Name: analysis of somatic hypermutation in the jh4 intron of germinal center b cells from mouse peyer's patches
Uploaded: 2021-04-20T13:00:00
Duration: 9 min 35 s
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हम सहायताके लिए Tasuku Honjo शुक्रिया अदाकरते हैं-/चूहों । इस काम को राष्ट्रीय अल्पसंख्यक स्वास्थ्य और स्वास्थ्य असमानताओं पर संस्थान (5G12MD007603), राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (2U54CA132378), और राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान (1SC1GM132035-01) द्वारा समर्थित किया गया था ।

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

एक विषम बी सेल आबादी के आईजीएच और आईजीएल वी कोडिंग दृश्यों के भीतर एसएचएम की विशेषता एक चुनौती प्रस्तुत करती है, यह देखते हुए कि प्रत्येक बी सेल विशिष्ट रूप से वी (डी) जे पुनर्संयोजन34के दौरान वी कोडिंग सेगमेंट को पुनर्गठित करता है। इस पेपर में, हम जीसीबीसी के जेएच4 इंस्टट्रॉन में म्यूटेशन की पहचान करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। जेएच4 इंट्रॉन,जो आईजीएच लोकस में अंतिम जे कोडिंग सेगमेंट के 3' स्थित है, का उपयोग वीक्षेत्रों(चित्रा 1)33, 34, 35)के एसएचएम के लिए किराए के रूप में कियाजाताहै। इन JH4 intron म्यूटेशन सूची और कैसे विशिष्ट जीन उत्पादन या उत्परिवर्तन के पैटर्न को प्रभावित करने का आकलन करने के लिए, पीपी GCBCs विशेष रूप से विश्लेषण कर रहे हैं । ये कोशिकाएं आंतों के माइक्रोबायोटा53द्वारा पुरानी उत्तेजना के परिणामस्वरूप जेएच4 इंट्रॉन म्यूटेशन जमा करती हैं । इसके अलावा, असंरक्षित चूहों के पीपीएस से बी 220+पीएनएएचआई जीसीबीसी में एक उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रा होता है जो प्रतिरक्षित जानवरों54,55से प्लीहा जीसीबीसी की तुलना करता है। हालांकि, JH4 intron में म्यूटेशन आईजी आत्मीयता परिपक्वता से सहसंबद्ध नहीं किया जा सकता है क्योंकि इन उत्परिवर्तनों गैर कोडिंग कर रहे हैं ।
यह निर्धारित करने के लिए कि क्या एसएचएम आईजी आत्मीयता को बदल देता है, चूहों को एक एंटीजन के साथ इंट्रापेरिटी रूप से प्रतिरक्षित किया जाना चाहिए, जैसे एनपी (4-हाइड्रोक्सी-3-निट्रोफेनिलेटाइल) सीजीजी (चिकन गामा ग्लोबुलिन) या केएलएच (कीहोल लिम्पेट हेमोकिनोइन)56से संयुगत किया गया। इसके बाद, एमआरएन कोवीएच186.2 के भीतर एसएचएम की जांच करने के लिए प्लीहा बी 220+पीएनएएच जीआईसीबीसी से शुद्ध किया जा सकता है, वी कोडिंग एक्सोन जो अक्सर एनपी को पहचानता है और एनपी-सीजीजी या एनपी-केएलएच प्रतिरक्षण31, 57,58,59,60के बाद उत्परिवर्तितहोताहै। वीएच186.2 में एक ल्यूसिन के लिए ट्रिप्टोफान-33 का उत्परिवर्तन 10 गुना59,60 तक आईजी आत्मीयता बढ़ाने की विशेषता है और इसलिए, एक संकेतक है कि एसएचएम और क्लोनल चयन ने उच्च आत्मीयता आईजी उत्पन्न की है। एलिसा द्वारा NP7 और NP20-विशिष्ट सीरम आईजी टाइटर्स को मापने और प्रतिरक्षण के दौरान आईजी-विशिष्ट NP7/NP20 अनुपात की गणना करने के साथ ही आईजी आत्मीयता परिपक्वता भी दस्तावेज करता है जिसके परिणामस्वरूप वी क्षेत्रों के एसएचएम17,21,36होते हैं। इन दोनों परख का उपयोग एनपी-विशिष्ट आईजी आत्मीयता परिपक्वता में परिवर्तन के साथ वीएच186.2 कोडिंग दृश्यों के भीतर एसएचएम को सहसंबंधित करने के लिए किया जा सकता है।
चाहे प्रतिरक्षित या असंरक्षित जानवरों का उपयोग वीएच186.2 या जेएच4 आईएनट्रॉन के एसएचएम का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है, जीसीबीसी की सही पहचान की जानी चाहिए। हम B220+PNA HI GCBCs को अलग करने के लिए एक FACS आधारित दृष्टिकोण पेशकरते हैं। वैकल्पिक रूप से, FAs और गैर-सल्फेट α2-6-sialyl-LacNAc एंटीजन, जोGL7 एंटीबॉडी61, 62,63,64द्वारा मान्यता प्राप्त है, का उपयोग जीसीबीसी को अलग करने के लिए भी किया जा सकता है, जिनकी पहचान बी 220 + फास + जीएल 7+ 65 या सीडी 19 + फास+GL7+ 37के रूप में की जाती है। GL7 अभिव्यक्ति लिम्फ नोड्स64 , 65,66के सक्रिय जीसीबीसी में पीएनए को बारीकी से प्रतिबिंबित करती है। जीसीबीसी के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी मार्कर का उपयोग करने के अलावा, धुंधला कॉकटेल फ्लोरोफोर की उत्तेजन को अधिकतम करना चाहिए और फ्लोरोसेंस उत्सर्जन के स्पेक्ट्रल ओवरलैप को कम करते हुए बायोमार्कर का पता लगाना चाहिए। निम्न स्तर पर व्यक्त किए गए एंटीजन का पता एंटीबॉडी से लगाया जाना चाहिए जो फ्लोरोफोर के साथ एक मजबूत उत्सर्जन फ्लोरेसेंस67के साथ संयुग्मित है। अनुशंसित धुंधला प्रोटोकॉल चार लेजर (405एनएम, 488एनएम, 561एनएम, 633एनएम) और 12 फिल्टर से लैस सेल सॉर्टर पर विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया गया था; हालांकि, फिल्टर कॉन्फ़िगरेशन और लेजर उपलब्धता साइटोमीटर के बीच भिन्न होती है। रिएजेंट और उपकरण उपलब्धता के अनुसार प्रोटोकॉल में संशोधन करने के लिए, पाठक को अतिरिक्त संसाधनों, ऑनलाइन स्पेक्ट्रम दर्शकों और प्रकाशित साहित्य67, 68,69, 70,71,72,73केलिए संदर्भित कियाजाताहै। यहां वर्णित बहु-रंग धुंधला प्रोटोकॉल को यह सुनिश्चित करने के लिए स्पेक्ट्रल ओवरलैप के मुआवजे की आवश्यकता होती है कि फ्लोरेसेंस उत्सर्जन का गलत पता लगाने के बजाय सॉर्ट सेल आबादी जीसीबीसी हैं। B220 वर्णित FACS(तालिका 1B)के लिए एक उपयोगी धुंधला नियंत्रण के रूप में कार्य करता है क्योंकि पीपीएस विशिष्ट B220 नकारात्मक और सकारात्मकआबादी (चित्रा 3 सी),जो स्पेक्ट्रल ओवरलैप के उचित मुआवजे के लिए अनुमति देता है होगा । चित्रा 3सी में प्रस्तुत गेटिंग रणनीति को दिशानिर्देश के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। फ्लो साइटोमेट्री प्लॉट धुंधला स्थितियों और साइटोमीटर सेटिंग्स के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। फिर भी, जीवित कोशिकाओं का 4-10% B220+PNAHI 35, 52होना चाहिए।
पीपी जीसीबीसी के जेएच4 इंट्रॉन के भीतर सभी म्यूटेशन को यह सुनिश्चित करने के लिए मान्य किया जाना चाहिए कि मनाया गया उत्परिवर्तन वास्तव में एसएचएम को प्रतिबिंबित कर रहे हैं न कि पीसीआर या अनुक्रमण का एक विरूपण। सहायता-/-बी कोशिकाएं अन्य उत्परिवर्ती माउस मॉडलों में एसएचएम फेनोटाइप की जांच करते समय एक उपयोगी नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम कर सकती हैं क्योंकि ये कोशिकाएं एसएचएम17, 19को पूरा नहीं करसकतीं। सहायता-/जीसीबीसी (1.66x10 -5 म्यूटेशन/बीपी)20, 21,36, 37, 38,50,74 उच्च निष्ठा बहुलक (5.3x10-7 उप/आधार/दोहरीकरण)51, 52है कि नेस्टेड पीसीआर में डीएनए बढ़ाना करने के लिए प्रयोग कियाजाता है की त्रुटि दर के बराबर है। यदि सहायता-/-चूहों उपलब्ध नहीं हैं, तो प्रकाशित साहित्य के लिए मनाया उत्परिवर्तन पैटर्न और आवृत्ति की तुलना करें । आईजी वी क्षेत्रों में आधार जोड़ी प्रभाग प्रति 10-3-10 -4 म्यूटेशन जमा होते हैं, जो अन्य जीन लोकी73, 75की उत्परिवर्तन दर से लगभग 106गुना अधिक है। परिणाम पशु76की आयु के साथ भिन्न हो सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, B220+PNAलो कोशिकाओं, जो गैर-GCBCs को चिह्नित करता है, सहायताके अभाव में नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकताहै-/-चूहों ५२। यदि डब्ल्यूटी जीसीबीसी में उत्परिवर्तन आवृत्ति अपेक्षा से कम है, तो डब्ल्यूटी जर्मलाइन जेएच4 इनट्रॉनिक अनुक्रम का असंगत रूप से प्रतिनिधित्व किया जा सकता है। इस मामले में, यह सुनिश्चित करें कि जीसीबीसी को दाग दिया गया और उचित रूप से हल किया गया और पीसीआर डब्ल्यूटी जर्मलाइन जेएच4 इंट्रॉन संदूषण से मुक्त हैं। इसके अतिरिक्त, इलेक्ट्रोफेरोग्राम में कच्चे अनुक्रमण डेटा का अच्छी तरह से विश्लेषण किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि अनुक्रम पाठ डेटा में उत्परिवर्तन अनुक्रमण त्रुटियों की कलाकृतियां नहीं हैं । उदाहरण के लिए, खराब सेंगर अनुक्रमण परिणाम अनुक्रम डेटा(चित्र 4)की विश्वसनीयता को कम कर सकते हैं। सेंगर सीक्वेंस डेटा का यह गुणवत्ता नियंत्रण जेएच4 इंट्रॉन उत्परिवर्तन विश्लेषण की सटीकता और प्रजनन क्षमता में वृद्धि करेगा।

बी कोशिकाओं, अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के सदस्यों, पहचान और एंटीबॉडी, भी इम्यूनोग्लोबुलिन (आईजी) के रूप में जाना जाता है उत्पादन द्वारा एंटीजन को खत्म । प्रत्येक आईजी दो भारी (आईजीएच) और दो प्रकाश (आईजीएल) चेन पॉलीपेप्टाइड्स से बना है, जो आईजी1की विशेषता "वाई" आकार संरचना बनाने के लिए डिसल्फाइड बांड द्वारा एक साथ आयोजित किए जाते हैं। आईजीएच और आईजीएल की एन-टर्मिनी में प्रत्येक पॉलीपेप्टाइड का वेरिएबल (वी) क्षेत्र शामिल है और एक साथ वे आईजी की एंटीजन बाध्यकारी साइट बनाते हैं, जबकि आईजीएच का निरंतर क्षेत्र आईजी के प्रभावक कार्य को प्रदान करता है। बोन मैरो में बी कोशिकाओं का विकास आईजीएच और आईजीएल के वी कोडिंग एक्सन को वी (डी) जे रिकॉम्बिनेशन2, 3, 4के नाम से जानाजाताहै । पुनः संमिलित वी एक्सोन्स का प्रतिलेखन, संबंधित निरंतर क्षेत्र exons के साथ मिलकर, एमआरएनए को आईजी में अनुवादित करता है।
परिपक्व बी कोशिकाएं एक झिल्ली बाध्य आईजी को व्यक्त करती हैं, जिसे बी सेल रिसेप्टर (बीसीआर) के रूप में भी जाना जाता है, माध्यमिक लिम्फोइड अंगों, जैसे तिल्ली, लिम्फ नोड, या पीयर के पैच में प्रसारित होते हैं, जहां वे एंटीजन के लिए पर्यावरण का सर्वेक्षण करते हैं और प्रतिरक्षा प्रणाली की अन्य कोशिकाओं के साथ बातचीत करते हैं1। माध्यमिक लिम्फाइड अंगों के अंकुरण केंद्रों (जीसी) के भीतर, बी कोशिकाएं जो बीसीआर के माध्यम से एंटीजन को पहचानती हैं, सक्रिय हो जाती हैं। कूप डेंड्रिटिक कोशिकाओं और कूप सहायक टी कोशिकाओं द्वारा सहायता प्राप्त, सक्रिय बी कोशिकाएं तब प्लाज्मा और स्मृति कोशिकाओं में पैदा और अंतर कर सकती हैं, जोएक मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया5,6,7,8, 9के महत्वपूर्ण प्रभावक हैं। इसके अतिरिक्त, ये सक्रिय बी कोशिकाएं माध्यमिक आईजी जीन विविधीकरण प्रक्रियाओं से गुजर सकती हैं - क्लास स्विच रिकॉम्बेशन (सीएसआर) और दैहिक हाइपरम्यूटेशन (एसएचएम)। सीएसआर के दौरान, बी कोशिकाएं डीएनए विलोपन-पुनर्संयोजन प्रतिक्रिया(चित्रा 1)के माध्यम से एक और निरंतर क्षेत्र (γ, α, ε) के साथ आईजीएच पॉलीपेप्टाइड के डिफ़ॉल्ट μ निरंतर क्षेत्र का आदान-प्रदान करती हैं। यह एक अलग निरंतर exon और एक नए पुलिस महानिरीक्षक के अनुवाद की अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है। बी सेल आईजीएम को दूसरे आइसोटाइप (आईजीजी, आईजीए, आईजीई) में व्यक्त करने से स्विच करेगा। सीएसआर अपनी एंटीजन विशिष्टता 10 ,11,12में फेरबदल किए बिना आईजी के प्रभावक कार्य में परिवर्तन करता है । हालांकि, एसएचएम के दौरान, बी कोशिकाएं आईजीएच और आईजीएल के वी कोडिंग क्षेत्रों को म्यूट करती हैं ताकि उच्च आत्मीयता आईजी के उत्पादन और चयन को सक्षम किया जा सके, जोएंटीजन13, 14,15(चित्रा 1)को अधिक प्रभावी ढंग से समाप्त कर सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि सीएसआर और एसएचएम दोनों एक एंजाइम के कार्य पर निर्भर करते हैं: सक्रियण-प्रेरित साइटिडीन डेमिनास (सहायता)16,17,18। सहायता में मनुष्यों और चूहों की कमी सीएसआर या एसएचएम को पूरा नहीं कर सकती है और ऊंचा आईजीएम सीरम टाइटर्स या हाइपर-आईजीएम17, 19के साथ मौजूद है।
सीएसआर में, सहायता दोहराव वाले स्विच क्षेत्रों में deoxycytidines (सी) को deaminates करता है जो प्रत्येक निरंतर कोडिंग एक्सोन से पहले, उन्हें deoxyuridines (यू)20,21में परिवर्तित करता है, जो डेऑक्सीयूरिडिन्स और डिऑक्सीगुआनोसिन्सिन (यू:जी) के बीच बेमेल आधार बांधना बनाता है । ये यू: जी बेमेल जो डीएनए पुनर्संयोजन के लिए आवश्यक हैं, या तो बेस एक्सिशन रिपेयर (बीईआर) या बेमेल रिपेयर (एमएमआर) मार्ग22,23,24,25, 26,27,28,29। एसएचएम में, वी कोडिंग एक्सन के भीतर सहायता सी को कम करता है। यू भर में प्रतिकृति: जी बेमेल सी उत्पन्न करता है: जी से टी: एक संक्रमण उत्परिवर्तन, जबकि BER प्रोटीन, uracil डीएनए ग्लाइकोसिलेज (UNG) द्वारा uracil आधार को हटाने, डीएनए प्रतिकृति से पहले दोनों संक्रमण और ट्रांसवर्सेशन म्यूटेशन16पैदा करता है । UNG में नल उत्परिवर्तन काफी सी: जी से टी के लिए वृद्धि: एक संक्रमण उत्परिवर्तन21,22। सीएसआर के समान, एसएचएम को एमएमआर और बीईआर की पूरक भूमिकाओं की आवश्यकता होती है। एसएचएम के दौरान, एमएमआर ए:टी बेस जोड़े में म्यूटेशन उत्पन्न करता है। म्यूट्स होमोलॉजी 2(एमईएसएच2)या डीएनए पॉलीमरेज η(Polη)में निष्क्रिय उत्परिवर्तन एमईएसएच 2 में ए:टी बेस और यौगिक उत्परिवर्तनों में काफी कमी करता है और Polη ए: टी बेस21,30, 31पर म्यूटेशन को लगभग समाप्त करता है। सहायता जनित यू को संक्रमण या ट्रांस्बर्नेस म्यूटेशन में बदलने में बीईआर और एमएमआर के लिए महत्वपूर्ण भूमिका के अनुरूप, MSH2 और UNG दोनों के लिए चूहों की कमी (MSH2-/-UNG-/-) केवल सी: जी से टी: एक संक्रमण म्यूटेशन यू भर में प्रतिकृति के परिणामस्वरूप प्रदर्शित: जी बेमेल 21।
वी कोडिंग क्षेत्रों में एसएचएम का विश्लेषण जटिल बना हुआ है क्योंकि बी कोशिकाओं के विकास से आईजीएच और आईजीएल लोकी 1,2,4में वी (डी) जे कोडिंग एक्सोन में से किसी को फिर से मिलाया जा सकता है। इन विशिष्ट रूप से पुनः संयोजन और दैहिक रूप से उत्परिवर्तित वी क्षेत्रों के सटीक विश्लेषण के लिए बी कोशिकाओं या आईजी एमआरएनए11,13के क्लोनों की पहचान और अलगाव की आवश्यकता होती है । जेएच4 इंट्रॉन, जो आईजीएच लोकस में अंतिम जे कोडिंग एक्सोन का 3' है, वी प्रमोटर32,33, 34 के म्यूटेशन 3 के प्रसार के कारण दैहिक उत्परिवर्तनों को बंदरगाह करता है और इसलिए अक्सर वी क्षेत्रों में एसएचएम के लिए सरोगेट मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है31,35 (चित्रा 1)। प्रयोगात्मक रूप से स्पष्ट करने के लिए कि कैसे विशिष्ट जीन या आनुवंशिक उत्परिवर्तन एसएचएम पैटर्न या दरों को बदलते हैं, जेएच4 इंट्रॉन को पेयर के पैच (पीपी) अंकुरित केंद्र बी कोशिकाओं (जीसीबीसी) से अनुक्रमित किया जा सकता है, जो एसएचएम36, 37,38की उच्च दरों से गुजरता है। जीसीबीसी को कोशिका सतह मार्कर (B220+PNAHI)17,39के खिलाफ फ्लोरोसेंट रूप से संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ आसानी से पहचाना और अलग किया जा सकता है।
एफएसीएस (फ्लोरेसेंस एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग), पीसीआर और सेंगर सीक्वेंसिंग(चित्रा 2)के संयोजन का उपयोग करके चूहों से पीपी जीसीबीसी में JH4 इंट्रॉन म्यूटेशन की विशेषता के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 ml PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, mixed</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-4708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-eFluor780 anti-CD45R/B220</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-0452-80</td>
			<td>clone RA3-6B2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD</td>
			<td>643186</td>
			<td>four lasers (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) and 12 filters (PacBlue (450/50), 
			AmCyan (502LP; 530/30), SSC (488/10), FITC (502LP; 530/30), PerCP-Cy5.5 (655LP; 695/40), 
			PE (585/15), PE-Texas Red (600LP; 610/20), PE-Cy5 (630LP; 670/14), PE-Cy7 (735LP; 780/60), APC (660/20), Alexa700 (710LP; 730/45), APC-Cy7 (755LP; 780/60))</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD slip tip 1mL syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated peanut agglutinin (PNA)</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>B-1075-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Falcon test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>0.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0447L</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ElectroMAX DH10B competent cells</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>18-290-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon cell strainer 40mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom polystyrene tubes (FACS tubes)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom polystyrene tubes (capped)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>149591A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>R&#38;D Systems (Atlanta Biologicals)</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco phosphate buffered saline PBS pH 7.4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene Molecular Biology (MegAlign Pro)</td>
			<td>DNA Star</td>
			<td></td>
			<td>version 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-CD45R/B220</td>
			<td>BD</td>
			<td>553090</td>
			<td>clone RA3-6B2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1700-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0491L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal-Rite 1.5mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin APC-eFluor 780 Conjugate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M020L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific CloneJET PCR Cloning Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>FERK1231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate 6 well</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlabeled anti-mouse CD16/CD32 (Fc block), BD</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BDB553142</td>
			<td>Clone 2.4G2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of somatic hypermutation in the jh4 intron of germinal center b cells from mouse peyer's patches

लिम्फोइड अंगों के अंकुरित केंद्रों के भीतर, परिपक्व बी कोशिकाएं आईजी भारी और प्रकाश श्रृंखला जीन लोकी के चर कोडिंग एक्सोन में अनटेम्पेड म्यूटेशन शुरू करके अपने व्यक्त इम्यूनोग्लोबुलिन (आईजी) को बदल देती हैं। दैहिक हाइपरम्यूटेशन (एसएचएम) की इस प्रक्रिया के लिए एंजाइम एक्टिवेशन-प्रेरित साइटिडीन डेमिनास (ईडी) की आवश्यकता होती है, जो डीऑक्सीसाइटिडिन्स (सी) को डिऑक्सी ऑरिडिडिन्स (यू) में परिवर्तित करता है। एड-जनित यू:जी बेमेल को आधार एक्सिशन और बेमेल मरम्मत मार्गों द्वारा म्यूटेशन में संसाधित करना नए आईजी कोडिंग दृश्यों का परिचय देता है जो उच्च आत्मीयता आईजी का उत्पादन कर सकते हैं। सहायता या डीएनए मरम्मत जीन में उत्परिवर्तन आईजी लोकी में देखे गए म्यूटेशन के प्रकारों को अवरुद्ध या काफी बदल सकते हैं। हम जेएच4 इनट्रॉन म्यूटेशन की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई (FACS), पीसीआर और सेंगर अनुक्रमण का उपयोग करता है। हालांकि यह परख सीधे आईजी आत्मीयता परिपक्वता को मापने नहीं है, यह आईजी चर कोडिंग दृश्यों में उत्परिवर्तन का संकेत है । इसके अतिरिक्त, ये विधियां सामान्य आणविक जीव विज्ञान तकनीकों का उपयोग करती हैं जो कई बी सेल क्लोन के आईजी दृश्यों में उत्परिवर्तन का विश्लेषण करती हैं। इस प्रकार, यह परख एसएचएम और आईजी विविधीकरण के अध्ययन में एक अमूल्य उपकरण है।

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Analysis of Somatic Hypermutation in the JH4 intron of Germinal Center B cells from Mouse Peyer's Patches

यहां प्रस्तुत माउस पेयर के पैच से अंकुरित केंद्र बी कोशिकाओं का उपयोग करके इम्यूनोग्लोबुलिन भारी श्रृंखला जीन लोकस के भीतर दैहिक हाइपरम्यूटेशन की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक परख है।

माउस पीयर के पैच से जर्मिनल सेंटर बी कोशिकाओं के जेएच4 इनट्रॉन में दैहिक हाइपरम्यूटेशन का विश्लेषण

Within the germinal centers of lymphoid organs, mature B cells alter their expressed immunoglobulin (Ig) by introducing untemplated mutations into the ...

यह प्रोटोकॉल उपयोगकर्ताओं को यह अध्ययन करने की अनुमति देता है कि प्रतिरक्षा प्रणाली रोगजनकों या कॉमेंसल रोगाणुओं के लिए एंटीबॉडी कैसे पैदा करती है। इसके अलावा, इम्यूनोग्लोबुलिन जीन विविधीकरण को विनियमित करने वाले आणविक मार्गों का आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों का उपयोग करके अध्ययन किया जा सकता है। प्रोटोकॉल पीसीआर और सेंगर अनुक्रमण सहित आम आणविक जीव विज्ञान तकनीकों के संयोजन का उपयोग करता है और एकल सेल छंटाई या गहरी अनुक्रमण की आवश्यकता नहीं है।पीयर के पैच को आसपास के फैट टिश्यू से आसानी से भ्रमित किया जा सकता है। इसलिए इस विधि का दृश्य प्रदर्शन उन लोगों के लिए उपयोगी हो सकता है जो इस अंग से अपरिचित हैं ताकि इसके स्थान की पहचान की जा सके और इसके विच्छेदन का निरीक्षण किया जा सके। पेट के सामने के साथ विच्छेदन पैड पर माउस बिछाने से शुरू करें।विच्छेदन क्षेत्र को स्टरलाइज करने के लिए किसी भी चीरे बनाने से पहले माउस के शरीर को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें। पेट के पार त्वचा में एक चीरा बनाओ और उंगलियों या संदंश के साथ चीरा के दोनों ओर एक साथ खींच। फिर आंतरिक अंगों को बेनकाब करने के लिए कैंची से पेरिटोनियल गुहा को काट लें।छोटी आंत का पता लगाएं और पेट के नीचे और सीकम के ऊपर काटकर उसे निकाल लें। छोटी आंत के गुंबदों को एक साथ जोड़ने वाले किसी भी कनेक्टिव ऊतक और वसा को हटा दें। पेयर के पैच के लिए छोटी आंत की बाहरी सतह की जांच करें, जो छोटे अंडाकार आकार की संरचनाएं हैं जो पारदर्शी एपिथेलियल कोशिकाओं की पतली परत के नीचे सफेद दिखाई देती हैं।ध्यान से कैंची के साथ सभी दिखाई है Peyer पैच आबकारी और बर्फ पर FACS बफर के एक मिलीलीटर युक्त एक १.५ मिलीलीटर माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब में इकट्ठा । यदि एकत्र ऊतक ट्यूब के नीचे तक डूब जाता है, तो यह वास्तव में एक पेयर का पैच है और वसा ऊतक नहीं है। ठंडे FACS बफर के एक मिलीलीटर के साथ एक छह अच्छी तरह से पकवान में एक ४० माइक्रो मीटर फिल्टर रखें, तो फिल्टर पर १.५ मिलीलीटर ट्यूब से है Peyer पैच डालना ।फिल्टर पर पीयर के पैच को कुचलने के लिए एक मिलीलीटर सिरिंज से एक मिलीलीटर सिरिंज से प्लंजर के सपाट अंत का उपयोग करें जब तक कि केवल संयोजी ऊतक ही नहीं रहता है। छह अच्छी तरह से पकवान में कोशिकाओं को छोड़ने के लिए ठंडे FACS बफर के एक मिलीलीटर के साथ फिल्टर और प्लंजर धोएं । कोशिकाओं को इकट्ठा करें और उन्हें 40 माइक्रोमीटर छन्नी टोपी FACS ट्यूब के माध्यम से फ़िल्टर करें।फिर ठंडे FACS बफर के एक मिलीलीटर के साथ छन्नी टोपी धोएं। पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 600G पर उन्हें अपकेंद्री द्वारा कोशिकाओं को गोली मार । फिर सुपरनेट को डिकेंट करें और एफसी ब्लॉक के साथ कोल्ड एफएस बफर के 0.4 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से लचर करें।15 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने इनक्यूबेट तो धोने और कोशिकाओं गोली । जर्मिनल सेंटर बी कोशिकाओं या जीसीबीसी को दागने के लिए, यूएफएस बफर के 80 माइक्रोलीटर में जंगली प्रकार की कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। प्रत्येक धुंधला नियंत्रण के लिए जंगली प्रकार के पेयर के पैच से कोशिकाओं के 10 माइक्रोलीटर निकालें।प्रायोगिक नमूनों के लिए सेल निलंबन के 40 माइक्रोलीटर छोड़कर। वैकल्पिक रूप से, धुंधला नियंत्रण के लिए मुआवजा मोती का उपयोग करें। बर्फ पर 15 मिनट के लिए PNA Biotin के २.५ माइक्रोलीटर के साथ ठंड FACS बफर के ५०० माइक्रोलीटर में प्रयोगात्मक नमूनों में से प्रत्येक दाग ।इसके बाद पीएनए दाग कोशिकाओं को धो लें। अंधेरे में और 15 मिनट के लिए बर्फ पर जीसीबीसी कॉकटेल के ५०० माइक्रोलीटर के साथ प्रत्येक नमूना दाग, सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को पूरी तरह से कॉकटेल में फिर से निलंबित कर रहे हैं । मुआवजा मैट्रिक्स के लिए एकल दाग नियंत्रण तैयार करने के लिए, पाठ में निर्दिष्ट कमजोर पड़ने का उपयोग कर ठंड FACS बफर के ५०० माइक्रोलीटर में कोशिकाओं दाग ।15 मिनट के लिए बर्फ पर अंधेरे में धुंधला नियंत्रण इनक्यूबेट। सभी दाग नमूनों और नियंत्रण धोने के लिए ठंडे FACS बफर के दो मिलीलीटर जोड़ें। कोशिकाओं को गोली मारें और साइटोमीटर पर चलाने के लिए कोल्ड एफएसएस बफर के 500 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा में कोशिकाओं को फिर से खर्च करने से पहले सुपरनैंट को त्याग दें।फिर, प्रत्येक दाग प्रयोगात्मक नमूने से B220 सकारात्मक PNA उच्च कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एक सेल सॉर्टर का उपयोग करें। जर्मिनल सेंटर बी कोशिकाओं या जीसीबीसी से डीएनए निकालने के लिए, डीएनए निष्कर्षण बफर के 500 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें और प्रोटीनेज के पांच माइक्रोलीटर फिर आइसोप्रोपेनॉल के 500 माइक्रोलीटर और ग्लाइकोजेन के एक माइक्रोलीटर के साथ डीएनए को उपजी करें। और ट्यूब को पांच या छह बार उलटा करके अच्छी तरह मिला लें।कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए नमूना इनक्यूबेटिंग के बाद, यह 21, 000G और 25 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र । सुपरनेट को त्यागें और डीएनए गोली को 70% इथेनॉल के एक मिलीलीटर से धोएं। 10 मिनट के लिए 21, 000G पर डीएनए अपकेंद्रित्र, तो इथेनॉल निकालें और हवा-पांच से 10 मिनट के लिए गोली सूखी ।ते बफर के 30 माइक्रोलीटर में डीएनए को फिर से खर्च करें और इसे रात भर ५६ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें । JH4 Intron के लिए नेस्टेड पीसीआर प्रदर्शन करते हैं। कम से कम केंद्रित नमूने के लिए पहली पीसीआर में इस्तेमाल जीनोमिक डीएनए की कुल राशि को सामान्य करना।एक जेल पर पीसीआर उत्पादों को चलाने के बाद, एम्प्लिकॉन को उत्पादित करें और इसे जेल निष्कर्षण किट के साथ शुद्ध करें। फिर एम्प्लिकॉन को प्लाज्मिड में मुकदमा करें और लिगाशन रिएक्शन के दो माइक्रोलीटर के साथ इलेक्ट्रो सक्षम बैक्टीरियल कोशिकाओं को बदलें। 1.65 किलोवोल्ट पर कोशिकाओं को इलेक्ट्रोपोरेट करें और उन्हें एसओसी मीडिया के 600 माइक्रोलीटर में 225 आरपीएम पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए बचाएं।प्लेट एलबी एगर प्लेटों पर बदल बैक्टीरिया के १०० माइक्रोलीटर एम्पिसिलिन के साथ पूरक और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेटों इनक्यूबेट । बैक्टीरियल कॉलोनियों से प्लाज्मा डीएनए अनुक्रम और एक Clustal ओमेगा सॉफ्टवेयर का उपयोग कर JH4 Intron संदर्भ अनुक्रम के खिलाफ प्रत्येक पीसीआर के लिए प्राप्त दृश्यों संरेखित करें । म्यूटेशन के रूप में संदर्भ अनुक्रम से मतभेदों की पहचान करें।अंकुरण केंद्र बी कोशिकाओं B220 रिसेप्टर की अभिव्यक्ति को मापने और मूंगफली agglutinin के बाध्यकारी द्वारा पहचाने गए थे । जंगली प्रकार के पेयर के पैच में प्रति माउस औसतन 4 मिलियन कोशिकाएं थीं। और कोशिकाओं के लगभग 8% B220 सकारात्मक PNA उच्च जो कि सहायता नॉकआउट चूहों में मनाया का आधा है थे ।जंगली प्रकार के जर्मिनल सेंटर बी कोशिकाओं से प्राप्त १०५ अनूठे दृश्यों में से कुल २२६ म्यूटेशन पाए गए । उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रम के विश्लेषण में आधार जोड़ी प्रति नकारात्मक तीसरे उत्परिवर्तनों के लिए चार गुना 10 की दर से संक्रमण और ट्रांस संस्करणों की एक श्रृंखला दिखाई गई । ११३ सहायता नॉकआउट दृश्यों में केवल दो म्यूटेशन की पहचान की गई ।इसके अतिरिक्त, जंगली प्रकार के जर्मिनल सेंटर बी कोशिकाओं से प्रत्येक JH4 पीसीआर उत्पाद में एक से 25 उत्परिवर्तन होते हैं, जिनमें अक्सर एक अनुक्रम पर पाए जाने वाले कई उत्परिवर्तन होते हैं। इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय, कोशिका व्यवहार्यता को संरक्षित करने के लिए कोशिकाओं को बर्फ पर रखना याद रखें। कोशिकाओं को धुंधला करने के बाद, फ्लोरोफोरस को फोटोब्लैचिंग से रोकने के लिए कोशिकाओं को अंधेरे में रखें।एंटीबॉडी एफ़िनिटी परिपक्वता के साथ दैहिक हाइपरम्यूटेशन को सहसंबंधित करने के लिए, हम प्रतिरक्षण प्रोटोकॉल का उपयोग करने और एंटीजन विशिष्ट एंटीबॉडी टाइटर्स और वी क्षेत्र म्यूटेशन के लिए परख करने की सलाह देते हैं।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

रामोस बी कक्ष में या विशिष्ट जीन की Overexpression नॉकडाउन के बाद दैहिक Hypermutation मूल्यांकन

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

अलग और immunostaining लिम्फोसाइटों और murine Peyer पैच से वृक्ष के समान कोशिकाओं

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Hematopoietic progenitors के दत्तक हस्तांतरण का उपयोग कर Peyer पैच में murine plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं के विकास का आकलन

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

PNA मछली द्वारा माउस बी लिम्फोसाइटों में क्रोमोजोम aberrations के तेजी से विश्लेषण

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

टी कोशिकाओं की व्युत्पत्ति<em&gt; इन विट्रो</em&gt; माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं से

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

सच का पता लगाने के लिए माउस बी वंश प्रकोष्ठों आईजीई व्यक्त

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

अमर छाँटे बी कोशिकाओं से पुनः संयोजक मानव आईजीजी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का सृजन

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

अलगाव और इस्केमिक माउस मस्तिष्क से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवाह cytometric विश्लेषण

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

का पता लगाने और दुर्लभ के संवर्धन विशिष्ट प्रतिजन phenotype और समारोह के विश्लेषण के लिए बी कोशिकाओं

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Murine सीमांत क्षेत्र बी कोशिकाओं के कतरनी प्रवाह प्रेरित प्रवासन का विश्लेषण इन विट्रो में

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...