Name: planarian scrunching as a quantitative behavioral readout for noxious stimuli sensing
Uploaded: 2020-07-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing at JoVE.com

저자는 원고에 대한 의견에 대한 씨 타완 골에게 감사드립니다. 이 작품은 NSF 커리어 그랜트 1555109에 의해 지원되었다.

1. 양적 평면 행동 분석
<ol><li>실험 설정<ol><li>희미한 LED 패널을 평평한 표면에 놓습니다. LED 패널은 두 가지 목적을 제공합니다: (1) 균일한 흰색 배경을 제공하고 (2) 적절한 콘트라스트를 얻기 위해 조정 가능한 광원으로 사용된다. LED 패널에 100mm 페트리 디쉬 아레나를 배치합니다. 참고: 처리량을 늘리기 위해 멀티 웰 플레이트를 아레나23,,24로사용?...

<ol>
	<li>Rink, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+systems+and+regeneration+in+planaria.">Stem cell systems and regeneration in planaria.</a> Development Genes and Evolution. 223, 67-84 (2013).</li><li>Reddien, P. W., Alvarado, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+Planarian+Regeneration.">Fundamentals of Planarian Regeneration.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 20, 725-757 (2004).</li><li>Cebri&#224;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+the+central+nervous+system:+how+easy+for+planarians.">Regenerating the central nervous system: how easy for planarians.</a> Development Genes and Evolution. 217, 733-748 (2007).</li><li>Pearl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memoirs:+The+Movements+and+Reactions+of+Fresh-Water+Planarians:+A+Study+in+Animal+Behaviour.">Memoirs: The Movements and Reactions of Fresh-Water Planarians: A Study in Animal Behaviour.</a> Journal of Cell Science. , 2-46 (1903).</li><li>Mc Connell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Manual of Psychological Experimentation on Planarians. , (1967).</li><li>Talbot, J., Sch&#246;tz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+planarian+wild-type+behavior+as+a+platform+for+screening+locomotion+phenotypes.">Quantitative characterization of planarian wild-type behavior as a platform for screening locomotion phenotypes.</a> Journal of Experimental Biology. 214, 1063-1067 (2011).</li><li>Cochet-Escartin, O., Mickolajczk, K. J., Collins, E. M. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+planarian+TRPA1+by+reactive+oxygen+species+reveals+a+conserved+mechanism+for+animal+nociception.">Activation of planarian TRPA1 by reactive oxygen species reveals a conserved mechanism for animal nociception.</a> Nature Neuroscience. 20, 1686-1693 (2017).</li><li>Shomrat, T., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+training+paradigm+reveals+long-term+memory+in+planarians+and+its+persistence+through+head+regeneration.">An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration.</a> Journal of Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).</li><li>Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Second-Generation+device+for+automated+training+and+quantitative+behavior+analyses+of+Molecularly-Tractable+model+organisms.">A Second-Generation device for automated training and quantitative behavior analyses of Molecularly-Tractable model organisms.</a> PLoS One. 5, 1-20 (2010).</li><li>Ross, K. G., Currie, K. W., Pearson, B. J., Zayas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervous+system+development+and+regeneration+in+freshwater+planarians.">Nervous system development and regeneration in freshwater planarians.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews-Developmental Biology. 6, 266 (2017).</li><li>Cebri&#224;, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+neural-specific+genes+reveals+the+structural+and+molecular+complexity+of+the+planarian+central+nervous+system.">The expression of neural-specific genes reveals the structural and molecular complexity of the planarian central nervous system.</a> Mechanisms of Development. , 116-204 (2002).</li><li>Mineta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+evolutionary+process+of+the+CNS+elucidated+by+comparative+genomics+analysis+of+planarian+ESTs.">Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 7666-7671 (2003).</li><li>Ross, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SoxB1+Activity+Regulates+Sensory+Neuron+Regeneration,+Maintenance,+and+Function+in+Planarians.">SoxB1 Activity Regulates Sensory Neuron Regeneration, Maintenance, and Function in Planarians.</a> Developmental Cell. 47, 331-347 (2018).</li><li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+Dopaminergic+Neural+Network+and+Locomotion+Function+in+Planarian+Regenerates.">Reconstruction of Dopaminergic Neural Network and Locomotion Function in Planarian Regenerates.</a> Developmental Neurobiology. 67, 1059-1078 (2007).</li><li>Birkholz, T. R., Beane, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+planarian+TRPA1+homolog+mediates+extraocular+behavioral+responses+to+near-ultraviolet+light.">The planarian TRPA1 homolog mediates extraocular behavioral responses to near-ultraviolet light.</a> Journal of Experimental Biology. 220, 2616-2625 (2017).</li><li>Currie, K. W., Molinaro, A. M., Pearson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+sources+of+hedgehog+modulate+neurogenesis+in+the+adult+planarian+brain.">Neuronal sources of hedgehog modulate neurogenesis in the adult planarian brain.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Talbot, J. A., Currie, K. W., Pearson, B. J., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smed-dynA-1+is+a+planarian+nervous+system+specific+dynamin+1+homolog+required+for+normal+locomotion.">Smed-dynA-1 is a planarian nervous system specific dynamin 1 homolog required for normal locomotion.</a> Biology Open. , 1-8 (2014).</li><li>Currie, K. W., Pearson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+lhx1/5-1+and+pitx+are+required+for+the+maintenance+and+regeneration+of+serotonergic+neurons+in+planarians.">Transcription factors lhx1/5-1 and pitx are required for the maintenance and regeneration of serotonergic neurons in planarians.</a> Development. 140, 3577-3588 (2013).</li><li>Hagstrom, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+cholinesterase:+molecular+and+functional+characterization+of+an+evolutionarily+ancient+enzyme+to+study+organophosphorus+pesticide+toxicity.">Planarian cholinesterase: molecular and functional characterization of an evolutionarily ancient enzyme to study organophosphorus pesticide toxicity.</a> Archives of Toxicology. 92, 1161-1176 (2018).</li><li>Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Collins, E. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-behavioral+endpoint+testing+of+an+87-chemical+compound+library+in+freshwater+planarians.">Multi-behavioral endpoint testing of an 87-chemical compound library in freshwater planarians.</a> Toxicological Sciences. , 26-44 (2019).</li><li>Zhang, S., Hagstrom, D., Siper, N., Behl, M., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+neurotoxic+potential+of+15+flame+retardants+using+freshwater+planarians.">Screening for neurotoxic potential of 15 flame retardants using freshwater planarians.</a> Neurotoxicology and Teratology. 73, 54-66 (2019).</li><li>Wu, J. P., Li, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+freshwater+planarians+in+environmental+toxicology+studies:+Advantages+and+potential.">The use of freshwater planarians in environmental toxicology studies: Advantages and potential.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 161, 45-56 (2018).</li><li>Rompolas, P., Azimzadeh, J., Marshall, W. F., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+ciliary+assembly+and+function+in+planaria.">Analysis of ciliary assembly and function in planaria.</a> Methods in Enzymology. 525, 245-264 (2013).</li><li>Sabry, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+or+genetic+targeting+of+Transient+Receptor+Potential+(TRP)+channels+can+disrupt+the+planarian+escape+response.">Pharmacological or genetic targeting of Transient Receptor Potential (TRP) channels can disrupt the planarian escape response.</a> PLoS One. , 753244 (2019).</li><li>Cochet-Escartin, O., Carter, J. A., Chakraverti-Wuerthwein, M., Sinha, J., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slo1+regulates+ethanol-induced+scrunching+in+freshwater+planarians.">Slo1 regulates ethanol-induced scrunching in freshwater planarians.</a> Physical Biology. 13, 1-12 (2016).</li><li>Hagstrom, D., Truong, L., Zhang, S., Tanguay, R. L., Collins, E. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+zebrafish+and+planarian+model+systems+for+developmental+neurotoxicity+screens+using+an+87-compound+library.">Comparative analysis of zebrafish and planarian model systems for developmental neurotoxicity screens using an 87-compound library.</a> Toxicological Sciences. , (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Akiyama, Y., Agata, K., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+Behaviors+and+Wall-Curvature+Lead+to+Apparent+Wall+Preference+in+Planarian.">Spontaneous Behaviors and Wall-Curvature Lead to Apparent Wall Preference in Planarian.</a> PLoS One. 10, 0142214 (2015).</li><li>Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+Phototactic+Assay+Reveals+Differential+Behavioral+Responses+Based+on+Wavelength.">Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength.</a> PLoS One. 9, 114708 (2014).</li><li>Petrus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+of+TRPA1+in+mechanical+hyperalgesia+is+revealed+by+pharmacological+inhibition.">A role of TRPA1 in mechanical hyperalgesia is revealed by pharmacological inhibition.</a> Molecular Pain. 3, 40 (2007).</li><li>Takano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration-dependent+conditional+gene+knockdown+(Readyknock)+in+planarian:+Demonstration+of+requirement+for+Djsnap-25+expression+in+the+brain+for+negative+phototactic+behavior.">Regeneration-dependent conditional gene knockdown (Readyknock) in planarian: Demonstration of requirement for Djsnap-25 expression in the brain for negative phototactic behavior.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 49, 383-394 (2007).</li><li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+glutamic+acid+decarboxylase+gene+and+distribution+of+GABAergic+nervous+system+in+the+planarian+Dugesia+japonica.">Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergic nervous system in the planarian Dugesia japonica.</a> Neuroscience. 153, 1103-1114 (2008).</li><li>Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermosensory+signaling+by+TRPM+is+processed+by+brain+serotonergic+neurons+to+produce+planarian+thermotaxis.">Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis.</a> Journal of Neuroscience. 34, 15701-15714 (2014).</li></ol>

이 프로토콜을 사용하여, 하나는 물리 및 화학 자극7,,28,,29 또는 유전자 조작 (RNAi)28, 29,29 의 효과 의 효과 평면 운동에서 정량적으로 연구 할 수 있습니다. 공간 해상도를 최대화하기 위해 카메라를 경기장과 최대한 가깝게 이동시키면서 전체 경기장이 시야에 있는지 확인하는 것이 ...

4줄기세포 및재생연구1,,2,,3,민물 평면주의에 대한 인기 외에도, 민물 평면도는4,5에서오랫동안 사용되어 왔으며, 비교적 큰 크기(길이가 몇 밀리미터), 실험실 유지 보수의 용이성과 저렴한 비용, 광범위한 관찰 가능한 동작을 활용하고 있다. 평면 행동 연구에 컴퓨터 비전과 자동 추적의 도입6,,7,,8,,9,,10,,11 행동 표현형의 정량적 분화를 가능하게했다. 동물 행동은 신경 기능의 직접적인 판독입니다. 기획자 신경계는 중간 크기와 복잡성이지만, 척추 동물뇌12,,13,,14,연구 평면 행동을 연구하는 것은 더 복잡한 유기체에서 직접 탐구하기 어려울 수 있습니다 신경 작용의 보존 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 따라서, 평면도는 비교 신경생물학 연구를 위한 귀중한모델이다8,12, 15,,15,16,,17,,18,,19,20,,,21. 또한, 수생 환경은 화학 물질에 신속하고 촉진노출되어 재생 및 성인 평면제에서 뇌 기능에 미치는 영향을 연구할 수 있게 해주며,신경독성학 22,,23,,24,,25,,26에대한 인기 있는 시스템으로 만들어 줍니다.
플래너리안은 글라이딩, 연동, 스런치라고 불리는 세 가지 뚜렷한 걸음걸이를 가지고 있습니다. 각 걸음걸이는 특정 상황에서 전시된다: 글라이딩은 기본 걸음걸이이며, 섬모 기능이77,27로손상될 때 연동이 발생하고, 스크런치는 탈출 걸음걸이 – 섬모 기능과 무관하게 – 특정 유해 자극7에대응하여. 우리는 스크런치가 극단적 인 온도 또는 pH, 기계적 상해, 또는 특정 화학 유도기를 포함하여 특정 화학적 또는 물리적 단서의 감각에7의해 유도되는 특정 반응이며, 따라서 일반적인 응력 반응7,28,,29가아니라는 것을 보여주었다.
이 프로토콜을 사용하여 쉽게 정량화 될 수있는 특이성 및 고정 관념 매개 변수로 인해, 스크런치는 연구원이 감각 경로 및 행동의 신경 제어를 해부하는 기계론 적 연구를 수행 할 수있는 강력한 행동표현형이다 25,,28. 또한, 스크런치는 신경 독성 학 연구에서 신경계 발달 및 기능에 대한 불리한 화학적 효과를 분석하는 민감한 종점으로 나타났다22,,24,,25,,30. 여러 가지 감각 경로는 다양한 메커니즘을 통해 스크런치를 유도하기 위해 수렴하는 것처럼28,scrunching은 다양하지만 특정, 자극이 다른 신경 회로를 해부하고 다른 신호가 스런치 표현형을 생성하기 위해 통합되는 방법을 연구하기 위해 사용할 수 있기 때문에 다른 평면 행동과 다릅니다.
중요한 것은, 종 다름이 존재하며, 한 화학 물질이 한 마리의 평면 종에서 scrunching을 유도할 수 있지만 다른 화학 물질은 다른 종에서 다른 행동 반응을 유도할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 아난다미드가 플라니안 종 두게시아 자포니카에서 스크런치를 유도하지만, 슈미트메아 지중해28에서연골을 유도한다는 것을 발견했다. 이 예는 뚜렷한 분자 메커니즘의 표현성이기 때문에 다른 걸음걸이를 안정적으로 구별할 수 있다는 것의 중요성을 강조합니다. 그러나, 연골으로부터의 스쿼킹의 구별은 질적 관측 데이터를 사용하기 어렵다, 두 걸음 모두 근육 중심이며 질적 유사성을 공유하기 때문에7,,28. 따라서, 걸음걸이를 구별하기 위해서는 특징적인 파라미터7,,28에기초하여 구별을 허용하는 섬모 이미징 또는 정량적 행동 연구를 수행할 필요가 있다. 섬모 화상 진찰은 실험적으로 도전적이고 고배율 화합물 현미경 및 고속 카메라7,,28과같은 특수 장비가 필요하기 때문에, 정량적 행동 분석으로 연구원에 의해 광범위하게 접근할 수 없습니다.
여기서, 우리는 (1) 다양한 물리적 (유해 온도, 절단, 거의 UV 빛) 및 화학 (알릴 이소티오야네이트 (AITC), 계피 알데히드) 자극 및 (2) 자유롭게 사용할 수있는 소프트웨어를 사용하여 계획 행위의 정량적 분석을 사용하여 스크런치의 유도에 대한 프로토콜을 제시한다. 4개의 파라미터(체길이 진동, 상대속도, 최대 진폭 및 몸의 신장 및 수축의 비대칭)를 정량화함으로써7,스크런싱은 글라이딩, 연동 및 수축과 구별될 수 있으며, 뱀과 같은운동(15) 또는 간질과같은 문헌에 보고된 기타 행동 상태로부터 분화될 수 있다. 또한, 위기는 다른 평면 종 중 보존하는 동안7,각 종은 자신의 특성 주파수와 속도를 가지고; 따라서 종의 글라이딩과 스크런싱 속도가 결정되면 속도만으로도 미끄러지기 및연공연산(29)과스크런딩을 구별하는 수단으로 사용할 수 있다. 이 프로토콜은 계산 이미지 분석 이나 행동 연구에서 사전 교육을 가정 하지 않습니다 따라서 또한 학부 수준에서 교육 실험실 컨텍스트에서 planarian 행동 실험에 적용할 수 있습니다. 프로토콜 적응을 용이하게 하는 예제 데이터는 보충 자료에 제공됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Allyl isothiocyanate, 95% (AITC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>377430-5G</td>
			<td>CAUTION:&#160; Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens, 2/3 25mm F/1.4&#160;</td>
			<td>Tamron</td>
			<td>23FM25SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile</td>
			<td>MedSupply Partners</td>
			<td>62-1019-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cinnamaldehyde, &#62;95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W228613-100G-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimmable A4 LED Tracer Light Box</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07HD631RP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flea3 USB3 camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>FL3-U3-13E4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat resistant gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-394-298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HP88854200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td>Prepare in deionized water at 0.5 g/L.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Montj&#252;ic salts, prepared in Milli-Q water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td>Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene</td>
			<td>Simport</td>
			<td>D210-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, 20-200 &#956;L range</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17008652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX 150 mL beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS1000150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade, 0.22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roscolux color filter:&#160; Golden Amber</td>
			<td>Rosco</td>
			<td>R21</td>
			<td>Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roscolux color filter:&#160; Medium Red</td>
			<td>Rosco</td>
			<td>R27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roscolux color filter:&#160; Storaro Red</td>
			<td>Rosco</td>
			<td>R2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samco transfer pipette, 62 &#181;L large aperture</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>691TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support stand&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-947-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV laser pointer</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B082DGS86R</td>
			<td>This is a Class II laser (405nm &#177;10nm) with output power &#60;5 mW.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

planarian scrunching as a quantitative behavioral readout for noxious stimuli sensing

민물 플래니안들은 보통 복부 쪽의 섬모 추진을 통해 매끄럽게 미끄러집니다. 그러나 특정 환경 조건은 근육 중심의 운동 형태인 연동 또는 스런치를 유도할 수 있습니다. 연동은 섬모 결함에서 발생하지만, 스크런치는 섬모 기능과 독립적이며 절단, 유해 온도, 극단적 인 pH 및 에탄올을 포함한 특정 자극에 대한 특정 반응입니다. 따라서, 이 두 근육 중심의 걸음걸이는 기계적으로 구별된다. 그러나, 그들은 질적으로 구별하기 어려울 수 있습니다. 여기에서는 다양한 물리적 및 화학 자극을 사용하여 스크런치를 유도하는 프로토콜을 제공합니다. 우리는 자유롭게 사용할 수있는 소프트웨어를 사용하여 연연및 글라이딩과 구별하는 데 사용할 수있는 스크런치의 정량적 특성을 자세히 설명합니다. scrunching은 보편적 인 평면 걸음걸이이기 때문에, 특성 종 별 차이가이기는하지만,이 프로토콜은 광범위하게 적절한 고려 사항을 사용할 때, 평면의 모든 종에 적용 할 수 있습니다. 이를 입증하기 위해, 우리는 행동 연구에서 사용되는 두 개의 가장 인기있는 플라야 종, Dugesia japonica 및 Schmidtea 지중해의반응을 물리적 및 화학 적 자극의 동일한 세트와 비교합니다. 더욱이, scrunching의 특이성은 이 프로토콜이 관련된 분자 표적 및 신경 회로를 해부하기 위하여 RNA 간섭 및/또는 약리학적 노출과 함께 사용될 수 있게 해주며, 잠재적으로 노치프션과 신경 근육 통신의 중요한 양상에 기계론적인 통찰력을 제공할 수 있습니다.

S. 지중해 평면도에서 비외-UV 지각은 TRPA1 에 의존하 고 H2O2 릴리스17에연결 될 제안 되었습니다. H22O2 노출은 S. 지중해 및 D. japonica planarians28에서TRPA1 의존적인 스크런치를 유도하기 때문에, 섹션 2.1.4의 단계는 거의 UV 빛 노출이 두 종모두에서 스크런치를 유도하는지 여부를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다...

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Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

민물 평면도는 정량적 행동 분석에 의해 구별 되는 세 가지 걸음걸이 (활공, 연동 및 scrunching)를 전시합니다. 당사는 다양한 유해 자극, 정량화, 연동 및 글라이딩으로부터의 구별을 이용하여 스크런치를 유도하는 방법을 설명합니다. 유전자 녹다운을 사용하여, 우리는 정량적 현상 읽기로 스크런치의 특이성을 보여줍니다.

유해 자극 감지를 위한 양적 행동 판독으로 기획자 스크런싱

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...

이 프로토콜은 연구원이 분자 및 화학적 동요와 정량적 행동 분석을 결합하여 이 행동의 근본적인 planarian 행동 및 sec 메커니즘을 명확히 할 수 있게 합니다. 이 기술은 무료 이동 평면주의의 정량적 행동 판독을 얻기 위해 고급 악기 또는 전문 소프트웨어가 필요하지 않기 때문에 모든 기술 수준에 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 스크런치는 플래니언의 예외를 연구하는 데 사용할 수 있으며, 제노바이오틱스와 질병으로 인한 신경계 기능을 방해하는 분석에 민감한 종점 역할을 합니다.먼저 균일한 흰색 배경을 제공하고 적절한 콘트라스트를 얻기 위해 조정 가능한 광원으로 사용할 수 있는 평평한 표면에 딤미가능 LED 패널을 배치하여 시작합니다. LED 패널에 100mm 페트리 접시 경기장을 놓습니다. 경기장 위의 링 스탠드에 카메라를 장착하고 필요에 따라 위치, 높이 및 초점을 조정하여 전체 경기장이 시야 에 중심을 두고 초점을 맞춥니다.적절한 노출 매체의 약 25밀리리터로 경기장을 채우고, LED 패널을 켜고, 기록 품질에 부정적인 영향을 줄 수 있는 다른 광원을 끕니다. 전사 파이펫을 사용하여 경기장 중앙에 평면을 떨어 뜨립니다. 화학 용액을 테스트 할 때, 화학 물질의 농도가 크게 변경되지 않도록 가능한 한 평면 수의 작은 평면을 전송합니다.네이티브 피지 형식으로 이미지 시퀀스로 데이터를 기록하기 시작합니다. 글라이딩 실험의 경우, 스크런치 또는 연동 실험을 위해 1~2분 동안 미끄러지기 동작을 기록하여 직선으로 발생하는 최소 3회 연속 진동을 캡처할 수 있을 만큼 충분히 길게 기록합니다. 실험이 완료되면 레코딩을 종료합니다.플래니언이 종료 기준을 충족하지 않고 경기장 경계에 도달하면, 플래니언을 경기장 중앙으로 되돌려 보라고 한다. 피지에서 실험에 대 한 원시 이미지 시퀀스를 열고 8 비트로 변환 하 고 이미지 시퀀스를 통해 팬 이미지 스택의 하단에 화살표 도구 또는 슬라이더를 사용 하 여. 기간 및 관심 영역을 추출하려면 직사각형 도구를 사용하여 평면주의의 전체 경로를 포괄하는 관심 영역을 그립니다.이미지 스택을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 중복을 선택하고 중복 스택이 있는 상자를 선택합니다. 관심 시퀀스의 첫 번째 및 마지막 프레임을 입력하고 확인을 클릭합니다. 글라이딩 실험을 위해, 평면이 스크런치 또는 연무 실험을 위해 신체 길이의 적어도 두 배 이상 이동하는 글라이딩 기간을 추출하십시오.평면이 최소 3회 연속및 완전한 신체 진동을 직선으로 거치면 인스턴스를 추출합니다. 중복된 이미지 스택에 임계값을 적용하여 이미지를 비나이즈화하고 백그라운드에서 평면을 추출하고 슬라이딩 바를 조정하여 전체 평면주의가 빨간색으로 강조 표시되도록 합니다. 정확한 값은 이미징 품질에 따라 다릅니다.어두운 배경에 대 한 상자를 두고 히스토그램을 스택 하 고 범위를 선택 취소 하지 마십시오. 이미지 스택을 스크롤하여 임계값 범위가 좋은지 확인한 다음 적용을 클릭합니다. 변환 스택에서 이진 창으로 메서드를 기본값으로 설정하고 배경을 라이트로 설정합니다.이 창의 모든 확인란을 선택 취소한 다음 확인을 클릭합니다. 흰색 배경에 검은 색 평면을 보여주는 바이나드 이미지가 나타납니다. 전체 평면주의가 이미지 시퀀스의 모든 프레임에 표시되는지 확인합니다.분석 및 설정 측정을 클릭하여 측정을 설정합니다. 영역, 질량 중심, 스택 위치 및 타원에 맞게 상자를 확인한 다음 확인을 클릭합니다. 열린 이미지 스택을 선택하고 분석하고 입자를 분석합니다.분석 파티클 창에서 표시 및 마스크를 선택하여 선택한 매개 변수로 감지된 모든 개체를 보여주는 새 스택을 엽니다. 평면의 대략적인 영역을 입력하여 원치 않는 소음을 제거하기 위해 크기 필터를 설정합니다. 그런 다음 표시 결과에 대한 상자를 확인하고 결과를 취소하고 확인을 클릭합니다.패널 하단의 슬라이더를 사용하여 마스크 이미지 스택을 통과하여 플래너리가 없는 소음이나 프레임이 없는지 확인합니다. 결과 창에서 파일을 사용하여 데이터를 저장하고 저장하고, CSV 확장을 파일 이름에 추가하여 쉼표 분리값으로 데이터를 저장합니다. 이미지 스택에 대한 데이터가 저장되면 각 이미지 스택 결과및 마스크 창을 닫습니다.유해 한 온도를 통해 scrunching을 유도 하려면, 뜨거운 접시에 65 섭씨에 유리 비커에 위평면 물을 가열. 경기장 중앙에 평면을 놓고 똑바로 세우고 글라이딩을 시작할 때까지 기다린 다음 녹음을 시작합니다. P 200 파이펫을 사용하여 예열된 평면 수의 100 마이크로리터를 천천히 일관되게 피펫하고, 물두를 플래나리안의 꼬리 끝에 포스트하여 스크런치를 유도합니다.녹화를 중지, 한 번 스크런치가 중단되었습니다. 플래너리안을 복구 용기에 넣고 페트리 접시에 더 많은 실험을 하면 신선한 실온 플라나리안 워터로 미디어를 교환합니다. 절단을 통해 스크런치를 유도하기 위해, 경기장의 중심으로 평면을 전송하고 평면 오리엔트 자체가 똑바로 똑바로 시작하고 글라이딩을 시작할 때까지 기다립니다.그런 다음 녹음을 시작하고 깨끗한 면도날로 평면을 절단합니다. 실험 전반에 걸쳐 절단 위치가 일관되도록 합니다. 전방 조각이 스크런치를 중단하면 녹음을 중지합니다.두 조각을 제거하고 별도의 용기에 넣고 7 일 동안 재생 할 수 있습니다. 절단 된 평면도는 재생되면 홈 컨테이너에 다시 통합 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 UV 광 노출 근처 여부를 테스트하는 데 사용되었다, S.mediterranea와 D.japonica planarians에서 스크런치를 유도, D.japonica planarians scrunch, UV 빛 근처에 노출 될 때, S.mediterranea planarians 꼬리 숱이 또는 응답을 전시.적어도 3개의 연속 직선 스크런치를 전시한 D.japonica planarians에 대한 스크런치 매개변수의 정량화는 이 종에 대한 특성 스런치 매개변수를 드러내며, 이 종에 대한 특성을 드러내는 250 마이크로몰라 계피알데히드 알 수 없는 TRPA 의 한 가지 작용제는 생쥐에서 분쇄및 S.mediterranea를 유발합니다. D.japonica 플래너리안은 미끄러지거나 격렬한 머리 회전으로 중단된 뱀과 진동 운동의 혼합물을 표시합니다. 적어도 3회 연속 진동을 가진 시료의 정량화는, 4개의 파라미터 중 3개에 대해 현저히 낮은 값을 산출한 다음 D.japonica에서 스크런치에 대해 예상되는 것으로 관찰된 진동 운동이 크런치되지 않음을 나타냅니다.RNAi는 S.지중해에서 계피 알데히드 노출에 대한 스크런치 및 반응의 특이성을 확인합니다. 플라나리안 물에 노출된 지 180초 만에 모든 제어 RNAi 플래나리안이 난항을 겪었다. SMTRPA 의 하나에 비해 한 RNAi 플래니안은 계피 알데히드에서 S.mediterranea 스크런치는 SMTRPA 하나를 필요로한다는 것을 보여주는.일관되고 소음을 줄이고 행동 측정에서 재현성을 보장하기 위해 동물을 조작하는 방법은 일관성을 유지해야 합니다. 이 프로젝트는 여기에 캡처되지 않은 다른 평면 행동의 식별 및 정량화를 허용하는 신체 모양 분석을 포함하도록 확장 될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

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연구

생물학

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