Name: analysis of somatic hypermutation in the jh4 intron of germinal center b cells from mouse peyer's patches
Uploaded: 2021-04-20T13:00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Somatic Hypermutation in the JH4 intron of Germinal Center B cells from Mouse Peyer's Patches at JoVE.com

نشكر تاسوكو هونجو على الإيدز-/- الفئران. وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني المعني بصحة الأقليات والتفاوتات الصحية (5G12MD007603)، والمعهد الوطني للسرطان (2U54CA132378)، والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (1SC1GM132035-01).

تم الحفاظ على جميع الفئران المتحولة على خلفية C57BL/6. تم استخدام الفئران الذكور والإناث المطابقة للعمر (2-5 أشهر) لجميع التجارب. تم إجراء تربية الفئران وتجاربها وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها كلية مدينة نيويورك المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها.
1. تشريح بقع باير
<ol><li>القتل الرحيم الماوس مع 100٪ CO2 في 3 لتر / دقيقة لمدة 5 دقائق تليها خلع عنق الرحم لتأكيد الوفاة. تعقيم أدوات تشريح (مقص، ملقط، ملقط ناعم) واليدين قفاز مع الإيثانول 70٪.</li>
	<li>وضع الماوس على لوحة تشريح مع البطن المكشوفة. رش بسخاء جسم الماوس مع الإيثانول 70٪ قبل إجراء أي شقوق لتعقيم منطقة تشريح.</li>
	<li>إجراء شق في الجلد عبر البطن وإزالة الجلد من البطن عن طريق سحب في وقت واحد على كلا الجانبين من شق نحو الرأس والذيل باستخدام ملقط (أو معقمة, قفاز اليدين).</li>
	<li>دبوس أسفل الأطراف الأمامية والهندية من الماوس.</li>
	<li>قطع تجويف الصفاق مع مقص لفضح الأعضاء الداخلية.</li>
	<li>تحديد موقع الأمعاء الدقيقة بين المعدة وcaecum ("J" على شكل هيكل بالقرب من القولون). إزالة الأمعاء الدقيقة عن طريق قطع تحت المعدة وفوق caecum.</li>
	<li>إزالة أي النسيج الضام والدهون ربط طيات الأمعاء الدقيقة معا. ملاحظة: سيكون للدهون لون أبيض مميز، على عكس اللون الوردي للأمعاء الدقيقة.</li>
	<li>فحص السطح الخارجي للأمعاء الدقيقة لبقع باير (PPs) ، وهي صغيرة (~ 1 ملم) ، على شكل بيضاوي الهياكل التي تظهر بيضاء تحت طبقة رقيقة من الخلايا الظهارية الشفافة.</li>
	<li>استئصال بعناية جميع PP مرئية مع مقص. ملاحظة: ماوس واحد C57BL/6 البرية نوع (WT) يمكن أن تسفر عن PPs 4-8، في حين أن الماوس AID-/- سيكون 6-10 PPs.</li>
	<li>جمع PPs في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل الدقيقة التي تحتوي على 1 مل من العازلة FACS على الجليد. ملاحظة: يجب أن تغرق PP، في حين أن الدهون سوف تطفو على السطح ويمكن إزالتها.</li>
</ol>2. عزل الخلية ل FACS
<ol><li>ضع فلتر 40 ميكرومتر في طبق من 6 آبار مع 1 مل من العازلة الباردة (4 درجة مئوية) FACS.</li>
	<li>صب PPs من أنبوب 1.5 مل على مرشح.</li>
	<li>غسل أجهزة الكمبيوتر مع 1 مل من العازلة FACS الباردة، والتأكد من أنها دائما في السائل وعلى الجليد.</li>
	<li>استخدم الطرف المسطح من المكبس من حقنة 1 مل كحشرات لسحق PPs على الفلتر حتى يبقى النسيج الضام فقط على الفلتر.</li>
	<li>غسل مرشح ومغطاس مع 1 مل من العازلة FACS الباردة للافراج عن الخلايا في طبق البئر 6.</li>
	<li>جمع ~ 4 مل من الخلايا في العازلة FACS الباردة وتصفيتها من خلال أنبوب FACS غطاء مصفاة 40 ميكرومتر.</li>
	<li>غسل غطاء مصفاة مع 1 مل من العازلة FACS الباردة.</li>
	<li>بيليه الخلايا في 600 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي دلو يتأرجح.</li>
	<li>(ديكانت) العملاق.</li>
	<li>Resuspend الخلايا في 0.4 مل من العازلة FACS الباردة.</li>
	<li>إزالة 10 ميكرولتر لحساب الخلية للتحقق من العائد (نتوقع ~ 5 × 106 خلايا / الماوس، انظر الشكل 3A)</li>
	<li>تصفية الخلايا المتبقية من خلال غطاء مصفاة 40 ميكرومتر في أنبوب FACS والمضي قدما في تلطيخ لFACS.</li>
</ol>3. تلطيخ GCBCs ل FACS
<ol><li>إضافة كتلة Fc 1 ميكرولتر (CD16/CD32 غير موسم المضادة للفأرة) إلى تعليق الخلية 400 ميكرولتر ووضع الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة.</li>
	<li>إضافة 2 مل من العازلة FACS الباردة لغسل الخلايا.<ol>
<li>خلايا بيليه في 600 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق والتخلص من supernatant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspend الخلايا في 80 ميكرولتر من العازلة FACS الباردة.</li>
	<li>قم بإزالة 10 ميكرولتر من الخلايا من WT PP لكل عنصر تحكم في التلطيخ (4 في المجموع، بما في ذلك 3 عناصر تحكم واحدة للبقع وتحكم واحد غير ملطخ). اترك 40 ميكرولتر من WT PP للخطوة التالية. بدلا من ذلك، استخدم حبات التعويض لعناصر التحكم في التلطيخ.</li>
	<li>وصمة عار كل من العينات التجريبية (على سبيل المثال، WT و AID-/-) في 500 ميكرولتر من العازلة FACS الباردة مع 2.5 ميكرولتر من الفول السوداني agglutinin (PNA) البيوتين لمدة 15 دقيقة على الجليد.</li>
	<li>إضافة 2 مل من العازلة FACS الباردة لغسل الخلايا.<ol>
<li>خلايا بيليه في 600 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق والتخلص من supernatant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>وصمة عار كل عينة تجريبية مع 500 ميكرولتر من الكوكتيل في الظلام، على الجليد، لمدة 15 دقيقة (الجدول 1). تأكد من إعادة إنفاق الخلايا بالكامل في كوكتيل التلطيخ.</li>
	<li>إعداد ضوابط وصمة عار واحدة لمصفوفة التعويض.<ol>
<li>وصمة عار الخلايا في 500 ميكرولتر من العازلة FACS الباردة باستخدام التخفيفات المحددة في الجدول 2.</li>
		<li>احتضان ضوابط تلطيخ في الظلام، على الجليد، لمدة 15 دقيقة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إضافة 2 مل العازلة FACS الباردة لجميع الأنابيب في الخطوتين 3.7 و 3.8، بيليه الخلايا، وتجاهل supernatant لغسل الأجسام المضادة غير المنضمة أو DAPI.</li>
	<li>Resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر من العازلة FACS الباردة ومكان على الجليد.</li>
	<li>باستخدام فرز الخلية، وجمع B220+السلطةالوطنية الفلسطينية مرحبا من كل عينة تجريبية ملطخة. ويبين الشكل 3 باء النسب المئوية النموذجية ل B220+ السلطةالوطنية الفلسطينية HI التي تم الحصول عليها من WT و AID-/- PPs. يعرض الشكل 3C استراتيجية gating FACS.</li>
</ol>4. استخراج الحمض النووي من GCBCs
<ol><li>بيليه فرز الخلايا في 600 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق والتخلص من supernatant.</li>
	<li>إعادة تشغيل الخلايا في 1 مل من العازلة FACS الباردة ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل.<ol>
<li>بيليه الخلايا في 600 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق والتخلص من supernatant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر من الحمض النووي استخراج العازلة و 5 ميكرولتر من 20 ملغ / مل بروتيناز K.</li>
	<li>حضانة عند 56 درجة مئوية بين عشية وضحاها.</li>
	<li>الحمض النووي الراسب مع 500 ميكرولتر ايزوبروبانول و 1 ميكرولتر من 20 ملغ / مل الجليكوجين. خلط أنبوب جيدا عن طريق عكس 5-6x.</li>
	<li>احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.</li>
	<li>جهاز طرد مركزي في جهاز طرد مركزي صغير لمدة 15 دقيقة عند 25 درجة مئوية عند 21,000 x g.<ol>
<li>تجاهل supernatant والاحتفاظ بيليه، الذي يحتوي على الحمض النووي عجلت والجليكوجين.</li>
	</ol>
</li>
	<li>غسل بيليه الحمض النووي مع 1 مل من الإيثانول 70٪.<ol>
<li>بيليه الحمض النووي في جهاز الطرد المركزي الدقيق لمدة 10 دقائق في 25 درجة مئوية في 21،000 × ز.
</li>
		<li>إزالة الإيثانول 70٪ والهواء الجاف بيليه الحمض النووي لمدة 5-10 دقيقة. ملاحظة: تجنب الإفراط في التجفيف لأن الحمض النووي قد لا يتجدد تماما.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspend الحمض النووي في 30 ميكرولتر TE العازلة واحتضان بين عشية وضحاها في 56 درجة مئوية.</li>
</ol>5. JH4 التضخيم تسلسل intron وتحليل
<ol><li>قياس الحمض النووي عن طريق قياس الامتصاص على طول موجي يبلغ 260 نانومتر (A260). ملاحظة: التركيز النموذجي للحمض النووي المسترد من B220 مفروز+PNAHI GCBCs من الماوس C57BL/6 هو 20-40 نانوغرام / ميكرولتر.</li>
	<li>تنفيذ PCR المتداخلة للإنترون JH4 (الجدول 3، الجدول 4). تطبيع الكمية الإجمالية للحمض النووي الجينومي المستخدم في أول PCR إلى العينة الأقل تركيزا. (على سبيل المثال، إذا كانت العينة الأقل تركيزا هي 5 نانوغرام/ميكرولتر، استخدم 58.75 نانوغرام من الحمض النووي لجميع العينات في الحجم الأقصى للمياه (11.75 ميكرولتر) في #1 PCR).</li>
	<li>حل المنتج PCR على هلام agarose 1.5٪ في 200 V لمدة 20 دقيقة. حجم amplicon المتوقع هو 580 نقطة أساس.</li>
	<li>استئصال أمبليكون من هلام واستخراج الحمض النووي باستخدام عدة استخراج هلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر الشكل التكميلي 1).<ol>
<li>Elute الحمض النووي مع 30 ميكرولتر من الماء وتحديد كمية الحمض النووي عن طريق قياس A260. ملاحظة: التركيز النموذجي للمنتج PCR المنقى هو 3-10 نانوغرام / ميكرولتر.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ligate المنتج PCR المنقى في البلازميد مع نهايات حادة. توحيد المبلغ الإجمالي لمنتج PCR المستخدم في كل تفاعل ربط(الجدول 5).<ol>
<li>احتضان رد فعل الربط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق أو بين عشية وضحاها عند 16 درجة مئوية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تحويل الخلايا البكتيرية الكهربائية المنافسة مع 2 ميكرولتر من رد فعل الربط.<ol>
<li>الكتروبورات عند 1.65 كيلو فولت.</li>
		<li>الإنقاذ في 600 ميكرولتر من وسائل الإعلام SOC لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز في 225 دورة في الدقيقة.</li>
		<li>لوحة 100 ميكرولتر من البكتيريا المحولة على LB تكملها لوحات أجار ampicillin (100 ميكروغرام / مل) واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تقديم لوحة من المستعمرات البكتيرية لتسلسل سانجر باستخدام التمهيدي T7 إلى الأمام. بدلا من ذلك، تنمو الثقافات بين عشية وضحاها من كل مستعمرة بكتيرية وأداء تنقية البلازميد.<ol>
<li>إذا لزم الأمر، كرر PCR، ربط، و / أو التحول لتحسين غلة المستعمرات البكتيرية ملاحظة: يجب اختيار ما لا يقل عن 30 مستعمرة من كل لوحة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>توحيد بيانات التسلسل في ملفات .txt<ol>
<li>حذف تسلسل البلازميد.</li>
		<li>تأكد من أن كل تسلسل موجه من 5' إلى 3 ' وفقا للتسلسل المرجعي ل JH4 intron (NG_005838). توليد تكملة عكسية من أي تسلسل، حسب الضرورة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>قم بمحاذاة التسلسلات التي تم الحصول عليها لكل PCR مقابل التسلسل المرجعي ل JH4 intron (NG_005838) باستخدام برنامج Clustal Omega (الشكل 4A).<ol>
<li>تحديد الاختلافات من التسلسل المرجعي كطفرات</li>
		<li>تحقق من أن جميع الطفرات هي طفرات نقطة حقيقية من خلال فحص electropherogram من تسلسل سانجر. تكرار التسلسل إذا لزم الأمر. (الشكل 4B, C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>جدولة وقياس الطفرات الفريدة في intron JH4 لكل نوع جيني (الشكل 5).<ol>
<li>تسلسل العد مع الطفرات متطابقة مرة واحدة فقط ملاحظة: من غير الممكن تحديد ما إذا كانت التسلسلات متطابقة تم إنشاؤها أثناء PCR أو أحداث SHM متطابقة في خلايا B مختلفة.</li>
		<li>عد كل حالة من WT الجرثومية JH4 تسلسل intron (أي تلك التي لا توجد طفرات) لتسلسل فريد من نوعه.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

إن توصيف SHM داخل تسلسل ترميز IgH و IgL V لمحتوى الخلية B غير المتجانس يمثل تحديا ، نظرا لأن كل خلية B تعيد تنظيم شرائح ترميز V بشكل فريد أثناء إعادة دمج V(D)J34. في هذه الورقة، نصف طريقة لتحديد الطفرات في إنترون JH4 من GCBCs. وJH4 intron، الذي يقع 3 'من الجزء الأخير J الترميز في مكان IgH، ويستخدم كبديل لSHM من المناطق V (الشكل 1)31،33،34،35. لفهرسة هذه الطفرات intron JH4 وتقييم كيفية الجينات محددة تؤثر على إنتاج أو نمط الطفرات، يتم تحليل PP GCBCs على وجه التحديد. هذه الخلايا تتراكم JH4 intron الطفرات نتيجة للتحفيز المزمن عن طريق الكائنات الحية المجهرية المعوية53. وعلاوة على ذلك، فإن B220+PNAHI GCBCs من أجهزة الكمبيوتر من الفئران غير المحصنة لديها أطياف الطفرة التي تقارن مع GCBCs splenic من الحيوانات المحصنة54،55. ومع ذلك، لا يمكن ربط الطفرات في intron JH4 إلى نضوج تقارب Ig لأن هذه الطفرات هي غير الترميز.
لتحديد ما إذا كان SHM يغير تقارب Ig ، يجب تحصين الفئران intraperitoneally مع مستضد ، مثل NP (4-hydroxy-3-nitrophenylacetyl) المقترنة CGG (الدجاج غاما الجلوبيولين) أو KLH (ثقب المفتاح limpet hemocyanin)56. في وقت لاحق، يمكن تنقية مرنا من B220 splenic+السلطة الوطنيةالفلسطينية مرحبا GCBCs لفحص SHM داخل VH186.2، V الترميز exon أن يعترف في معظم الأحيان NP وتحور بعد NP-CGG أو NP-KLH التحصين31،57،58،59،60. وقد تميزت طفرة من التربتوفان-33 إلى اليوسين في VH186.2 لزيادة تقارب Ig تصل إلى 10 أضعاف59,60، وبالتالي, مؤشر واحد أن SHM واختيار كلون قد ولدت تقارب عالية Ig. قياس NP7- و NP20 محددة مصل Ig titers بواسطة ELISA وحساب نسبة NP7/NP20 محددة Ig أثناء التطعيم وثائق أيضا Ig تقارب النضج الناتج عن SHM من المناطق V17,21,36. يمكن استخدام كل من هذه المقايسات لربط SHM داخل تسلسل الترميز VH186.2 مع التغييرات في نضج تقارب Ig الخاص ب NP.
وسواء استخدمت الحيوانات المحصنة أو غير المحصنة لتحليل SHM من VH186.2 أو إنترون JH4، يجب تحديد GCBCs بدقة. نحن نقدم نهجا قائما على FACS لعزل B220+PNAHI GCBCs. بدلا من ذلك، Fas وغير كبريتات α2-6-sialyl-LacNAc مستضد، والتي يتم التعرف عليها من قبل الأجسام المضادة GL761،62،63،64، ويمكن أيضا أن تستخدم لعزل GCBCs، والتي يتم تحديدها على أنها B220 + Fas+GL7+65 أو CD19 + Fas+GL7+37. GL7 التعبير يعكس عن كثب السلطة الوطنية الفلسطينية في GCBCs تنشيط الغدد الليمفاوية64،65،66. بالإضافة إلى استخدام علامات الأجسام المضادة الخاصة ب GCBCs ، يجب أن تزيد كوكتيلات التلطيخ من إثارة الفلوروفور والكشف عن علامة بيولوجية مع تقليل التداخل الطيفي لانبعاثات الفلورسينس. وينبغي الكشف عن المستضدات التي أعرب عنها في مستويات منخفضة مع الأجسام المضادة التي يتم اقترانها إلى fluorophore مع مضان الانبعاثات قوية67. تم تحسين بروتوكول التلطيخ الموصى به للتحليل على فرز الخلايا المجهز بأربعة أشعة ليزر (405nm و 488nm و 561nm و 633nm) و 12 مرشحات؛ ومع ذلك، تختلف تكوينات التصفية وتوافر الليزر بين مقاييس الخلايا. لتعديل البروتوكول وفقا للكواشف وتوافر المعدات ، يشار القارئ إلى موارد إضافية ، مشاهدي الطيف على الإنترنت ونشر الأدب67،68،69،70،71،72،73. يتطلب بروتوكول التلطيخ متعدد الألوان الموصوف هنا تعويضا عن التداخل الطيفي لضمان أن مجموعات الخلايا المفرزة هي GCBCs بدلا من الكشف غير الدقيق عن انبعاثات الفلورسينس. B220 بمثابة عنصر تحكم تلطيخ مفيدة ل FACS وصفها (الجدول 1B) لأن PPs سيكون لها مجموعات مميزة B220 السلبية والإيجابية (الشكل 3C)، والذي يسمح بالتعويض المناسب من التداخل الطيفي. وينبغي استخدام استراتيجية الصياغة الواردة في الشكل 3C كمبدأ توجيهي. قد تختلف مؤامرات قياس التدفق الخلوي اعتمادا على ظروف التلطيخ وإعدادات قياس الخلايا. ومع ذلك، ينبغي أن يكون 4-10٪ من الخلايا الحية B220+السلطةالوطنية الفلسطينية HI 35، 52.
يجب التحقق من صحة جميع الطفرات داخل intron JH4 من PP GCBCs لضمان أن الطفرات الملاحظة تعكس حقا SHM وليس قطعة أثرية من PCR أو التسلسل. AID-/- يمكن أن تكون الخلايا B بمثابة عنصر تحكم سلبي مفيد عند فحص النمط الظاهري SHM في نماذج الماوس المتحولة الأخرى لأن هذه الخلايا لا يمكن إكمال SHM17،19. معدل طفرة intron JH4 في الإيدز-/- GCBCs (1.66x10-5 الطفرات / bp)20،21،36،37،38،5 0،74 هو مماثل لمعدل الخطأ من البوليميراز عالية الدقة (5.3x10-7 الفرعية / قاعدة / مضاعفة)51،52 التي تستخدم لتضخيم الحمض النووي في PCR المتداخلة. إذا لم تتوفر أجهزة AID-/- الفئران، فقارن نمط الطفرات الملحوظة وتكرارها بالأدبيات المنشورة. تتراكم مناطق Ig V 10-3 -10-4 طفرات لكل قسم ثنائي أساسي ، وهو ما يزيد بنحو 106أضعاف عن معدل طفرة اللوتشي الجيني الآخر73،75. قد تختلف النتائج مع عمر الحيوان76. بدلا من ذلك، B220+PNALO الخلايا، الذي يمثل غير GCBCs، يمكن استخدامها كسيطرة سلبية في غياب الإيدز-/- الفئران52. إذا كان تردد الطفرة في WT GCBCs أقل من المتوقع، قد يتم تمثيل تسلسل الجراثيم WT JH4 intronic بشكل غير متناسب. في هذه الحالة، تأكد من أن GCBCs كانت ملطخة وفرزها بشكل مناسب ومركبات ثنائي الفينيل متعدد الكلور خالية من التلوث بالجراثيم WT JH4 intron. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي تحليل بيانات التسلسل الخام في الكتروفيروغرام بدقة للتأكد من أن الطفرات في بيانات نص التسلسل ليست قطعا أثرية من أخطاء التسلسل. على سبيل المثال، قد تقلل نتائج تسلسل Sanger الرديئة من موثوقية بيانات التسلسل(الشكل 4). هذا التحكم في جودة بيانات تسلسل سانجر سيزيد من دقة والاستنساخ لتحليل طفرة intron JH4.

الخلايا B, أعضاء الجهاز المناعي التكيفي, التعرف على والقضاء على المستضدات عن طريق إنتاج الأجسام المضادة, المعروف أيضا باسم الغلوبولين المناعي (Ig). ويتكون كل Ig من اثنين من الثقيلة (IgH) واثنين من الضوء (IgL) سلسلة polypeptides, التي عقدت معا من قبل السندات ثنائي الكبريتيد لتشكيل بنية الشكل المميز "Y" من Ig1. وN-termini من IgH وIgL تشمل منطقة متغير (V) من كل بوليبتيد ومعا أنها تشكل موقع ملزم مستضد من Ig، في حين أن المنطقة المستمرة من IgH يضفي وظيفة التأثير من Ig. تطوير الخلايا B في نخاع العظام إعادة ترتيب exons الترميز الخامس من IgH وIgL في عملية تعرف باسم V (D)Jإعادةالتركيب 2،3،4. النسخ من exons V المؤتلفة، إلى جانب exons المنطقة الثابتة المعنية، يشكل ميرنا التي تترجم إلى Ig.
الخلايا الناضجة B التي تعبر عن غشاء ملزم Ig ، المعروف أيضا باسم مستقبلات الخلايا B (BCR) ، تدور على الأعضاء اللمفاوية الثانوية ، مثل الطحال أو العقدة الليمفاوية أو بقع باير ، حيث تقوم بمسح البيئة للمستضدات والتفاعل مع الخلايا الأخرى في الجهاز المناعي1. داخل المراكز الجرثومية (GC) من الأعضاء اللمفاوية الثانوية ، تصبح الخلايا B التي تتعرف على المستضد من خلال BCR نشطة. بمساعدة الخلايا التشعبية الجريبية والخلايا التائية الجريبية المساعد ، يمكن للخلايا B المنشطة أن تتكاثر وتفرق إلى خلايا البلازما والذاكرة ، والتي هي من التأثيرات الهامة للاستجابة المناعية القوية5و6و7و8و9. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تخضع هذه الخلايا B المنشطة لعمليات تنويع الجينات الثانوية Ig - إعادة دمج تبديل الفئة (CSR) والتبدل الجسدي (SHM). أثناء المسؤولية الاجتماعية للشركات، تبادل الخلايا B المنطقة الافتراضية μ ثابت من البوليبتيد IgH مع منطقة ثابتة أخرى (γ، α، ε) من خلال رد فعل حذف الحمض النووي إعادة التركيب(الشكل 1). وهذا يسمح للتعبير عن exon ثابت مختلفة وترجمة Ig جديدة. سوف تتحول الخلية B من التعبير عن IgM إلى نوع متساوي آخر (IgG، IgA، IgE). المسؤولية الاجتماعية للشركات يغير وظيفة التأثير من Ig دون تغيير خصوصية مستضدلها 10،11،12. ومع ذلك ، خلال SHM ، تحور الخلايا B مناطق الترميز V من IgH و IgL لتمكين إنتاج واختيار Igs تقارب أعلى ، والتي يمكن أن تقضي بشكل أكثر فعالية على مستضد13،14،15 ( الشكل1). الأهم من ذلك، كل من المسؤولية الاجتماعية للشركات وSHM تعتمد على وظيفة إنزيم واحد: تنشيط الناجم عن السيتيدين deaminase (الإيدز)16،17،18. البشر والفئران ناقصة في الإيدز لا يمكن إكمال المسؤولية الاجتماعية للشركات أو SHM والحاضر مع ارتفاع الثدي مصل IgM أو Hyper-IgM17,19.
في المسؤولية الاجتماعية للشركات، AID deaminates deoxycytidines (C) في مناطق التبديل المتكررة التي تسبق كل exons الترميز المستمر، وتحويلها إلى deoxyuridines (U)20،21،مما يخلق الاقتران قاعدة غير متطابقة بين deoxyuridines وdoxyguanosines (U:G). يتم تحويل هذه عدم التطابق U:G إلى فواصل الحمض النووي مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل، وهي مطلوبة لإعادة دمج الحمض النووي، إما عن طريق إصلاح الختان الأساسي (BER) أو إصلاح عدم التطابق (MMR) المسار22،23،24،25،26،27،28،29. في SHM، المعونة deaminates C داخل exons الترميز الخامس. النسخ المتماثل عبر عدم التطابق U:G يولد C:G إلى T:A الطفرات الانتقالية, في حين أن إزالة قاعدة uracil من قبل بروتين BER, uracil الحمض النووي جليكوسيلاز (UNG), قبل تكرار الحمض النووي تنتج كل من الانتقال والتحول الطفرات16. طفرات فارغة في UNG زيادة كبيرة C:G إلى T:A الطفرات الانتقالية21,22. وعلى غرار المسؤولية الاجتماعية للشركات، تتطلب SHM الأدوار التكميلية ل MMR و BER. خلال SHM، يولد MMR الطفرات في أزواج قاعدة A:T. تعطيل الطفرات في MutS homology 2 (MSH2) أو بوليمرات الحمض النووي η (Polη) يقلل بشكل كبير من الطفرات في قواعد A:T والطفرات المركبة في MSH2 وبوله يلغي تقريبا الطفرات في قواعد A:T21,30,31. بما يتفق مع الدور الحاسم ل BER وMMR في تحويل U الناتج عن الإيدز إلى طفرات انتقالية أو متحولة ، تعرض الفئران الناقصة لكل من MSH2 و UNG(MSH2-/-UNG-/-) فقط C:G إلى T:A الطفرات الانتقالية الناتجة عن النسخ المتماثل عبر عدم تطابق U:G21.
تحليل SHM في مناطق الترميز الخامس لا يزال معقدا لأن تطوير الخلايا B يمكن إعادة دمج أي من V (D)J الترميز exons في IgH وIgL loci1،2،4. تحليل دقيق لهذه المناطق V recombined فريدة من نوعها وتحور جسديا يتطلب تحديد وعزل استنساخ الخلايا B أو الجيش الملكي النيبالي Ig11،13. وJH4 intron، الذي هو 3 'من exon الترميز J الماضي في مكان IgH، يؤوي الطفرات الجسدية بسبب انتشار الطفرات 3' من V المروج32،33،34، وبالتالي يستخدم في كثير من الأحيان كعلامة بديلة لSHM في المناطق V31،35 ( الشكل1). لتوضيح تجريبيا كيف جينات محددة أو الطفرات الوراثية تغيير أنماط SHM أو معدلات, يمكن تسلسل intron JH4 من بقع باير (PP) الخلايا B المركز الجرثومي (GCBCs), التي تخضع لمعدلات عالية من SHM36,37,38. يمكن التعرف على GCBCs بسهولة وعزلها مع الأجسام المضادة المقترنة فلوريا ضد علامات سطح الخلية (B220+PNAHI)17،39.
يتم تقديم بروتوكول مفصل لتوصيف الطفرات intron JH4 في PP GCBCs من الفئران باستخدام مزيج من FACS (تفلورسينس تنشيط فرز الخلايا)، PCR، وتسلسل سانجر(الشكل 2).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 ml PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, mixed</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-4708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-eFluor780 anti-CD45R/B220</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-0452-80</td>
			<td>clone RA3-6B2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD</td>
			<td>643186</td>
			<td>four lasers (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) and 12 filters (PacBlue (450/50), 
			AmCyan (502LP; 530/30), SSC (488/10), FITC (502LP; 530/30), PerCP-Cy5.5 (655LP; 695/40), 
			PE (585/15), PE-Texas Red (600LP; 610/20), PE-Cy5 (630LP; 670/14), PE-Cy7 (735LP; 780/60), APC (660/20), Alexa700 (710LP; 730/45), APC-Cy7 (755LP; 780/60))</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD slip tip 1mL syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated peanut agglutinin (PNA)</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>B-1075-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Falcon test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>0.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0447L</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ElectroMAX DH10B competent cells</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>18-290-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon cell strainer 40mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom polystyrene tubes (FACS tubes)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom polystyrene tubes (capped)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>149591A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>R&#38;D Systems (Atlanta Biologicals)</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco phosphate buffered saline PBS pH 7.4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene Molecular Biology (MegAlign Pro)</td>
			<td>DNA Star</td>
			<td></td>
			<td>version 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-CD45R/B220</td>
			<td>BD</td>
			<td>553090</td>
			<td>clone RA3-6B2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1700-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0491L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal-Rite 1.5mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin APC-eFluor 780 Conjugate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M020L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific CloneJET PCR Cloning Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>FERK1231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate 6 well</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlabeled anti-mouse CD16/CD32 (Fc block), BD</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BDB553142</td>
			<td>Clone 2.4G2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of somatic hypermutation in the jh4 intron of germinal center b cells from mouse peyer's patches

داخل المراكز الجرثومية للأعضاء اللمفاوية ، تغير الخلايا B الناضجة الغلوبولين المناعي المعبر عنه (Ig) من خلال إدخال طفرات غير مطلية في exons الترميز المتغير للسلسلة الجينية الثقيلة والخفيفة Ig loci. تتطلب عملية التبدل الجسدي هذه (SHM) أنزيم السيتيدين المستحث بالتنشيط deaminase (AID) ، والذي يحول deoxycytidines (C) ، إلى ديوكسيوريدينات (U). معالجة U:G الناتجة عن الإيدز عدم التطابق في الطفرات عن طريق مسارات إصلاح استئصال قاعدة وعدم التطابق يدخل تسلسل الترميز Ig الجديدة التي قد تنتج تقارب أعلى Ig. يمكن أن تمنع الطفرات في جينات إصلاح الإيدز أو الحمض النووي أو تغير بشكل كبير أنواع الطفرات التي لوحظت في Ig loci. نحن نصف بروتوكولا لقياس طفرات JH4 intron التي تستخدم فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) وPCR وتسلسل سانجر. على الرغم من أن هذا المقايسة لا تقيس بشكل مباشر نضوج تقارب Ig ، إلا أنها تشير إلى الطفرات في تسلسل الترميز المتغير Ig. بالإضافة إلى ذلك، تستخدم هذه الطرق تقنيات البيولوجيا الجزيئية الشائعة التي تحلل الطفرات في تسلسل Ig لاستنساخ خلايا B متعددة. وبالتالي، فإن هذا المقايسة هي أداة لا تقدر بثمن في دراسة تنويع SHM وIg.

قياس التدفق الخلوي الخلايا الناضجة B تعمم على المراكز الجرثومية حيث أنها تخضع لنضوج تقارب، والتوسع اللاستنساخي، والتمايز في خلايا البلازما أو الذاكرة40،41،42،43،44. ويمكن تحديد هذه GCBCs من قبل العديد من علامات سطح الخلية, بما في ذلك التعبير العالي عن مستقبلات CD45R/B220 وملزمة من agglutinin الفول السوداني (PNA)45,46. لعزل GCBCs المنشطة، كانت خلايا PP ملطخة بالأجسام المضادة المضادة B220 المرتبطة بالفيكوريثرين (PE) والبيوتينيلات-PNA، تليها ستريبتافيدين المقترنة APC-eFluor780. تم القضاء على الخلايا الميتة باستخدام الفلورسنت 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) صبغة, الذي يلطخ الحمض النووي من الخلايا المحتضرة أوالميتة 47,48. تم تحليل الخلايا الملطخة في وقت لاحق وفرزها عن طريق قياس التدفق الخلوي. تألفت PPs من ~ 80٪ B220+ خلايا49،50. WT PPs تحتوي على متوسط 4 × 106 خلايا لكل فأرة (الشكل 3A). وكان ما يقرب من 8٪ من خلايا WT PP B220+السلطة الوطنيةالفلسطينية HI، وهو نصف العدد الملاحظ في الإيدز-/ - ( الشكل3B). وهكذا، تم الحصول على 0.3-0.6 ×10 6 B220+PNAHI GCBCs بعد الفرز، والتي كانت كافية لتحليل الطفرات في intron JH4.
تحليل تسلسل JH4 تم تضخيم intron JH4 بواسطة PCR متداخلة باستخدام التمهيديات الأسرة VHJ558 المشتركة (J558FR3Fw وVHJ558.2) تليها JH4 intron تمتد التمهيديات VHJ558.3 وVHJ558.435،37. ومن بين 105 متواليات فريدة تم الحصول عليها من مركبات الكربون الكلورية فلورية WT GCBCs، تم العثور على ما مجموعه 226 طفرة(الشكل 5A). أظهر تحليل طيف طفرة GCBC في فئران WT مجموعة من التحولات والتحولات بمعدل 4 × 10-3 طفرات / bp ، والتي تم حسابها عن طريق قسمة العدد الإجمالي للقواعد المتحولة على العدد الإجمالي للقواعد التي تم تسلسلها32و36و37و38. بالإضافة إلى ذلك، كل JH4 PCR المنتج من WT GCBCs تحتوي على 1-25 الطفرات (الشكل 5B)، حيث تم العثور على طفرات متعددة في كثير من الأحيان على تسلسل واحد33،36. تم تحديد اثنين فقط من الطفرات في 113 AID-/- تسلسل (الشكل 5A). الإيدز-/- أظهرت خلايا B 1.66 × 10-5 طفرات / bp ، والتي كانت أقل بكثير من خلايا WT B (p < 0.05)36 وتقارن بمعدل خطأ البوليميراز عالي الدقة (5.3 × 10-7 sub/base/doubling)51،52. وهكذا، عملت الخلايا AID-/- B كتحكم سلبي مفيد لهذا المقايسة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61551/61551fig01.jpg"> الشكل 1: تخطيطي لجراد الجينات IgH والمناطق التي تستهدفها المعونة خلال المسؤولية الاجتماعية للشركات وSHM. يشير الشريط الأحمر إلى intron JH4 580 bp الذي هو 3 ' من إعادة ترتيب VDJH4 ويتم تحليلها في هذا البروتوكول. في المسؤولية الاجتماعية للشركات، تشجع إزالة المخدرات المعتمدة على الإيدز في مناطق التبديل الإلكتروني (Sμ و Sε) على تشكيل DSB الذي يسمح بإعادة التركيب المحذوف والتعبير عن نوع جديد من الأجسام المضادة (IgM to IgE). خلال SHM، تتراكم مناطق V (الصناديق الرمادية) الطفرات (الخطوط الزرقاء) التي قد تؤدي إلى تقارب أعلى Ig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61551/61551fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61551/61551fig02.jpg"> الشكل 2: سير العمل لتحليل SHM من intron JH4 في GCBCs معزولة عن PPs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61551/61551fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61551/61551fig03.jpg"> الشكل 3: توصيف المركبات الكيميائية العالمية PP. (أ)العدد الإجمالي لخلايا PP من WT و AID-/- الفئران (n = 4 لكل نمط جيني). تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري عن الوسط. (ب) النسبة المئوية ل B220+PNAHI GCBCs التي تم الحصول عليها من PPs من WT و AID-/- الفئران (n = 4 لكل نمط جيني)36. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري عن المتوسط، *p<0.05 باستخدام اختبار t للطالب. (ج) مخططات FACS التمثيلية لفرز B220+PNAHI GCBCs من أجهزة الكمبيوتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61551/61551fig03large.jpg" target="_blank">هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61551/61551fig04.jpg"> الشكل 4: تحليل بيانات تسلسل JH4 سانجر. (أ)نماذج من محاذاة تسلسل بيانات تسلسل سانجر لمنتج JH4 PCR من WT (أعلى) و AID-/- (أسفل) GCBCs إلى التسلسل الجينومي المرجعي (NG_005838) ، وهو التسلسل مباشرة تحت علامات التجزئة المرقم. تم إنشاء التحالفات باستخدام أوميغا كلوستال. (ب)Electropherogram من بيانات تسلسل سانجر عالية الجودة، والتي عرضت قمم متميزة لكل قاعدة. (ج)الكتروفيروغرام لبيانات التسلسل منخفضة الجودة، والتي أظهرت قمم غامضة وقواعد غير محددة (N). يجب أن يكون النيوكليوتيدات الموضحة باللون الأحمر مشروحة يدويا في الملف النصي التسلسلي.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61551/61551fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61551/61551fig05.jpg"> الشكل 5: تحليل الطفرات في إنترون JH4 في WT و AID-/- GCBCs. (أ)يتم تلخيص العدد الإجمالي للانتقال (الأحمر) والتحول (الأزرق) الطفرات في A، C، G، و T القواعد لكل النمط الجيني في الجداول. يشار إلى العدد الإجمالي للتسلسلات التي تم تحليلها أسفل الجدول. (ب)يتم تصوير عدد الطفرات لكل amplicon PCR لكل النمط الجيني في المخططات الدائرية. تم تعديل هذا الرقم من Choi et al.36 حقوق الطبع والنشر 2020. الرابطة الأمريكية لعلماء المناعة ، وشركة <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61551/61551fig05large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style="margin-bottom:0px;"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">كوكتيل تلطيخ لGCBCs</td>
			<td colspan="2">الحجم: 500 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>الأجسام المضادة أو صبغ</td>
			<td>فلوروفور</td>
			<td>التخفيف</td>
			<td>ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>B220</td>
			<td>PE</td>
			<td>1000</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>ستريبتافيدين</td>
			<td>APC-eفلور780</td>
			<td>500</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
			<td>N/A</td>
			<td>500</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: تلطيخ الكوكتيلات لGCBCs. تم استخدام مزيج من الأجسام المضادة المشار إليها أو الصبغة (المشار إليها بالخط المائل) في التخفيفات المحددة لتلطيخ خلايا PP في 500 ميكرولتر لقياس التدفق الخلوي.
   
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style="margin-bottom:0px;"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">بقع واحدة للتعويض</td>
			<td colspan="2">الحجم: 500 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>الأجسام المضادة أو صبغ</td>
			<td>فلوروفور</td>
			<td>التخفيف</td>
			<td>ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>B220</td>
			<td>PE</td>
			<td>1000</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>B220</td>
			<td>APC-eفلور780</td>
			<td>750</td>
			<td>0.67</td>
		</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
			<td>N/A</td>
			<td>500</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 2: ضوابط بقعة واحدة للتعويض. واستخدمت الأجسام المضادة B220 المترافقة مع الفلوروفوريس المشار إليها لضوابط وصمة عار واحدة للتعويض عن التداخل الطيفي.
   
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style="margin-bottom:0px;"><tbody>
<tr>
<td colspan="5">#1 PCR</td>
		</tr>
<tr>
<td>الكاشف</td>
			<td>حجم</td>
			<td colspan="3">ظروف دورة الحرارة</td>
		</tr>
<tr>
<td>5x المخزن المؤقت</td>
			<td>4 ميكرولتر</td>
			<td>1</td>
			<td>95 درجة مئوية</td>
			<td>3 دقائق</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mM dNTP</td>
			<td>2 ميكرولتر</td>
			<td>2</td>
			<td>94 درجة مئوية</td>
			<td>30 ثانية</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ميكرومتر J558FR3Fw</td>
			<td>1 ميكرولتر</td>
			<td>3</td>
			<td>55 درجة مئوية</td>
			<td>30 ثانية</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ميكرومتر VHJ558.2</td>
			<td>1 ميكرولتر</td>
			<td>4</td>
			<td>72 درجة مئوية</td>
			<td>1:30 دقيقة</td>
		</tr>
<tr>
<td>بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة</td>
			<td>0.25 ميكرولتر</td>
			<td colspan="3" rowspan="2">دورة 2-4 9x</td>
		</tr>
<tr>
<td>دنا</td>
			<td>x (توحيد العينة الأقل تركيزا)</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>إلى 20 ميكرولتر</td>
			<td>5</td>
			<td>72 درجة مئوية</td>
			<td>5 دقائق</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">تمييع PCR المنتج 1:5 في H2O قبل الشروع في PCR #2</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 3: PCR المتداخلة من intron JH4. مكونات PCR وظروف الترموسيكلر لأول تفاعل تضخيم. تمييع أول منتج PCR 1:5 بالماء واستخدام 1 ميكرولتر من هذا التخفيف لPCR الثاني.
   
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style="margin-bottom:0px;"><tbody>
<tr>
<td colspan="5">#2 PCR</td>
		</tr>
<tr>
<td>الكاشف</td>
			<td>حجم</td>
			<td colspan="3">ظروف دورة الحرارة #2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5x المخزن المؤقت</td>
			<td>4 ميكرولتر</td>
			<td>1</td>
			<td>94 درجة مئوية</td>
			<td>3 دقائق</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mM dNTP</td>
			<td>2 ميكرولتر</td>
			<td>2</td>
			<td>94 درجة مئوية</td>
			<td>30 ثانية</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ميكرومتر VHJ558.3</td>
			<td>1 ميكرولتر</td>
			<td>3</td>
			<td>55 درجة مئوية</td>
			<td>30 ثانية</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ميكرومتر VHJ558.4</td>
			<td>1 ميكرولتر</td>
			<td>4</td>
			<td>72 درجة مئوية</td>
			<td>30 ثانية</td>
		</tr>
<tr>
<td>بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة</td>
			<td>0.25 ميكرولتر</td>
			<td colspan="3" rowspan="2">دورة 2-4 21x</td>
		</tr>
<tr>
<td>المخفف PCR # 1</td>
			<td>1 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>إلى 20 ميكرولتر</td>
			<td>5</td>
			<td>72 درجة مئوية</td>
			<td>5 دقائق</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 4: مكونات PCR وظروف دورة الحرارة ل PCR الثاني.
   
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style="margin-bottom:0px;"><tbody>
<tr>
<td>الكاشف</td>
			<td>حجم</td>
		</tr>
<tr>
<td>2x المخزن المؤقت</td>
			<td>10 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>جهاز PCR منقى</td>
			<td>x (توحيد العينة الأقل تركيزا)</td>
		</tr>
<tr>
<td>بلازميد مع نهايات حادة</td>
			<td>1 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>T4 الحمض النووي ليغاز</td>
			<td>1 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>إلى 20 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق أو بين عشية وضحاها في 16ºC</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 5: رد فعل الربط. مكونات ربط من تنقية JH4 intron PCR المنتج في البلازميد.
   
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style="margin-bottom:0px;"><tbody>
<tr>
<td>المخزن المؤقت ل FACS</td>
		</tr>
<tr>
<td>الحرارة تعطيل FBS في 56 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة قبل الاستخدام. ملحق برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4 (جيبكو، #10010049) مع 2.5٪ (v/v) من FBS المعطل حراريا. يخزن عند درجة حرارة 4°C.</td>
		</tr>
<tr>
<td>مخزن استخراج الحمض النووي (100 mM Tris pH 8.0, 0.1 M EDTA, 0.5٪ (ث/v) SDS)</td>
		</tr>
<tr>
<td>أضف 50 مل من 1 M Tris pH 8.0 و 100mL من 0.5 M EDTA و 12.5 مل من 20٪ SDS. أضف الماء المقطر إلى 500 مل. تخزين في درجة حرارة الغرفة.</td>
		</tr>
<tr>
<td>TE المخزن المؤقت (10 mM تريس pH 8.0، 1 mM EDTA)</td>
		</tr>
<tr>
<td>أضف 2.5 مل من 1 M Tris pH 8.0 و 500 مل من 0.5 M EDTA. أضف الماء المقطر إلى 250 مل. تخزين في درجة حرارة الغرفة.</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 6: وصفات العازلة.
   
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style="margin-bottom:0px;"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">قائمة أوليغونوكليوتيدات</td>
		</tr>
<tr>
<td>J558FR3Fw</td>
			<td colspan="2">5'-GCCTGACATCTGAGGACTCTGC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>VHJ558.2</td>
			<td colspan="2">5'-CTGGACTTTCGGTGGTGGTG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>VHJ558.3</td>
			<td colspan="2">5'-GGTCAAGGAACCTCAGTCA-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>VHJ558.4</td>
			<td colspan="2">5'-تكتاغاكاجاكاكتاك-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 7: أوليغونوكليوتيدات المستخدمة في المقايسة.
   
الشكل التكميلي 1: صورة هلام الآغاروز التمثيلية بعد الانتهاء من الخطوة 5.4. تم حل المنتج JH4 إينترون PCR المتداخلة على هلام agarose 1.5٪ وتم استئصال amplicon 580 bp. WT PP يشير إلى أن WT PP GCBC الحمض النووي الجينومي كان يستخدم كنموذج لأول PCR والإيدز PP يشير إلى أن AID-/- PP GCBC الحمض النووي الجينومي تم استخدامه كنموذج لأول PCR. ɸ يشير إلى عدم وجود عنصر تحكم PCR قالب و - يشير إلى أنه لم يتم تحميل أي شيء في بئر هلام agarose. الممر الأخير يظهر سلم الحمض النووي 100 نقطة أساس. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61551/61551supfig01.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Somatic Hypermutation in the JH4 intron of Germinal Center B cells from Mouse Peyer's Patches at JoVE.com

Analysis of Somatic Hypermutation in the JH4 intron of Germinal Center B cells from Mouse Peyer's Patches

هنا هو المقايسة لتحديد التبدل الجسدي داخل الغلوبولين المناعي الثقيلة سلسلة جراد الجينات باستخدام الخلايا B مركز الجرثومية من بقع باير الماوس.

تحليل Hypermutation الجسدية في intron JH4 من الخلايا B مركز الجرثومية من بقع باير ماوس

Within the germinal centers of lymphoid organs, mature B cells alter their expressed immunoglobulin (Ig) by introducing untemplated mutations into the ...

يسمح هذا البروتوكول للمستخدمين بدراسة كيفية إنتاج الجهاز المناعي لأجسام مضادة لمسببات الأمراض أو الميكروبات كومنسال. بالإضافة إلى ذلك، يمكن دراسة المسارات الجزيئية التي تنظم تنويع الجينات المناعية باستخدام الفئران المعدلة وراثيا. يستخدم البروتوكول مزيجا من تقنيات البيولوجيا الجزيئية الشائعة بما في ذلك تسلسل PCR وSanger ولا يتطلب فرز خلية واحدة أو تسلسلا عميقا.يمكن الخلط بسهولة بقع باير مع الأنسجة الدهنية المحيطة بها. لذلك قد يكون العرض البصري لهذه الطريقة مفيدا لأولئك الذين ليسوا على دراية بهذا الجهاز لتحديد موقعه ومراقبة تشريحه. ابدأ بوضع الماوس على لوحة التشريح مع تعرض البطن.رش بسخاء جسم الماوس مع 70٪ الإيثانول قبل إجراء أي شقوق لتعقيم منطقة تشريح. إجراء شق في الجلد عبر البطن وسحب في وقت واحد على جانبي الشق مع الأصابع أو ملقط. ثم قطع تجويف الصفاق مع مقص لفضح الأعضاء الداخلية.تحديد موقع الأمعاء الدقيقة وإزالتها عن طريق قطع تحت المعدة وفوق ال cecum. إزالة أي النسيج الضام والدهون ربط طيات الأمعاء الدقيقة معا. فحص السطح الخارجي للأمعاء الدقيقة لبقع باير، وهي هياكل بيضاوية الشكل صغيرة تظهر بيضاء تحت طبقة رقيقة من الخلايا الظهارية الشفافة.اقتطع بعناية جميع بقع باير المرئية بمقص واجمعها في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على ملليلتر واحد من عازل FACS على الجليد. إذا كانت الأنسجة التي تم جمعها تغرق إلى أسفل الأنبوب ، فهي في الواقع رقعة باير وليس الأنسجة الدهنية. ضع مرشح 40 ميكرو متر في طبق بئر ستة مع ملليلتر واحد من العازلة FACS الباردة، ثم صب بقع باير من أنبوب 1.5 ملليلتر على المرشح.استخدام نهاية مسطحة من المكبس من حقنة ملليلتر واحد كحشرات لسحق بقع باير على مرشح حتى يبقى فقط النسيج الضام. اغسل الفلتر والمغطاس مع ملليلتر واحد من العازلة FACS الباردة لإطلاق سراح الخلايا في طبق البئر الستة. جمع الخلايا وتصفية لهم من خلال 40 ميكرومتر مصفاة كاب FACS أنبوب.ثم غسل غطاء مصفاة مع ملليلتر واحد من العازلة FACS الباردة. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي لهم في 600G في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. ثم decant العملاقة وإعادة إنفاق الخلايا في 0.4 ملليلتر من العازلة FACS الباردة مع كتلة FC.احتضان العينات على الجليد لمدة 15 دقيقة ثم غسل بيليه الخلايا. لتلطيخ الخلايا B مركز Germinal أو GCBCs، resuspend خلايا النوع البري في 80 ميكرولتر من العازلة FACS. إزالة 10 ميكرولتر من الخلايا من بقع نوع البرية باير لكل عنصر تحكم تلطيخ.ترك 40 ميكرولتر من تعليق الخلية للعينات التجريبية. بدلا من ذلك، استخدم حبات التعويض لعناصر التحكم في التلطيخ. وصمة عار كل من العينات التجريبية في 500 ميكرولتر من العازلة FACS الباردة مع 2.5 ميكرولتر من البيوتين PNA لمدة 15 دقيقة على الجليد.ثم غسل خلايا بقع السلطة الوطنية الفلسطينية. وصمة عار كل عينة مع 500 ميكرولتر من كوكتيل GCBC في الظلام وعلى الجليد لمدة 15 دقيقة، والتأكد من أن يتم إعادة إنفاق الخلايا بالكامل في الكوكتيل. لإعداد عناصر تحكم وصمة عار واحدة لمصفوفة التعويض، وصمة عار الخلايا في 500 ميكرولتر من العازلة FACS الباردة باستخدام التخفيف المحدد في النص.احتضان ضوابط تلطيخ في الظلام على الجليد لمدة 15 دقيقة. إضافة اثنين من ملليلتر من العازلة FACS الباردة لغسل جميع عينات وصمة عار والضوابط. بيليه الخلايا والتخلص من supernatant قبل إعادة تعليق الخلايا في حجم نهائي من 500 ميكرولتر من العازلة FACS الباردة لتشغيل على مقياس الخلايا.ثم، استخدم مفرز الخلية لجمع B220 إيجابية الخلايا العالية السلطة الوطنية الفلسطينية من كل عينة تجريبية ملطخة. لاستخراج الحمض النووي من الخلايا B مركز Germinal أو GCBCs، resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر من الحمض النووي استخراج العازلة وخمسة ميكرولتر من بروتيناز K.Then يعجل الحمض النووي مع 500 ميكرولتر من الايزوبروبانول وميكرولتر واحد من الجليكوجين. وخلط الأنبوب جيدا عن طريق عكس ذلك خمس أو ست مرات.بعد احتضان العينة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، طارد مركزي لمدة 15 دقيقة في 21، 000G و 25 درجة مئوية. التخلص من supernatant وغسل بيليه الحمض النووي مع ملليلتر واحد من الإيثانول 70٪. طرد الحمض النووي في 21، 000G لمدة 10 دقائق، ثم إزالة الإيثانول والهواء الجاف بيليه لمدة خمس إلى 10 دقائق.Resuspend الحمض النووي في 30 ميكرولتر من العازلة TE واحتضانه بين عشية وضحاها في 56 درجة مئوية. تنفيذ PCR المتداخلة ل JH4 Intron. تطبيع الكمية الإجمالية للحمض النووي الجينومي المستخدم في أول PCR إلى العينة الأقل تركيزا.بعد تشغيل منتجات PCR على هلام، واستئصال أمبليكون وتنقية مع عدة استخراج هلام. ثم رفع دعوى على amplicon إلى بلازميد وتحويل الخلايا البكتيرية الكهربائية المختصة مع اثنين من microliters من رد فعل الربط. Electroporate الخلايا في 1.65 كيلوفولت وانقاذهم في 600 ميكرولتر من وسائل الإعلام SOC لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز في 225 دورة في الدقيقة.لوحة 100 ميكرولتر من البكتيريا المحولة على لوحات أجار LB تكملها أمبيسلين واحتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. تسلسل الحمض النووي البلازما من المستعمرات البكتيرية ومحاذاة التسلسلات التي تم الحصول عليها لكل PCR ضد تسلسل مرجعي JH4 Intron باستخدام برنامج أوميغا كلوستال. تحديد الاختلافات من التسلسل المرجعي كطفرات.تم التعرف على الخلايا B مركز Germinal عن طريق قياس التعبير عن مستقبلات B220 وملزمة من agglutinin الفول السوداني. كانت بقع باير البرية تحتوي على متوسط 4 ملايين خلية لكل فأر. وحوالي 8٪ من الخلايا كانت B220 إيجابية السلطة الوطنية الفلسطينية عالية وهو نصف تلك التي لوحظت في الفئران خروج المغلوب الإيدز.من بين 105 تسلسلات فريدة تم الحصول عليها من خلايا المركز الجرثومي البري B ، تم العثور على ما مجموعه 226 طفرة. وأظهر تحليل طيف الطفرات مجموعة من التحولات والإصدارات العابرة بمعدل أربعة أضعاف 10 إلى الطفرات الثالثة السلبية لكل زوج أساسي. تم تحديد طفرتين فقط في 113 تسلسل خروج المغلوب الإيدز.بالإضافة إلى ذلك، كل منتج JH4 PCR من نوع البرية Germinal مركز B الخلايا، تحتوي على واحد إلى 25 الطفرات مع طفرات متعددة وجدت في كثير من الأحيان على تسلسل واحد. عند محاولة هذا البروتوكول، تذكر أن تبقي الخلايا على الجليد للحفاظ على صلاحية الخلية. بعد تلطيخ الخلايا، والحفاظ على الخلايا في الظلام لمنع photobleaching الفلوروفوريس.لربط فرط التبدل الجسدي مع نضوج تقارب الأجسام المضادة ، نوصي باستخدام بروتوكول التحصين والححوص عن تزازات الأجسام المضادة المحددة وطفرات منطقة V.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

تقييم Hypermutation الجسدية في خلايا B راموس بعد Overexpression أو ضربة قاضية لجينات معينة

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

عزل والخلايا اللمفاوية المناعية والخلايا الجذعية من الفئران باير لالرقع

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

تقييم تطوير خلايا الفئران الجذعية بلازماوية في بقع باير طريق نقل بالتبني من أسلاف المكونة للدم

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

تحليل السريع للشذوذ الكروموسومات في الخلايا الليمفاوية B الماوس بواسطة PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

اشتقاق خلايا T<em&gt; في المختبر</em&gt; من الفأر الجنينية الخلايا الجذعية

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

كشف صحيح فريق الخبراء الحكومي الدولي، معربا عن ماوس B خلايا سلالته

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

الجيل المؤتلف الإنسان مفتش حيدة النسيلة من مخلد خلايا التصنيف B

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من الخلايا المناعية من الدماغ الدماغية ماوس

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

كشف وإثراء نادر محددة مستضد الخلايا B لتحليل النمط الظاهري وظيفة

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

تحليل القص الناجمة عن تدفق الهجرة من المنطقة الهامشية الفاري ب الخلايا في المختبر

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...