><li>vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+'self'+recognition:+a+role+for+CD47-SIRPalpha+interactions+in+hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation.</a> Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).</li><li>Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+CD47-modified+biomaterials+to+mitigate+the+immune+response.">The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response.</a> Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).</li><li>Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self+inhibition+of+phagocytosis:+the+affinity+of+'marker+of+self'+CD47+for+SIRPalpha+dictates+potency+of+inhibition+but+only+at+low+expression+levels.">Self inhibition of phagocytosis: the affinity of 'marker of self' CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).</li><li>Slee, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+biocompatibility+of+CD47-functionalized+vascular+stents.">Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents.</a> Biomaterials. 87, 82-92 (2016).</li><li>Finley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+and+activation+of+platelets+and+neutrophils+with+CD47+functionalized+blood+contacting+surfaces.">Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces.</a> Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).</li><li>Stachelek, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+CD47+modified+polymer+surfaces+on+inflammatory+cell+attachment+and+activation.">The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation.</a> Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).</li><li>Inamdar, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+bioactivity+of+pepCD47+attachment+on+stainless+steel+surfaces.">Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces.</a> Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).</li><li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+delivery+of+gene+vectors+from+bare-metal+stents+by+use+of+a+biodegradable+synthetic+complex+inhibits+in-stent+restenosis+in+rat+carotid+arteries.">Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries.</a> Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).</li><li>Moser, K. V., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+rat+monocytes+migrate+through+a+BCEC-monolayer+and+express+microglia-markers+at+the+basolateral+side.">Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side.</a> Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).</li><li>vander Giessen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marked+inflammatory+sequelae+to+implantation+of+biodegradable+and+nonbiodegradable+polymers+in+porcine+coronary+arteries.">Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries.</a> Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).</li><li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphosphonate-mediated+gene+vector+delivery+from+the+metal+surfaces+of+stents.">Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).</li><li>Mouro-Chanteloup, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+red+cell+skeleton+protein+4.2+interacts+with+the+Rh+membrane+complex+member+CD47.">Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47.</a> Blood. 101 (1), 338-344 (2003).</li><li>Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+signaling+mechanisms+associated+with+CD47+modified+surfaces.">Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces.</a> Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).</li><li>Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+the+ex+vivo+Chandler+Loop+Apparatus+to+assess+the+biocompatibility+of+modified+polymeric+blood+conduits.">The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).</li></ol>

Vi demonstrerar och beskriver en relativt ny kemisk strategi för att lägga till terapeutisk peptid moieties till en rostfri yta med det övergripande målet att minska ytans reaktivitet med inflammatoriska celler som finns i blodet. Bisfosfonatkemin som beskrivs häri innebär att man koordinerar bindningsbildning mellan metalloxiderna och bisfosfonatgrupperna av PABT. Tjockleken på polybisfosfonat monolayer bildas på metallyta inte överstiger 5 nm18, och, därför, är oviktiga för de poten...

Perkutan koronar intervention är den första raden av terapi för att behandla kranskärlssjukdomar (CAD) och i första hand innebär stenting de sjuka artärerna. Däremot är in-stent restenosis (ISR) och stent trombos vanliga komplikationer i samband med stent utplacering1. Blodinteraktion vid blod-stent-gränssnittet kännetecknas av en nästan omedelbar adsorption av plasmaproteiner på metallyta, följt av trombocyt och inflammatorisk celltillsats ochaktivering 2. Frisättningen av de inflammatoriska cytokinerna och kemokineerna från aktiverade inflammatoriska celler leder till den fenotypiska modifieringen av de vaskulära glattmuskelcellerna (VSMCs) i tunicamedierna och utlöser deras centrilamalmigration till intimalfacket. Spridning av aktiverad VSMC i intimiteten resulterar i intimalskikt förtjockning, lumen förträngning och i-stent restenosis3. Drug eluing stents (DES) utvecklades för att förhindra VSMC spridning; dessa läkemedel har dock en cytotoxisk effekt utanför målgruppen på de endotelceller4,5. Därför är sen stenttrombos en vanlig komplikation som är associerad med DES6,7. Stent av biologiskt nedbrytbara polymerer, såsom poly-L-laktid har visat mycket lovande i djurförsök och inledande kliniska prövningar, men så småningom återkallades när "verkliga" kliniska användningen visat sin underlägsenhet till 3rd generation DES8. Därför finns det ett behov av att förbättra biokompatibiliteten hos nakna metallstent för bättre patientresultat.
CD47 är ett allestädes närvarande uttryckt transmembran protein som hämmar det medfödda immunsvaret när det är bundet till dess kongnatre receptor Signal Regulatory Protein alpha (SIRPα)9. SIRPα-receptorn har en immuncellstyrosinhämmande motiv (ITIM) domän och signalhändelserna vid SIRPα - CD47-interaktionen resulterar i slutändan i nedreglering av inflammatoriskcellaktivering 10,11,12,13. Forskning i vårt labb har visat att rekombinanta CD47 eller dess peptidderivat, motsvarande 22 aminosyra Ig domän av extracellulära regionen CD47 (pepCD47), kan minska värd immunsvaret till en rad kliniskt relevanta biomaterial14,15,16. Nyligen har vi visat att pepCD47 kan immobiliseras till rostfritt stål stent ytor och avsevärt minska det patofysiologiska svaret i samband med restenosis. Att notera, de pepCD47 modifierade ytorna är mottagliga för relevanta användningsförhållanden såsom långtidslagring och etylenoxidsterilisering17. För detta ändamål kan pepCD47 vara ett användbart terapeutiskt mål att ta itu med de kliniska begränsningarna av endovaskulära stent.
Strategin för kovalent fastsättning av pepCD47 till en metallyta innebär en serie nya kemiska modifieringar av metallytan. Metalytorna belagda först med polyallaminbisfosfonat med latent tiolsgrupper (PABT) följt av deprotection av tiolerorna och fastsättning av polyetenimin (PEI) med installerade pyridyldithiogrupper (PDT). PDT grupper av PEI unconsumed i reaktionen med deprotected PABT tioler sedan reageras med pepCD47 införliva thiols i terminalen cystein rester, vilket resulterar i bindande pepCD47 till metallytan via en disulfid bond14,17,18. Vi använde en fluorophore konjugerad pepCD47 (TAMRA-pepCD47) för att bestämma ingångskoncentrationen av peptid som resulterar i den maximala ytan immobilisering av peptiden. Slutligen utvärderade vi den akuta och kroniska antiinflammatoriska kapaciteten hos pepCD47 belagda metallytor, ex vivo, med hjälp av Chandler loop apparaten och monocyt fastsättning/makrofag expansion assay, respektive.
Detta papper ger ett systematiskt protokoll för fastsättning av tiolerat peptider till metallyta; bestämmande av peptidens maximala immobiliseringsdensitet; och bedöma de antiinflammatoriska egenskaperna hos pepCD47 belagda metallytor som utsätts för helblod och isolerade monocyter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:834px;" width="833">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">1 M Tris-HCL</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">15567-027</td>
			<td style="width:239px;">pH - 7.5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">4% Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:184px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">16539-07</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">4% Sodium Citrate</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:129px;">S5770</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">ACK lysing buffer</td>
			<td style="width:184px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">118-156-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">202301</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">203501</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52)</td>
			<td style="width:184px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:129px;">550979</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1)</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:129px;">MCA341</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">201701</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Chloroform Certified ACS</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Dimethyl Formammide (DMF)</td>
			<td style="width:184px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:129px;">39117</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Embra stainless steel grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">E200-SS</td>
			<td>stainless steel mesh mesh disks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Ficoll Hypaque</td>
			<td style="width:184px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:129px;">17-1440-02</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:184px;">ACROS organic</td>
			<td style="width:129px;">148930025</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">goat anti-mouse IgG Alexa Fluor</td>
			<td style="width:184px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:129px;">A11030</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:184px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:129px;">402-01</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human pepCD47</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4099101</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">A426P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Metal adapters</td>
			<td style="width:184px;">Leur Fitting</td>
			<td style="width:129px;">6515IND</td>
			<td style="width:239px;">1 way adapter 316 ss 1/4&#34;-5/16&#34; hoes end</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Methanol</td>
			<td style="width:184px;">RICCA chemical company</td>
			<td style="width:129px;">4829-32</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Microscope</td>
			<td style="width:184px;">Nikon Eclipse</td>
			<td style="width:129px;">TE300</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pottasium Bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">P184-500</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">PVC tubes</td>
			<td style="width:184px;">Terumo-CVS</td>
			<td style="width:129px;">60050</td>
			<td style="width:239px;">1/4&#34; X 1/16 8&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride</td>
			<td style="width:184px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">11653</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:184px;">Bio-Rad laboratories</td>
			<td style="width:129px;">161-0302</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Sodum actetate (C2H3NaO2)</td>
			<td style="width:184px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:129px;">A13184</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Src peptide</td>
			<td>Bachem</td>
			<td style="width:129px;">4092599</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen</td>
			<td>Microgroup, Medway, MA</td>
			<td style="width:129px;">20097328</td>
			<td>1 cm X 6 mm OD</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Stainless steel foils (AISI 316L)</td>
			<td style="width:184px;">Goodfellow, Coraopolis, PA</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:239px;">100 mm X 100 mm X 0.05 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47)</td>
			<td>Bachem</td>
			<td style="width:129px;">4100277</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:282px;">TMB (3,3&#8217; ,5,5&#8217; -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PG82089</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Tween-20</td>
			<td style="width:184px;">Bio-Rad laboratories</td>
			<td style="width:129px;">170-6531</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">V12883</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitigation of blood borne cell attachment to metal implants through cd47-derived peptide immobilization

De viktigaste komplikationerna som är associerade med bare metal stent och drog elusing stents är i-stent restenosis och sen stent blodpropp, respektive. Således är förbättring av biokompatibiliteten för metallstent fortfarande en betydande utmaning. Målet med detta protokoll är att beskriva en robust teknik för metall ytmodifiering av biologiskt aktiva peptider för att öka biokompatibiliteten hos blod som kontaktar medicinska implantat, inklusive endovaskulära stent. CD47 är en immunologisk artspecifik markör för själv och har antiinflammatoriska egenskaper. Studier har visat att en 22 aminosyra peptid som motsvarar Ig domän av CD47 i extracellulära regionen (pepCD47), har antiinflammatoriska egenskaper som den fullängds protein. In vivo studier på råttor, och ex vivo studier i kanin och mänskliga blod experimentella system från vårt labb har visat att pepCD47 immobilisering på metaller förbättrar deras biokompatibilitet genom att förhindra inflammatoriska cell fastsättning och aktivering. Detta papper beskriver steg-för-steg-protokollet för funktionalisering av metallytor och peptidtillsats. Metallytorna modifieras med hjälp av polyallaminbisfosfat med latent tiolgrupper (PABT) följt av deprotection av tioler och förstärkning av tioolreaktiva ställen via reaktion med polyetenylenimin installerad med pyridyldithio-grupper (PEI-PDT). Slutligen, pepCD47, som innehåller terminal cystein rester ansluten till kärnan peptidsekvens genom en dubbel 8-amino-3,6-dioxa-octanoyl spacer, är knutna till metallytan via disulfid obligationer. Denna metodik av peptid fastsättning till metallyta är effektiv och relativt billig och kan därmed tillämpas för att förbättra biokompatibiliteten hos flera metalliska biomaterial.

Metalytorna återges tioolreaktiv för peptidtillsats via en serie kemiska modifieringar, vilket illustreras i figur 1. PABT inkubation följt av PEI-PDT behandling gör metallytan mottaglig för peptid fastsättning. Peptid CD47 (pepCD47) som innehåller cystein rester vid C-terminus förenade till kärnan pepCD47 sekvens genom en flexibel dubbla AEEAc bro är kovalent fäst på de thiol-reaktiva ytor via disulfid obligationer. Med hjälp av detta protokoll har vi visat att pepCD47 förblir...

Watch this Scientific Journal Video about Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization at JoVE.com

Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

Presenteras här är ett protokoll för appending peptid CD47 (pepCD47) till metall stent med hjälp av polybisfosfonat kemi. Funktionalisering av metallstent med hjälp av pepCD47 förhindrar fastsättning och aktivering av inflammatoriska celler därmed förbättra deras biokompatibilitet.

Lindring av blodburna cellen bilaga till metallimplantat genom CD47-derived Peptide Immobilization

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, ...

Detta protokoll innehåller en ny kemisk strategi för att lägga terapeutiska peptider till metalliska ytor, och har potential att förbättra biokompatibiliteten hos ett brett spektrum av metalliska biomaterial. Detta är en universell och robust teknik för att lägga till peptider och terapeutiska proteiner till de nakna metallytorna hos bioimplantat. Vi har använt denna teknik för att förbättra biokompatibiliteten hos metalliska stent genom att appending CD47 peptider för att förhindra inflammation svar som utlöses av stenting.Börja med att tvätta den rostfria folie kuponger eller mesh skivor med 2-isopropanol i en shaker i fem minuter. Utför denna tvätt två gånger, sedan tvätta proverna två gånger med kloroform i 10 minuter per tvätt. Placera de rengjorda rostfria proverna i en ugn på 220 grader Celsius i 30 minuter.Sänk ned de bakade folierna eller nätskivorna i 0,5 %vattenlösning av PABT och inkubera dem i en skakmaskin i en timme. Tvätta de PABT-modifierade proverna med avjoniserat destillerat vatten fem gånger. Överför exemplaren till en ny injektionsflaska och upprepa tvättarna.Behandla proverna med TCEP i 15 minuter vid rumstemperatur på en skakser. Avgaser avjoniserat destillerat vatten i en rund bottenkolv med en vakuumalstrande anordning, till exempel en lyofilat, och tvätta folierna eller nätskivorna med det avgasade vattnet fem gånger. Överför proverna till en ny injektionsflaska och upprepa tvättar.Bered fem milliliter av 1%PEI-PDT-lösning genom att späda 212,5 mikroliter av beståndet PEI-PDT och 125 mikroliter med 0,4 molartriumacetat i det avgasade vattnet. Inkubera de tvättade exemplaren av rostfritt stål med 1%PEI-PDT. Ersätt luft med argongas, försegla injektionsflaskan lufttät, och blanda dem på en shaker i en timme.Fortsätt omedelbart med peptidkonjugering eller lagra proverna vid fyra grader Celsius i upp till en vecka. Förbered ett milligram per milliliter human peptid CD47 stamlösning genom att lösa upp mänskliga peptid CD47 pulver i avgasade 50%ättiksyra, sedan förbereda arbetslösningen genom att lösa upp 500 mikroliter av beståndet i 4,5 milliliter av avgasade PBS. Inkubera de tvättade PEI-PDT-belagda proverna med arbetslösningen av peptid-CD47 vid rumstemperatur med skakningar i en timme.När du är klar, tvätta peptid CD47-belagda prover som beskrivs i texten manuskriptet. Efter beläggning metallfolier med antingen peptid CD47 eller förvrängd peptid, skär fjärdedel tum PVC-rör i tre 38 centimeter långa bitar och infoga upp till åtta omodifierade, förvrängd peptid, eller peptid CD47-modifierade metallfolier i tre olika rör. Samla 30 milliliter blod från friska mänskliga givare fri från anti-trombocyt mediciner, pre-loading sprutan med en milliliter av 4%natriumcitrat för att förhindra koagulering av det insamlade blodet.Sätt 10 milliliter blod i varje rör med en 10 milliliter spruta och anslut ändarna med metalladaptrar. Placera blodfyllda rör på hjulen på Chandler loop apparaten och skicka blodet längs metallfolier med hjulrotation vid 37 grader Celsius i fyra timmar. Dränera blodet från rören och kassera det enligt IRB krav, sedan skär rören med en skalpell för att hämta folier.Bered 2%glutaraldehydlösning genom att späda ut 70%-lösningen i natriumkodyodylatbuffert med 0,1 molar natriumklorid. Inkubera folierna i 2%glutaraldehydlösningen i 15 minuter och förvara dem i fyra grader Celsius över natten. Innan du analyserar metallfolier, tvätta dem tre gånger med PBS.Värm åtta milliliter PBS i ett 37 grader Celsius vattenbad. Förbered 10 millimolar CFDA färgämne stamlösning genom att lägga till 90 mikroliter av DMSO till en CFDA injektionsflaska, sedan förbereda arbetslösningen genom att lägga till 75 mikroliter av beståndet CFDA till den varma PBS. Invertera röret några gånger för att blanda och täcka det med aluminiumfolie.Placera varje folie i en milliliter CFDA färgämne i en 24-brunnsplatta. Täck plattan med aluminiumfolie och inkubera plattan i 37 grader Celsius i 15 minuter, tvätta sedan folierna tre gånger i PBS och bild dem med en fluorescens mikroskop. Koncentrationen av kovalent-bundna TAMRA konjugerad peptid CD47 kvantifierades för att bestämma maximal immobilisering densitet av peptiden på metallyta.Den maximala peptidretentionen var cirka 180 nanogram per centimeter i kvadrat, vilket uppnåddes med en insatskoncentration på 100 mikrogram per milliliter. Immobilisering av TAMRA konjugerad peptid CD47 på de modifierade metallytor var ytterligare bekräftas av fluorescens mikroskopi, som visade en enhetlig fluorescens avges från ytan av TAMRA konjugerad peptid CD47-behandlade mesh skivor. Endast minimal fluorescens upptäcktes på ytan av kontroll maskor som saknade ändringen, och därmed utesluta en icke-specifikt-bundna TAMRA konjugerad peptid CD47 som den viktigaste källan till fluorescens.Det bekräftades också att peptid CD47-belagda ytor visar en drastisk minskning av blodburna cell fastsättning jämfört med kodade modifierade och omodifierade peptid kontroller. Monocyter isolerade från råtta buffy coat celler odlades på bare metal och peptid CD47-modifierade rostfria folier. En 58%dämpning av akut monocyt fastsättning, deras omvandling till makrofager och makrofag spridning observerades på de funktionaliserade ytorna.Samtidigt som man försöker detta protokoll, är det mycket viktigt att utföra de steg som involverar avgasat vatten eller reagenser som ska utföras så snabbt som möjligt och för att minimera exponeringen för syre. Vår teknik modulerar selektivt cellulära interaktionen med metallytor och en typisk celltyp identifiering assay, såsom RT-PCR, flöde cytometry och immunofluorescens, är kompatibla med denna teknik. När den utvecklas för en rad bioaktiva peptider, kan denna teknik vara avgörande för att öka biokompatibiliteten vid vävnadsmaterialgränssnittet.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs

Metodutveckling för blodburna Makrofag Transport av Nanoformulated antiretrovirala läkemedel

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Bakteriell Immobilisering for Imaging genom atomkraftsmikroskopi

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generering och återvinning av β-cell sfäroider från steg-tillväxt PEG-peptid Hydrogeler

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Graphene Coatings for Biomedical Implants

Grafen Beläggningar för biomedicinska implantat

Atomically smooth graphene as a surface coating has potential to improve implant properties. This demonstrates a method for coating nitinol alloys with ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Generering av Aligned Funktionell myokardialvävnad Genom mikrokontakttryckning

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Förbättrad metod för framställning av en human cellbaserad, Kontakta modell av blod-hjärnbarriären

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention

Ferromagnetiska Bare Metal Stent för Endothelial Cell Capture och retention

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Wet kemi och peptid immobilisering på polytetrafluoretylen för förbättrad cellvidhäftning

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Webbplats-regisserad immobilisering av benmorfogent Protein 2 till fasta ytor genom att klicka på kemi

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Funktionell yta-immobilisering av gener med utgångsämnet Strand deplacement litografi

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...