Name: mitigation of blood borne cell attachment to metal implants through cd47-derived peptide immobilization
Uploaded: 2020-12-03T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization at JoVE.com

Bu makalede sunulan protokol geliştirme ve çalışmalar NIH (NBIB) R01 finansmanı (# EB023921) tarafından IF ve SJS'e, NIH (NHLBI) R01 finansmanı (# HL137762) ile IF ve RJL'ye desteklenmiştir.

Bu deney için tüm insan örnekleri Philadelphia Çocuk Hastanesi IRB uyarınca elde edildi. Tüm hayvan deneyleri Philadelphia Çocuk Hastanesi IACUC onayı üzerine yapıldı.
1. Çıplak metal yüzeylerin PEI-PDT ile kapasımı
<ol><li>Paslanmaz çelik folyo kuponları (1 cm x 1 cm veya 0,65 cm x 1 cm) veya paslanmaz çelik kafes diskleri bir shaker 'da (60 °C, 200 rpm hız) 5 dakika boyunca 2 izopropanol ile yıkayın. Bu adımı 2x gerçekleştirin. Daha sonra 2x klor...

<ol>
	<li>Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+managing+in-stent+restenosis:+a+review+of+clinical+data,+from+pathogenesis+to+treatment.">Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment.</a> Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).</li><li>van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacles+in+haemocompatibility+testing.">Obstacles in haemocompatibility testing.</a> Scientifica. 2013, 392584 (2013).</li><li>Mitra, A. K., Agrawal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+stent+restenosis:+bane+of+the+stent+era.">In stent restenosis: bane of the stent era.</a> Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).</li><li>Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+stents:+historical+development,+current+status+and+future+directions.">Coronary stents: historical development, current status and future directions.</a> British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).</li><li>Hoffmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+and+mechanisms+of+in-stent+restenosis.+A+serial+intravascular+ultrasound+study.">Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study.</a> Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).</li><li>Stefanini, G. G., Windecker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stent+thrombosis:+no+longer+an+issue+with+newer-generation+drug-eluting+stents.">Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents.</a> Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).</li><li>Palmerini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+with+bioabsorbable+polymer-+versus+durable+polymer-based+drug-eluting+and+bare-metal+stents:+evidence+from+a+comprehensive+network+meta-analysis.">Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).</li><li>Omar, W. A., Kumbhani, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Current+Literature+on+Bioabsorbable+Stents:+a+Review.">The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review.</a> Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).</li><li>Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+the+Inflammatory+Response+to+Clinically+Relevant+Polymers+by+Manipulating+the+Host+Response+Using+ITIM+Domain-Containing+Receptors.">Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors.</a> Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).</li><li>Oldenborg, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD47+as+a+marker+of+self+on+red+blood+cells.">Role of CD47 as a marker of self on red blood cells.</a> Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).</li><li>vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+'self'+recognition:+a+role+for+CD47-SIRPalpha+interactions+in+hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation.</a> Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).</li><li>Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+CD47-modified+biomaterials+to+mitigate+the+immune+response.">The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response.</a> Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).</li><li>Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self+inhibition+of+phagocytosis:+the+affinity+of+'marker+of+self'+CD47+for+SIRPalpha+dictates+potency+of+inhibition+but+only+at+low+expression+levels.">Self inhibition of phagocytosis: the affinity of 'marker of self' CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).</li><li>Slee, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+biocompatibility+of+CD47-functionalized+vascular+stents.">Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents.</a> Biomaterials. 87, 82-92 (2016).</li><li>Finley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+and+activation+of+platelets+and+neutrophils+with+CD47+functionalized+blood+contacting+surfaces.">Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces.</a> Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).</li><li>Stachelek, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+CD47+modified+polymer+surfaces+on+inflammatory+cell+attachment+and+activation.">The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation.</a> Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).</li><li>Inamdar, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+bioactivity+of+pepCD47+attachment+on+stainless+steel+surfaces.">Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces.</a> Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).</li><li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+delivery+of+gene+vectors+from+bare-metal+stents+by+use+of+a+biodegradable+synthetic+complex+inhibits+in-stent+restenosis+in+rat+carotid+arteries.">Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries.</a> Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).</li><li>Moser, K. V., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+rat+monocytes+migrate+through+a+BCEC-monolayer+and+express+microglia-markers+at+the+basolateral+side.">Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side.</a> Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).</li><li>vander Giessen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marked+inflammatory+sequelae+to+implantation+of+biodegradable+and+nonbiodegradable+polymers+in+porcine+coronary+arteries.">Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries.</a> Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).</li><li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphosphonate-mediated+gene+vector+delivery+from+the+metal+surfaces+of+stents.">Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).</li><li>Mouro-Chanteloup, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+red+cell+skeleton+protein+4.2+interacts+with+the+Rh+membrane+complex+member+CD47.">Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47.</a> Blood. 101 (1), 338-344 (2003).</li><li>Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+signaling+mechanisms+associated+with+CD47+modified+surfaces.">Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces.</a> Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).</li><li>Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+the+ex+vivo+Chandler+Loop+Apparatus+to+assess+the+biocompatibility+of+modified+polymeric+blood+conduits.">The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).</li></ol>

Biz göstermek ve kanda bulunan inflamatuar hücreler ile yüzeyin reaktivitesini azaltmak için kapsamlı amacı ile paslanmaz çelik bir yüzeye terapötik peptid moieties eklemek için nispeten yeni bir kimyasal strateji açıklar. Burada açıklanan bifosfonat kimyası, metal oksitler ve PABT'nin bifosfonat grupları arasındaki koordinat bağı oluşumunu içerir. Metal yüzeyde oluşan polibisfosfonat monolayer kalınlığı 5 nm18aşmaz, ve bu nedenle, kalın polimer kaplamaların potansiye...

Perkütan koroner girişim koroner arter hastalıkları (CAD) tedavisinde tedavinin ilk satırı ve öncelikle hastalıklı arterler stentleme içerir. Ancak stent restenozisi (ISR) ve stent trombozu stent konuşlandırma ile ilişkili sık karşılaşılan komplikasyonlardır1. Kan stent arayüzünde kan etkileşimi metal yüzeyinde plazma proteinlerinin neredeyse hemen adsorpsiyon ile karakterizedir, trombosit ve inflamatuar hücre eki ve aktivasyon takip2. Aktive inflamatuar hücrelerden inflamatuar sitokinler ve kemokinlerin salınımı, tunica media'daki vasküler düz kas hücrelerinin (VSMC) fenotibik modifikasyonuna yol açar ve merkezsel intimal bölmeye merkezsel göçlerini tetikler. İntimada aktive vsmc'nin çoğalması intimal tabaka kalınlaşması, lümen daralması3ve stent içi restenoz 3 ile sonuçlanır. VSMC proliferasyonlarını önlemek için uyuşturucu eluting stentleri (DES) geliştirilmiştir; ancak, bu ilaçların endotel hücreleri üzerinde hedef dışı sitotoksik etkisi var4,5. Bu nedenle, geç stent trombozu DESileilişkili sık görülen bir komplikasyondur6 ,7. Poli-L-laktit gibi biyolojik olarak parçalanabilir polimerlerden yapılmış stentler hayvan deneylerinde ve ilk klinik çalışmalarda çok umut vaat etmiş, ancak "gerçek hayattaki" klinik8kullanım3. Bu nedenle, daha iyi hasta sonuçları için çıplak metal stentbiyouyumluluğunu artırmak için bir ihtiyaç vardır.
CD47, konjenital reseptörSignal Regulatory Protein alpha (SIRPα)9'abağlandığında doğuştan gelen bağışıklık yanıtını inhibe eden her yerde ifade edilen transmembran proteinidir. SIRPα reseptörü bir bağışıklık hücresi tirozin inhibitör motifi vardır (ITIM) etki alanı ve SIRPα üzerine sinyal olaylar - CD47 etkileşimsonuçta inflamatuar hücre aktivasyonu10downregulation neden10 ,11,12,13. Laboratuarımızda araştırma rekombinant CD47 veya peptit türevi, CD47 (pepCD47) ekstrasellüler bölgenin 22 amino asit Ig etki alanına karşılık, klinik olarak ilgili biyomalzemeler14bir dizi ev sahibi bağışıklık yanıtı azaltabilir göstermiştir 14,15,16. Son zamanlarda, pepCD47 paslanmaz çelik stent yüzeylere hareketsiz olabilir ve önemli ölçüde restenosis ile ilişkili patofizyolojik yanıtı azaltmak göstermiştir. Not, pepCD47 modifiye yüzeyler uzun süreli depolama ve etilen oksit sterilizasyonu17gibi ilgili kullanım koşullarına uygundur. Bu amaçla, pepCD47 endovasküler stentlerin klinik sınırlamaları gidermek için yararlı bir terapötik hedef olabilir.
PepCD47'nin metal bir yüzeye kovalent bağlanması için strateji, metal yüzeyin inyeni kimyasal modifikasyonları içerir. Metal yüzeyler ilk olarak poliallilin bifosfonat ile gizli tiyol grupları (PABT) ile kaplanır ve ardından tiyollerin korunması ve polietilenin (PEI) yüklü piriyldithio grupları (PDT) ile bağlanması nı sağlar. PEI PDT grupları deprotected PABT tiols ile reaksiyonda tüketilmemiş sonra pepCD47 terminal sistein artıkları thiols içeren ile tepki, bir disülfür bağı ile metal yüzeyine bağlayıcı pepCD47 sonuçlanan14,17,18. Biz peptid maksimum yüzey immobilizasyonu ile sonuçlanan peptit giriş konsantrasyonu belirlemek için bir florofor konjuge pepCD47 (TAMRA-pepCD47) kullanılır. Son olarak, pepCD47 kaplı metal yüzeylerin akut ve kronik anti-inflamatuar kapasitesi, chandler döngü aparatı kullanılarak ex vivo ve monosit eki/makrofaj genleşme tayini sırasıyla değerlendirildi.
Bu kağıt, metal yüzeye tiolated peptidlerin bağlanması için sistematik bir protokol sağlar; peptidin maksimum hareketsizlik yoğunluğunun belirlenmesi; ve tam kan ve izole monositlere maruz kalan pepCD47 kaplamalı metal yüzeylerin anti-inflamatuar özelliklerini değerlendirmek.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:834px;" width="833">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">1 M Tris-HCL</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">15567-027</td>
			<td style="width:239px;">pH - 7.5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">4% Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:184px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">16539-07</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">4% Sodium Citrate</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:129px;">S5770</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">ACK lysing buffer</td>
			<td style="width:184px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">118-156-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">202301</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">203501</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52)</td>
			<td style="width:184px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:129px;">550979</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1)</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:129px;">MCA341</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">201701</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Chloroform Certified ACS</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Dimethyl Formammide (DMF)</td>
			<td style="width:184px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:129px;">39117</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Embra stainless steel grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">E200-SS</td>
			<td>stainless steel mesh mesh disks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Ficoll Hypaque</td>
			<td style="width:184px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:129px;">17-1440-02</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:184px;">ACROS organic</td>
			<td style="width:129px;">148930025</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">goat anti-mouse IgG Alexa Fluor</td>
			<td style="width:184px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:129px;">A11030</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:184px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:129px;">402-01</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human pepCD47</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4099101</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">A426P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Metal adapters</td>
			<td style="width:184px;">Leur Fitting</td>
			<td style="width:129px;">6515IND</td>
			<td style="width:239px;">1 way adapter 316 ss 1/4&#34;-5/16&#34; hoes end</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Methanol</td>
			<td style="width:184px;">RICCA chemical company</td>
			<td style="width:129px;">4829-32</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Microscope</td>
			<td style="width:184px;">Nikon Eclipse</td>
			<td style="width:129px;">TE300</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pottasium Bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">P184-500</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">PVC tubes</td>
			<td style="width:184px;">Terumo-CVS</td>
			<td style="width:129px;">60050</td>
			<td style="width:239px;">1/4&#34; X 1/16 8&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride</td>
			<td style="width:184px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">11653</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:184px;">Bio-Rad laboratories</td>
			<td style="width:129px;">161-0302</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Sodum actetate (C2H3NaO2)</td>
			<td style="width:184px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:129px;">A13184</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Src peptide</td>
			<td>Bachem</td>
			<td style="width:129px;">4092599</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen</td>
			<td>Microgroup, Medway, MA</td>
			<td style="width:129px;">20097328</td>
			<td>1 cm X 6 mm OD</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Stainless steel foils (AISI 316L)</td>
			<td style="width:184px;">Goodfellow, Coraopolis, PA</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:239px;">100 mm X 100 mm X 0.05 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47)</td>
			<td>Bachem</td>
			<td style="width:129px;">4100277</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:282px;">TMB (3,3&#8217; ,5,5&#8217; -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PG82089</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Tween-20</td>
			<td style="width:184px;">Bio-Rad laboratories</td>
			<td style="width:129px;">170-6531</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">V12883</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitigation of blood borne cell attachment to metal implants through cd47-derived peptide immobilization

Çıplak metal stentler ve ilaç eluting stentleri ile ilişkili önemli komplikasyonlar sırasıyla in-stent restenozisi ve geç stent trombozudur. Bu nedenle, metal stentlerin biyouyumluluğunun iyileştirilmesi önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Bu protokolün amacı, endovasküler stentler de dahil olmak üzere, kanla temas eden tıbbi implantların biyouyumluluğunu artırmak için biyolojik olarak aktif peptidler tarafından metal yüzey modifikasyonu için sağlam bir teknik tanımlamaktır. CD47 kendini bir immünolojik tür-özgü belirteç ve anti-inflamatuar özelliklere sahiptir. Çalışmalar, ekstrasellüler bölgede CD47'nin Ig etki alanına karşılık gelen 22 amino asit peptidin (pepCD47), tam uzunlukta protein gibi anti-inflamatuar özelliklere sahip olduğunu göstermiştir. Farelerde in vivo çalışmalar, ve bizim laboratuvardan tavşan ve insan kanı deneysel sistemlerde ex vivo çalışmalar metaller üzerinde pepCD47 immobilizasyon inflamatuar hücre eki ve aktivasyon önleyerek biyouyumluluğu artırdığını göstermiştir. Bu makalede, metal yüzeylerin ve peptit eki işlevselleştirilmesi için adım adım protokol açıklanmaktadır. Metal yüzeyler, gizli tiyol grupları (PABT) ile poliallilin bifosfat kullanılarak modifiye edilir ve ardından tiyollerin korunması ve piriyldithio grupları (PEI-PDT) ile yüklü polietileninile reaksiyon yoluyla tiyol-reaktif bölgelerin güçlendirilmesi sağlanır. Son olarak, pepCD47, bir çift 8-amino-3,6-dioksan-oktavoil spacer ile çekirdek peptid dizisine bağlı terminal sistein artıkları içeren, disülfür bağları ile metal yüzeye bağlı. Metal yüzeye peptit eki Bu metodoloji verimli ve nispeten ucuz ve böylece çeşitli metalik biyomalzemelerin biyouyumluluğu artırmak için uygulanabilir.

Metal yüzeyler, Şekil 1'degösterildiği gibi bir dizi kimyasal modifikasyon yoluyla peptit eki için tiyol-reaktif hale getirilir. PEI-PDT tedavisinin ardından PABT kuluçka makinesi metal yüzeyini peptit eki için uygun hale getirir. C-terminus'ta sistein kalıntısı içeren peptid CD47 (pepCD47) esnek bir çift AEEAc köprüsü ile çekirdek pepCD47 dizisine katıldı ve disülfür bağları ile tiyol-reaktif yüzeylere kovalent olarak bağlıdır. Bu protokolü kullanarak, pepCD47'n...

Watch this Scientific Journal Video about Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization at JoVE.com

Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

Burada sunulan peptid CD47 (pepCD47) polibisfosfonat kimya kullanarak metal stentler için ekiçin bir protokoldür. PepCD47 kullanarak metal stentlerin fonksiyonelleştirilmesi inflamatuar hücrelerin bağlanmasını ve aktivasyonunu önler ve böylece biyouyumluluğunu artırır.

CD47-Türetilmiş Peptid İmmobilizasyonu Ile Metal İmplantlara Kan Yoluyla Bulaşan Hücre Bağlılığının Azaltılması

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, ...

Bu protokol, metalik yüzeylere terapötik peptidler eklemek için yeni bir kimyasal strateji içerir ve metalik biyomalzemelerin geniş bir yelpazede biyouyumluluğu artırmak için potansiyele sahiptir. Bu biyoimplantlar çıplak metal yüzeylere peptidler ve terapötik proteinler iklemek için evrensel ve sağlam bir tekniktir. Biz stent tarafından tetiklenen inflamasyon yanıtları önlemek için CD47 peptidler ekleyerek metalik stent biyouyumluluğunu artırmak için bu teknolojiyi kullandık.Beş dakika boyunca bir shaker 2-izopropanol ile paslanmaz çelik folyo kuponveya örgü diskler yıkayarak başlayın. Bu yıkamayı iki kez yapın, ardından numuneleri iki kez kloroformla yıkayın ve yıkama başına 10 dakika yıkayın. Temizlenmiş paslanmaz çelik numuneleri 220 derecede 30 dakika fırında pişirin.Pişmiş folyoları veya kafes diskleri PABT'nin %0,5 sulu çözeltisi içine batırın ve bir saat çalkalayıcıda kuluçkaya yatırın. PABT modifiye edilmiş numuneleri beş kez deiyonize edilmiş distile suile yıkayın. Örnekleri yeni bir şişeye aktarın ve yıkıntıları tekrarlayın.Numuneleri tcep ile 15 dakika oda sıcaklığında çalkalayıcı üzerinde tedavi edin. Degas deionized su yuvarlak bir alt şişede bir vakum üreten cihaz ile, bir lyophilizer gibi, ve gazsız su ile folyo veya örgü diskler yıkayın beş kez. Örnekleri yeni bir şişeye aktarın ve yıkıntıları tekrarlayın.Gazsız suda 212,5 mikrolitre pei-PDT ve 0,4 molar sodyum asetat 125 mikrolitre seyrelterek% 1 PEI-PDT çözeltisi beş mililitre hazırlayın. Yıkanmış paslanmaz çelik numuneleri %1 PEI-PDT ile kuluçkaya yatırın. Havayı argon gazıyla değiştirin, şişeleri hava geçirmez kapatın ve bir saat çalkalayın.Hemen peptit çekimi ile devam edin veya bir hafta kadar dört santigrat derece örnekleri saklayın. Gazdan arındırılmış %50 asetik asitte insan peptiti CD47 tozunu eriterek mililitre başına bir miligram insan peptit CD47 stok çözeltisi hazırlayın, ardından 4,5 mililitre gazdan arındırılmış PBS'de 500 mikrolitre stoğu eriterek çalışma çözümünü hazırlayın. Yıkanmış PEI-PDT kaplı numuneleri, bir saat boyunca sallayarak oda sıcaklığında peptid CD47'nin çalışma çözeltisi ile inkübedin.Bittiğinde, metin el yazmasında açıklandığı gibi peptid CD47 kaplı örnekleri yıkayın. Metal folyoları ya peptit CD47 veya çırpılmış peptid ile kapladıktan sonra, çeyrek inç PVC tüpleri üç 38 santimetre uzunluğunda parçalarhalinde kesin ve sekiz adete kadar değiştirilmemiş, karıştırılmış peptid veya peptit CD47 modifiye edilmiş metal folyoları üç farklı tüpe yerleştirin. Sağlıklı insan donörlerden herhangi bir anti-trombosit ilaçsız 30 mililitre kan toplayın, toplanan kanın pıhtılaşmasını önlemek için şırınganın mililitresini %4 sodyum sitratla önceden yükleyin.10 mililitrelik bir şırınga kullanarak her tüpe 10 mililitre kan koyun ve uçları metal adaptörlerle bağlayın. Chandler döngü aparatlarının tekerleklerine kan dolu tüpleryerleştirin ve dört saat boyunca 37 santigrat derecede tekerlek dönüşü ile metal folyolar boyunca kan geçirin. Tüplerden kan drenaj ve IRB gereksinimlerine göre atmak, sonra folyo almak için bir neşter ile tüpler kesti.Sodyum kacodylate tamponundaki %70 çözeltiyi 0,1 molar sodyum klorür ile seyrelterek %2 glutaraldehit çözeltisi hazırlayın. Folyoları %2 glutaraldehit çözeltisinde 15 dakika kuluçkaya yatırın ve bir gecede dört santigrat derecede saklayın. Metal folyoları analiz etmeden önce, pbs ile üç kez yıkayın.37 santigrat derece su banyosunda sekiz mililitre PBS ısıtın. Bir CFDA şişesine 90 mikrolitre DMSO ekleyerek 10 milimolar CFDA boya stok çözeltisi hazırlayın, ardından sıcak PBS'ye 75 mikrolitre cfda ekleyerek çalışma çözümünün hazırlanın. Karıştırmak ve alüminyum folyo ile kaplayın tüpü birkaç kez ters çevirin.Her folyoyu 24 kuyulu bir plakaya bir mililitre CFDA boyaya yerleştirin. Plakayı alüminyum folyo ile kaplayın ve plakayı 37 derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın, ardından folyoları PBS'de üç kez yıkayın ve floresan mikroskopla görüntüleyin. Kovalent bağlı TAMRA konjuge peptid CD47 konsantrasyonu metal yüzeyinde peptid maksimal hareketsizlik yoğunluğunu belirlemek için ölçüldü.Maksimum peptit tutma yaklaşık 180 santimetre kare, hangi mililitre başına 100 mikrogram bir giriş konsantrasyonu ile elde edildi. Modifiye metal yüzeylerde TAMRA konjuge peptid CD47 immobilizasyon daha floresan mikroskopi ile doğrulandı, tamra konjuge peptid CD47-tedavi örgü disklerin yüzeyinden yayılan tek tip floresan gösterdi. Modifikasyondan yoksun kontrol meshes yüzeyinde sadece minimal floresan tespit edildi, bu nedenle floresan ana kaynağı olarak bir non-özel bağlı TAMRA konjuge peptid CD47 hariç.Ayrıca peptid CD47 kaplı yüzeylerin, karıştırılmış modifiye edilmiş ve değiştirilmemiş peptid kontrollerine kıyasla kan yoluyla bulaşan hücre ekinde ciddi bir azalma gösterdiği doğrulandı. Sıçan buffy kat hücrelerinden izole monositler çıplak metal ve peptit CD47-modifiye paslanmaz çelik folyo kültürlü edildi. İşlevselleştirilmiş yüzeylerde akut monosit eki%58 oranında intenuulasyon, makrofajlara dönüşüm ve makrofaj proliferasyonu gözlendi.Bu protokolü denerken, gazdan arındırılmış su veya reaktifiçeren adımların mümkün olan en kısa sürede yapılması ve oksijene maruz kalmanın en aza indirilmesi çok önemlidir. Teknolojimiz seçici olarak metal yüzeylerle hücresel etkileşimi modüle eder ve RT-PCR, akış sitometrisi ve immünoforesans gibi tipik bir hücre tipi tanımlama talimi bu teknikle uyumludur. Biyoaktif peptid bir dizi için geliştirilen, Bu teknoloji doku malzeme arayüzübiyouyumluluğu artırmada etkili olabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs

Kan Bazlı Makrofaj Taşıma Nanoformulated antiretroviral ilaçlar Geliştirme Yöntemleri

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Atomik Kuvvet Mikroskopi Görüntüleme Bakteriyel İmmobilizasyon

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Adım büyüme PEG-peptid Hidrojeller kaynaktan β-hücre sferoidlerin Üretimi ve Kurtarma

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Graphene Coatings for Biomedical Implants

Biyomedikal implantlar için Grafen Kaplamalar

Atomically smooth graphene as a surface coating has potential to improve implant properties. This demonstrates a method for coating nitinol alloys with ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Mikrokontak baskı sayesinde Bağlantısızlar Fonksiyonel Miyokard Doku Üretimi

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention

Endotel Hücre yakalama ve Saklanmasına İlişkin ferromanyetik Bare Metal Stent

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Geliştirilmiş Hücre yapışma Politetrafloroetilen Islak Kimya ve Peptit İmmobilizasyonu

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Site yönettiği immobilizasyon kemik morfogenetik protein 2 katı yüzeyler için tıklayın kimya tarafından

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Genlerin Multistep Strand deplasman litografi kullanarak işlevsel yüzey immobilizasyon

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...