Name: analysis of somatic hypermutation in the jh4 intron of germinal center b cells from mouse peyer's patches
Uploaded: 2021-04-20T13:00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Somatic Hypermutation in the JH4 intron of Germinal Center B cells from Mouse Peyer's Patches at JoVE.com

Мы благодарим Тасуку Хонджо за ПОМОЩЬ-/- мышей. Эта работа была поддержана Национальным институтом по вопросам здоровья меньшинств и неравенства в области здравоохранения (5G12MD007603), Национальным институтом рака (2U54CA132378) и Национальным институтом общих медицинских наук (1SC1GM132035-01).

Все мыши-мутанты были сохранены на фоне C57BL/6. Для всех экспериментов использовались возрастные (2-5 месяцев) мыши мужского и женского пола. Мужство и эксперименты с мышами проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Городским колледжем Нью-йоркского институционального комитета по уходу за животными и использованию.
1. Вскрытие патчей Пейера
<ol><li>Euthanize мыши со 100% CO2 на 3 л / мин в течение 5 минут с последующим вывихом шейки матки, чтобы подтвердить смерть. Стерилизовать инструменты для вскрытия (ножницы, типсы, тонкие типсы) и руки в перчатках с 70% этанола.</li>
	<li>Положите мышь на вскрытии площадку с животом подвергаются. Обильно распылить тело мыши с 70% этанола до принятия каких-либо разрезов для стерилизации области вскрытия.</li>
	<li>Сделайте разрез на коже живота и удалить кожу из живота, потянув одновременно по обе стороны от разреза к голове и хвосту с помощью миппов (или стерилизованных, в перчатках руки).</li>
	<li>Прикрепите передовую и задние конечности мыши.</li>
	<li>Вырезать брюшной полости ножницами, чтобы разоблачить внутренние органы.</li>
	<li>Найдите тонкий кишечник между желудком и caecum ("J" формы структуры вблизи толстой кишки). Удалите тонкой кишки путем резки ниже желудка и выше caecum.</li>
	<li>Удалите любые соединительной ткани и жира, связывающие складки тонкой кишки вместе. ПРИМЕЧАНИЕ: жир будет иметь отличительный белый цвет, в отличие от розового цвета тонкой кишки.</li>
	<li>Изучите внешнюю поверхность тонкой кишки на участки Пейера (PPs), которые являются небольшими (1 мм), овальной формы структур, которые появляются белые ниже тонкого слоя полупрозрачных эпителиальных клеток.</li>
	<li>Тщательно акциз все видимые PP с ножницами. ПРИМЕЧАНИЕ: Одна мышь дикого типа C57BL/6 (WT) может дать 4-8 PPs, в то время как AID-/- мышь будет иметь 6-10 PPs.</li>
	<li>Соберите PPs в 1,5 мл микроцентрифуг трубки, содержащей 1 мл буфера FACS на льду. ПРИМЕЧАНИЕ: PP должен утонуть, в то время как жир будет плавать на поверхность и могут быть удалены.</li>
</ol>2. Изоляция клеток для FACS
<ol><li>Поместите 40 мкм фильтр в 6-хорошо блюдо с 1 мл холодного (4 кк) FACS буфера.</li>
	<li>Налейте PPs из 1,5 мл трубки на фильтр.</li>
	<li>Вымойте PPs с 1 мл холодного буфера FACS, убедившись, что они всегда находятся в жидкости и на льду.</li>
	<li>Используйте плоский конец поршеня из шприца 1 мл в качестве пестика, чтобы раздавить PPs на фильтре, пока только соединительная ткань остается на фильтре.</li>
	<li>Вымойте фильтр и поршень с 1 мл холодного буфера FACS, чтобы освободить клетки в 6 хорошо блюдо.</li>
	<li>Соберите 4 мл ячеек в холодном буфере FACS и отфильтруйте их через 40 мкм ситечко крышка FACS трубки.</li>
	<li>Вымойте крышку ситечком с 1 мл холодного буфера FACS.</li>
	<li>Пеллет клетки при 600 х г при 4 градусов по Цельсию в течение 5 минут в размахивая центрифуг ведро.</li>
	<li>Декант супернатант.</li>
	<li>Повторное приостановление ячеек в 0,4 мл холодного буфера FACS.</li>
	<li>Удалите 10 МКЛ для подсчета ячеек для проверки урожайности (ожидайте 5 х 106 ячеек/мышей, см. Рисунок 3A)</li>
	<li>Фильтр остальные клетки через 40 мкм ситечко крышка в трубку FACS и приступить к окрашивания для FACS.</li>
</ol>3. Окрашивание ГКБК для FACS
<ol><li>Добавьте блок 1 йл Fc (неоцеличные антимошки CD16/CD32) к 400 йл клеточной подвески и поместите клетки на лед в течение 15 минут.</li>
	<li>Добавьте 2 мл холодного буфера FACS для мытья клеток.<ol>
<li>Пеллетные клетки при 600 x g при 4 градусах Цельсия в течение 5 минут и отбрасывайте супернатант.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Переусердуйтесь с клетками в 80 МКЛ холодного буфера FACS.</li>
	<li>Удалите 10 МКЛ клеток из WT PP для каждого контроля окрашивания (4 в общей сложности, в том числе 3 одного контроля пятна и 1 неоплеканный контроль). Оставьте 40 МКЛ WT PP для следующего шага. Кроме того, используйте компенсационные бусинки для контроля окрашивания.</li>
	<li>Пятно каждого из экспериментальных образцов (например, WT и AID-/-) в 500 МКЛ холодного буфера FACS с 2,5 мл арахисового агглютинина (PNA)-биотина в течение 15 минут на льду.</li>
	<li>Добавьте 2 мл холодного буфера FACS для мытья клеток.<ol>
<li>Пеллетные клетки при 600 x g при 4 градусах Цельсия в течение 5 минут и отбрасывайте супернатант.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Пятно каждого экспериментального образца с 500 йл коктейля в темноте, на льду, в течение 15 минут (таблица 1). Убедитесь, что клетки полностью повторно в окрашивание коктейль.</li>
	<li>Подготовь одиночные элементы управления пятнами для матрицы компенсации.<ol>
<li>Пятно клеток в 500 МКЛ холодного буфера FACS с помощью разбавления, указанные в таблице 2.</li>
		<li>Инкубировать окрашивание элементов управления в темноте, на льду, в течение 15 минут.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Добавьте 2 мл холодного буфера FACS ко всем трубам в шагах 3.7 и 3.8, гранулы клетки, и отбросить супернатант, чтобы смыть несъебленные антитела или DAPI.</li>
	<li>Переусердуйтесь с клетками в 500 МКЛ холодного буфера FACS и поместите на лед.</li>
	<li>Используя сортер клеток, соберите B220иPNAHI с каждого окрашенного экспериментального образца. Рисунок 3B показывает типичные проценты B220и PNAHI, полученные от WT и AID-/- PPs. Рисунок 3C отображает стратегию FACS gating.</li>
</ol>4. Извлечение ДНК из ГХФУ
<ol><li>Пеллет отсортированы клетки при 600 х г при 4 градусов по Цельсию в течение 5 мин и отказаться от супернатанта.</li>
	<li>Перепробовать клетки в 1 мл холодного буфера FACS и передать клетки в 1,5 мл микроцентрифуг трубки.<ol>
<li>Пеллет клетки на 600 х г при 4 градусов по Цельсию в течение 5 минут и отказаться от супернатанта.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Повторное потребление клеток в 500 МКЛ буфера извлечения ДНК и 5 МКЛ 20 мг/мл протеиназы К.</li>
	<li>Инкубировать при 56 градусов по Цельсию на ночь.</li>
	<li>Осадок ДНК с 500 мкл изопропанола и 1 йл 20 мг/мл гликогена. Смешайте трубку тщательно, инвертирование 5-6x.</li>
	<li>Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут.</li>
	<li>Центрифуга в микроцентрифуге в течение 15 мин при 25 градусов по Цельсию при 21 000 х г.<ol>
<li>Откажитесь от супернатанта и сохраните гранулы, которые содержат осажденную ДНК и гликоген.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Вымойте гранулы ДНК с 1 мл 70% этанола.<ol>
<li>Пеллет ДНК в микроцентрифуге в течение 10 мин при 25 градусов по Цельсию при 21 000 х г.
</li>
		<li>Удалите 70% этанола и высушите гранулы ДНК в течение 5-10 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерной сушки, как ДНК не может регидратировать полностью.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Переподход ДНК в буфере TE 30 хл и инкубировать на ночь при 56 градусов по Цельсию.</li>
</ol>5. JH4 интрон последовательность усиления и анализа
<ol><li>Количественная оценка ДНК путем измерения поглощения на длине волны 260 нм (A260). ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная концентрация ДНК, извлеченной изотсортированного B220 и PNAHI GCBCs мыши C57BL/6, составляет 20-40 нг/мл.</li>
	<li>Выполните вложенный ПЦР для интрона JH4(таблица 3, таблица 4). Нормализует общее количество геномной ДНК, используемой в первом ПЦР, до наименее концентрированного образца. (например, если наименее концентрированная выборка составляет 5 нг/мл, используйте 58,75 нг ДНК для всех образцов в максимальном объеме воды (11,75 МЛ) в ПЦР #1).</li>
	<li>Решите pcR продукт на 1,5% агарозный гель при 200 V в течение 20 мин. Ожидаемый размер ампликона составляет 580 б.п.</li>
	<li>Акциз amplicon из геля и извлечь ДНК с помощью комплекта извлечения геля в соответствии с инструкциями производителя (см. Дополнительная цифра 1).<ol>
<li>Elute ДНК с 30 йл воды и количественно количество ДНК путем измерения A260. ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная концентрация очищенного продукта ПЦР составляет 3-10 нг/мл.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ligate очищенный продукт ПЦР в плазмиду с тупыми концами. Стандартизация общего количества продукта ПЦР, используемого в каждой реакции перевязки(таблица 5).<ol>
<li>Инкубировать реакцию перевязки при комнатной температуре в течение 5 минут или на ночь при температуре 16 градусов по Цельсию.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Преобразование электрокомпетентных бактериальных клеток с 2 йл реакции перевязки.<ol>
<li>Электропорат при 1,65 кВ.</li>
		<li>Спасение в 600 МКЛ soC средств массовой информации для 1 ч при 37 градусов по Цельсию в трясущимся инкубаторе при 225 об/мин.</li>
		<li>Плита 100 Л преобразованных бактерий на LB дополняется ампициллином (100 мкг/мл) агар пластин и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Отправить пластины бактериальных колоний для Сэнгера секвенирования с помощью T7 вперед грунтовки. Кроме того, расти ночные культуры каждой бактериальной колонии и выполнять плазмидной очистки.<ol>
<li>При необходимости повторите ПЦР, перевязку и/или трансформацию для оптимизации урожайности бактериальных колоний ПРИМЕЧАНИЕ: Минимум 30 колоний должны быть собраны из каждой пластины.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Стандартизация данных последовательности в .txt файлов<ol>
<li>Удалите плазмидную последовательность.</li>
		<li>Убедитесь, что каждая последовательность ориентирована от 5' до 3' в соответствии с интронной последовательностью JH4 (NG_005838). Создать обратный комплект любой последовательности, по мере необходимости.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Выровнять последовательности, полученные для каждого ПЦР против JH4 интрон эталонной последовательности (NG_005838) с помощью программного обеспечения Clustal Omega (Рисунок 4A).<ol>
<li>Определить отличия от эталонной последовательности как мутации</li>
		<li>Убедитесь, что все мутации являются истинными точечными мутациями, изучая электроферограмму секвенирования Сэнгера. Повторите секвенирование, если это необходимо. (Рисунок 4B,C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Табулировать и количественно уникальные мутации в JH4 интрон для каждого генотипа (Рисунок 5).<ol>
<li>Подсчитайте последовательности с идентичными мутациями только один раз ПРИМЕЧАНИЕ: Невозможно определить, были ли идентичные последовательности созданы во время ПЦР или идентичных событий SHM в разных клетках группы В.</li>
		<li>Подсчитайте каждый экземпляр интронных последовательностей WT germline JH4 (т.е. тех, у кого нет мутаций) как уникальную последовательность.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Авторов нечего раскрывать.

Характеристика SHM в igH и IgL V кодирования последовательностей неоднородной популяции клеток B представляет собой проблему, учитывая, что каждая клетка B однозначно реорганизует V сегментов кодирования во время рекомбинации V(D)J34. В этой статье мы описываем метод выявления мутаций в интроне JH4 ГХК. JH4 интрон, который расположен 3' из последнего сегмента кодирования J в локусе IgH, используется в качестве суррогата для SHM регионов V(рисунок 1)31,33,34,35. Чтобы каталогизировать эти интрон мутации JH4 и оценить, как конкретные гены влияют на производство или структуру мутаций, PP GCBCs специально анализируются. Эти клетки накапливают интрональные мутации JH4 в результате хронической стимуляции кишечной микробиотой53. Кроме того, B220иPNAHI GCBCs от PPs неиммунизированных мышей имеют спектр мутации, который сравнивается с splenic GCBCs от иммунизированныхживотных 54,55. Тем не менее, мутации в интроне JH4 не могут быть связаны с созреванием сродства Ig, потому что эти мутации не кодируются.
Чтобы определить, изменяет ли SHM сродство Ig, мыши должны быть иммунизированы intraperitoneally с антигеном, таких как NP (4-гидрокси-3-нитрофенилацетил) конъюгированных cGG (куриный гамма-глобулин) или KLH (ключ отверстие хрома hemocyanin)56. Впоследствии, мРНК может быть очищена отsplenic B220 и PNAHI GCBCs для изучения SHM в VH186.2, V кодирования экзон, который чаще всего распознает NP и мутировал после NP-CGG или NP-KLHиммунизации 31,57,58,59,60. Мутация триптофан-33 на лейцин в VH186.2 была охарактеризована для увеличения сродства Ig до 10 раз59,60 и,следовательно, один показатель того, что SHM и клональный отбор вызвал высокое сродство Ig. Измерение NP7- и NP20-специфических сывороток Ig титеры ELISA и расчета Ig-специфических NP7/NP20 соотношение в ходе иммунизации также документы Ig сродства созревания в результате SHM Vрегионов 17,21,36. Оба эти анализа могут быть использованы для корреляции SHM в VH186.2 кодирования последовательностей с изменениями в NP-специфических Ig сродства созревания.
Используются ли иммунизированные или неимунизированные животные для анализа SHM VH186.2 или интрона JH4, GCBCs должны быть точно идентифицированы. Мы представляем подход, основанный на FACS, чтобы изолировать B220 и PNAHI GCBCs. В качестве альтернативы, Фас и не сульфатных No 2-6-sialyl-LacNAc антиген, который признается антителом GL761,62,63,64,также могут быть использованы для изоляции GCBCs, которые определены как B220иFasNO GL7No 65 илиCD19 Выражение GL7 близко отражает PNA в активированных GCBCs лимфатических узлов64,65,66. В дополнение к использованию маркеров антител, характерных для ГХДК, окрашивание коктейлей должно максимизировать возбуждение флюорофора и обнаружение биомаркера при минимизации спектрального перекрытия флуоресцентного излучения. Антигены, выраженные на низких уровнях, должны быть обнаружены с антителом, которое спрягается с флюорофором с надежной флуоресценциейвыбросов 67. Рекомендуемый протокол окрашивания был оптимизирован для анализа на сортаторе клеток, оснащенном четырьмя лазерами (405 нм, 488 нм, 561 нм, 633 нм) и 12 фильтрами; однако конфигурации фильтров и доступность лазеров различаются между цитометрами. Для внесения изменений в протокол в соответствии с реагентом и наличием оборудования, читателю направляются дополнительные ресурсы, онлайн-зрители спектра и опубликованная литература67,68, 69,70,71,72,73. Многоцветный протокол окрашивания, описанный в настоящем, требует компенсации спектрального перекрытия для обеспечения того, чтобы отсортированная популяция клеток была ГХОК, а не неточного обнаружения флуоресцентного излучения. B220 служит полезным контролем окрашивания для описанного FACS(таблица 1B), потому что PPs будет иметь отличительные B220 отрицательных и положительных популяций (Рисунок 3C), что позволяет для соответствующей компенсации спектрального перекрытия. Стратегия гатинга, представленная на рисунке 3C, должна использоваться в качестве ориентира. Участки цитометрии потока могут варьироваться в зависимости от условий окрашивания и параметров цитометра. Тем не менее, 4-10% живых клеток должны быть B220иPNAHI 35, 52.
Все мутации в JH4 intron PP GCBCs должны быть проверены, чтобы убедиться, что наблюдаемые мутации действительно отражают SHM, а не артефакт ПЦР или секвенирования. AID-/- B-клетки могут служить полезным негативным контролем при изучении фенотипа SHM в других моделях мышей-мутантов, потому что эти клетки не могут завершить SHM17,19. Скорость мутации JH4 интрона в AID-/- GCBCs (1.66x10-5 мутаций/bp)20,21,36,37,38,50,74 сопоставима с погрешностью полимеразы высокой точности (5.3x10-7 sub/base/doubling)51,52, которая используется для усиления ДНК в вложенном ПЦР. Если AID-/- мыши недоступны, сравните наблюдаемую модель мутации и частоту с опубликованной литературой. Ig V регионов накапливаются 10-3-10-4 мутаций на базовую пару деления, что примерно в 106раз выше, чем скорость мутации других генныхлокусов 73,75. Результаты могут варьироваться в зависимости от возраста животного76. Кроме того, B220иPNALO клетки, которые марки не-GCBCs, могут быть использованы в качестве отрицательного контроля в отсутствие AID-/- мышей 52. Если частота мутаций в WT GCBCs ниже, чем ожидалось, ВТ зародышевой JH4 intronic последовательность может быть непропорционально представлены. В этом случае убедитесь, что ГХДК были окрашены и отсортированы надлежащим образом, а ПЦР свободны от загрязнения интроном WT germline JH4. Кроме того, необработанные данные секвенирования в электроферограммах должны быть тщательно проанализированы, чтобы убедиться, что мутации в текстовых данных последовательности не являются артефактами ошибок секвенирования. Например, плохие результаты секвенирования Sanger могут снизить надежность данных последовательности(рисунок 4). Такой контроль качества данных последовательности Sanger повысит точность и воспроизводимость анализа интрон мутаций JH4.

В-клетки, члены адаптивной иммунной системы, распознают и устраняют антигены, вырабатывая антитела, также известные как иммуноглобулины (Ig). Каждый Ig состоит из двух тяжелых (IgH) и двух легких (IgL) цепных полипептидов, которые проводятся вместе дисульфидными связями, чтобы сформировать характерную структуру формы "Y" Ig1. N-termini IgH и IgL составляют переменную (V) область каждого полипептида и вместе они образуют антиген связывания сайта Ig, в то время как постоянная область IgH придает эффектор функции Ig. Развитие B-клеток в костном мозге переставить V кодирования экзонов IgH и IgL в процессе, известном как V (D)J рекомбинации2,3,4. Транскрипция рекомбинированного V exons, в сочетании с соответствующими постоянными экзонами региона, образует мРНК, которая переводится в Ig.
Зрелые В-клетки, выражаюющие мембрану связаны Ig, также известный как рецептор В-клеток (BCR), циркулируют во вторичные лимфоидные органы, такие как селезенка, лимфатический узел, или патчи Пейера, где они обследуют среду для антигенов и взаимодействуют с другими клетками иммуннойсистемы 1. В зародышевых центрах (GC) вторичных лимфоидных органов, B клетки, которые признают антиген через BCR становятся активированными. С помощью фолликулярных дендритных клеток и фолликулярных помощников Т-клеток, активированные В-клетки могут размножаться и дифференцироваться в плазменные клетки и клетки памяти, которые являются важными эффекторами надежного иммунного ответа5,6,7,8,9. Кроме того, эти активированные В-клетки могут проходить вторичные процессы диверсификации генов Ig - рекомбинацию коммутатора класса (CSR) и соматическую гипермутацию (SHM). Во время КСО В-клетки обмениваются по умолчанию μ постоянной областью полипептида IgH с другой постоянной областью (γ, α, ε) через реакциюудаления ДНК-рекомбинации (рисунок 1). Это позволяет выражение различных постоянных exon и перевод нового Ig. Ячейка B перейдет от выражения IgM к другому изотипу (IgG, IgA, IgE). КСО изменяет функцию эффектора Ig, не изменяя его антигеннуюспецифичность 10,11,12. Тем не менее, во время SHM, B-клетки мутируют V кодирования регионов IgH иIgL,чтобы производство и выбор более высокого сродства Igs, которые могут более эффективно устранить антиген13,14,15 (Рисунок 1). Важно отметить, что и КСО, и SHM зависят от функции одного фермента: активация индуцированной цитидин деаминазы (AID)16,17,18. Люди и мыши, не хватает AID не может завершить КСО или SHM и настоящее время с повышенным IgM сыворотки титеры или Hyper-IgM17,19.
В КСО, AID deaminates дезоксицитидин (C) в повторяющихся регионах коммутатора, которые предшествуют каждой постоянной кодирования экзонов, превращая их в дезоксиуридины (U)20,21, что создает несовместимые базы сопряжения между дезоксиуридинов и дезоксигуанозинов (U:G). Эти U:G несоответствия преобразуются в двойной ДНК перерывов, которые необходимы для рекомбинации ДНК, либо путем ремонта иссечения базы (BER) или несоответствия ремонта (MMR)путь 22,23,24,25,26,27,28,29. В SHM AID deaminates C в эксонах кодирования V. Репликация через несоответствие U:G генерирует C:G к T: Переходные мутации, в то время как удаление базы uracil белком BER, гликозилаза ДНК uracil (UNG), до репликации ДНК производит как переход, так и трансверсиимутаций 16. Нулевые мутации в UNG значительно увеличивают C:G до T:A переходныхмутаций 21,22. Как и КСО, SHM требует дополнительных функций MMR и BER. Во время SHM MMR генерирует мутации в базовых парах A:T. Инактивирующие мутации в гомологии MutS 2 (MSH2)или полимеразе ДНК η (Pol) значительно уменьшают мутации на базах A:T и сложные мутации в MSH2 и Polе практически отменяет мутации на базах A:T21,30,31. В соответствии с критической ролью BER и MMR в преобразовании САИР-генерируемых U в переходные или трансверсионные мутации, мыши испытывают дефицит как для MSH2, так и для UNG (MSH2-/-UNG-/-)отображают только C:G к T:Переходные мутации в результате репликации через несоответствие U:G21.
Анализ SHM в регионах V кодирования остается сложным, потому что развивающиеся B-клетки могут рекомбинировать любой из экзонов кодирования V(D)J в локусе IgH и IgL1,2,4. Точный анализ этих уникально рекомбинированных и соматически мутировавших V областей требует идентификации и изоляции клонов В-клеток или Ig mRNA11,13. JH4 интрон, который является 3' из последних J кодирования экзон в локусе IgH, гавани соматических мутаций из-за распространения мутаций 3' из V промоутер32,33,34 и, следовательно, часто используется в качестве суррогатного маркера для SHM в V регионах31,35 (Рисунок 1). Чтобы экспериментально выяснить, как конкретные гены или генетические мутации изменить SHM моделей или ставок, JH4 интрон может быть секвенирован из патчей Пейера (PP) герминального центра B клеток (GCBCs), которые проходят высокие показатели SHM36,37,38. GCBCs можно легко определить и изолировать с флуоресцентно спряженными антителамипротив маркеров поверхности клетки (B220 и PNAHI)17,39.
Представлен подробный протокол для характеристики интронных мутаций JH4 в PP GCBCs у мышей с использованием комбинации FACS (сортировка активированных клеток флуоресценции), ПЦР и секвенированияСэнгера (рисунок 2).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 ml PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, mixed</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-4708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-eFluor780 anti-CD45R/B220</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-0452-80</td>
			<td>clone RA3-6B2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD</td>
			<td>643186</td>
			<td>four lasers (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) and 12 filters (PacBlue (450/50), 
			AmCyan (502LP; 530/30), SSC (488/10), FITC (502LP; 530/30), PerCP-Cy5.5 (655LP; 695/40), 
			PE (585/15), PE-Texas Red (600LP; 610/20), PE-Cy5 (630LP; 670/14), PE-Cy7 (735LP; 780/60), APC (660/20), Alexa700 (710LP; 730/45), APC-Cy7 (755LP; 780/60))</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD slip tip 1mL syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated peanut agglutinin (PNA)</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>B-1075-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Falcon test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>0.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0447L</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ElectroMAX DH10B competent cells</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>18-290-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon cell strainer 40mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom polystyrene tubes (FACS tubes)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom polystyrene tubes (capped)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>149591A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>R&#38;D Systems (Atlanta Biologicals)</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco phosphate buffered saline PBS pH 7.4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lasergene Molecular Biology (MegAlign Pro)</td>
			<td>DNA Star</td>
			<td></td>
			<td>version 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-CD45R/B220</td>
			<td>BD</td>
			<td>553090</td>
			<td>clone RA3-6B2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1700-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0491L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal-Rite 1.5mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin APC-eFluor 780 Conjugate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M020L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific CloneJET PCR Cloning Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>FERK1231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate 6 well</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlabeled anti-mouse CD16/CD32 (Fc block), BD</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BDB553142</td>
			<td>Clone 2.4G2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of somatic hypermutation in the jh4 intron of germinal center b cells from mouse peyer's patches

В зародышевых центрах лимфоидных органов, зрелые В-клетки изменяют их выраженный иммуноглобулин (Ig), вводя неоплатенные мутации в переменное кодирование экзонов ig тяжелых и легких цепных генных локусов. Этот процесс соматической гипермутации (SHM) требует фермента активации индуцированной цитидина деаминазы (AID), который преобразует дезоксицитидины (C), в дезоксиуридины (U). Обработка НЕСОВМЕСТИМЫХ несоответствий в мутации базовым иссечением и несоответствующей ремонтной дорожкой вводит новые последовательности кодирования Ig, которые могут привести к более высокому сродству Ig. Мутации в генах AID или ДНК могут блокировать или значительно изменять типы мутаций, наблюдаемых в локусах Ig. Мы описываем протокол количественной оценки интрон мутаций JH4, который использует флуоресценцию активированной сортировки клеток (FACS), ПЦР и секвенирования Sanger. Хотя этот анализ непосредственно не измеряет созревание сродства Ig, это свидетельствует о мутациях в переменных последовательностях кодирования Ig. Кроме того, эти методы используют общие методы молекулярной биологии, которые анализируют мутации в последовательностях Ig нескольких клонов В-клеток. Таким образом, этот анализ является бесценным инструментом в изучении SHM и Ig диверсификации.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Somatic Hypermutation in the JH4 intron of Germinal Center B cells from Mouse Peyer's Patches at JoVE.com

Analysis of Somatic Hypermutation in the JH4 intron of Germinal Center B cells from Mouse Peyer's Patches

Представлено здесь является анализ для количественной соматической гипермутации в иммуноглобулин тяжелых цепных генов локус с использованием зародышевых клеток центра В из патчей мыши Пейер.

Анализ соматической гипермутации в интроне JH4 герминального центра B-клеток из патчей мыши Пейера

Within the germinal centers of lymphoid organs, mature B cells alter their expressed immunoglobulin (Ig) by introducing untemplated mutations into the ...

Этот протокол позволяет пользователям изучать, как иммунная система производит антитела к патогенным микроорганизмам или commensal микробов. Кроме того, молекулярные пути, которые регулируют диверсификацию генов иммуноглобулина, могут быть изучены с помощью генетически модифицированных мышей. Протокол использует сочетание общих методов молекулярной биологии, включая секвенирование ПЦР и Сэнгера, и не требует сортировки одной клетки или глубокого секвенирования.Патчи Пейера можно легко спутать с окружающей жировой тканью. Таким образом, визуальная демонстрация этого метода может быть полезна для тех, кто не знаком с этим органом, чтобы определить его местоположение и наблюдать его вскрытие. Начните с укладки мыши на вскрытии площадку с животом подвергаются.Обильно распылить тело мыши с 70%этанола до принятия каких-либо разрезов для стерилизации области вскрытия. Сделайте разрез на коже живота и потяните одновременно по обе стороны разреза пальцами или мипсами. Затем вырезать брюшной полости ножницами, чтобы разоблачить внутренние органы.Найдите тонкой кишки и удалить его, разрезая ниже желудка и выше cecum. Удалите любые соединительной ткани и жира, связывающие складки тонкой кишки вместе. Изучите внешнюю поверхность тонкой кишки для патчей Пейера, которые представляют если выглядеть небольшими овальной формой структур, которые кажутся белыми ниже тонкого слоя полупрозрачных эпителиальных клеток.Тщательно акциз все видимые патчи Пейера с ножницами и собирать их в 1,5 миллилитров микро центрифуги трубки, содержащей один миллилитр буфера FACS на льду. Если собранная ткань опускается на дно трубки, это на самом деле патч Пейера, а не жировой ткани. Поместите 40 микрометровый фильтр в шесть хорошо блюдо с одним миллилитров холодного буфера FACS, а затем залить патчи Пейера из 1,5 миллилитров трубки на фильтр.Используйте плоский конец поршеня из одного миллилитрового шприца в качестве пестика, чтобы раздавить патчи Пейера на фильтре, пока не останется только соединительная ткань. Вымойте фильтр и поршень с одним миллилитр холодного буфера FACS, чтобы освободить клетки в шесть хорошо блюдо. Соберите клетки и фильтровать их через 40 микрометровый ситечко крышка FACS трубки.Затем вымойте крышку ситечком одним миллилитром холодного буфера FACS. Пеллет клетки центрифугирования их при 600G при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Затем высасывь супернатант и повторно помесить клетки в 0,4 миллилитров холодного буфера FACS с блоком FC.Инкубировать образцы на льду в течение 15 минут, затем мыть и гранулы клеток. Чтобы испачкать герминал центр В-клеток или ГХК, повторно помеспендовать клетки дикого типа в 80 микролитров буфера FACS. Удалите 10 микролитров клеток из патчей дикого типа Пейера для каждого контроля окрашивания.Оставляя 40 микролитров клеточной подвески для экспериментальных образцов. Кроме того, используйте компенсационные бусинки для контроля окрашивания. Пятно каждого из экспериментальных образцов в 500 микролитров холодного буфера FACS с 2,5 микролитров PNA Biotin в течение 15 минут на льду.Затем мыть PNA пятна клеток. Пятно каждого образца с 500 микролитров коктейля GCBC в темноте и на льду в течение 15 минут, убедившись, что клетки полностью повторно в коктейль. Чтобы подготовить одиночные элементы управления пятнами для матрицы компенсации, окрашивайте клетки в 500 микролитров холодного буфера FACS с помощью разбавления, указанного в тексте.Инкубировать окрашивание элементов управления в темноте на льду в течение 15 минут. Добавьте два миллилитров холодного буфера FACS, чтобы вымыть все образцы пятен и элементы управления. Пеллет клетки и отказаться от супернатанта до повторного перерасхода клеток в окончательном объеме 500 микролитров холодного буфера FACS для запуска на цитометре.Затем используйте сортер клеток для сбора положительных высоких клеток PNA B220 из каждого окрашенного экспериментального образца. Чтобы извлечь ДНК из герминального центра В-клеток или ГКБК, повторно усыпляют клетки в 500 микролитров буфера извлечения ДНК и пяти микролитров протеиназы K.Then осаждают ДНК 500 микролитров изопропанола и один микролитер гликогена. И смешать трубку тщательно, инвертирование его пять или шесть раз.После инкубации образца в течение 10 минут при комнатной температуре, центрифуга его в течение 15 минут при температуре 21 000G и 25 градусов по Цельсию. Откажитесь от супернатанта и вымойте гранулы ДНК одним миллилитром 70% этанола. Центрифуга ДНК на 21 000G в течение 10 минут, затем удалить этанол и высушить гранулы в течение пяти-десяти минут.Повторное образование ДНК в 30 микролитров буфера TE и инкубировать его на ночь при 56 градусов по Цельсию. Выполните вложенный ПЦР для JH4 Intron. Нормализация общего количества геномной ДНК, используемой в первом ПЦР, до наименее концентрированного образца.После запуска продуктов ПЦР на гель, акциз amplicon и очистить его с гель извлечения комплекта. Затем оспорить ампликсон в плазмиду и преобразовать электро компетентных бактериальных клеток с двумя микролитерами реакции перевязки. Электропорат клетки на 1,65 киловольт и спасти их в 600 микролитров SOC средств массовой информации в течение одного часа при 37 градусов по Цельсию в трясущимся инкубатором при 225 об/мин.Плита 100 микролитров преобразованных бактерий на пластины LB агар дополняется ампициллином и инкубировать пластины на ночь при 37 градусов по Цельсию. Последовательность плазменной ДНК из бактериальных колоний и выровнять последовательности, полученные для каждого ПЦР против JH4 Intron эталонной последовательности с помощью программного обеспечения Clustal Omega. Определите отличия от эталонной последовательности как мутации.Клетки герминального центра В были идентифицированы путем измерения экспрессии рецептора B220 и связывания агглютинина арахиса. Патчи дикого типа Пейера содержали в среднем 4 миллиона клеток на мышь. И приблизительно 8% клеток были B220 положительные PNA высокой, что составляет половину того, что наблюдается в AID нокаут мышей.Из 105 уникальных последовательностей, полученных из диких клеток герминального центра В дикого типа, было обнаружено в общей сложности 226 мутаций. Анализ спектра мутаций показал ряд переходов и транс-версий со скоростью от четырех раз в 10 до отрицательных третьих мутаций на базовую пару. Только две мутации были выявлены в 113 последовательности нокаутом AID.Кроме того, каждый продукт JH4 PCR из диких клеток герминального центра В дикого типа содержал от одной до 25 мутаций с множественными мутациями, часто обнаруженными на одной последовательности. При попытке этого протокола, не забудьте сохранить клетки на льду, чтобы сохранить жизнеспособность клеток. После окрашивания клеток, держать клетки в темноте, чтобы предотвратить фотоотлив флюорофоров.Для корреляции соматической гипермутации с созреванием сродства антител мы рекомендуем использовать протокол иммунизации и анализ на антиген специфические титеры антител и мутации V региона.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Оценка соматических Hypermutation в Рамос-клеток после Сверхэкспрессия или Нокдаун специфических генов

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Изоляция и Иммуноокрашивание лимфоциты и дендритные клетки из мышиных Патчи Пейера

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Оценивая развитие мышей плазмацитоидных дендритных клеток в пейеровых бляшках Использование приемных передачи гемопоэтических прародителей

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Быстрое Анализ хромосомных аберраций в Mouse-лимфоцитов на PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Вывод Т-клеток<em&gt; In Vitro</em&gt; От эмбриональных стволовых клеток мыши

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

Обнаружение Истинного IgE-выражения мышь B Lineage клеток

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Генерация рекомбинантного человеческого IgG моноклональных антител из иммортализованных клеток Сортировка В

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Выделение и проточной цитометрии анализ иммунных клеток из мозга ишемического Mouse

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Обнаружение и обогащение редких антиген-специфических B Клетки для анализа фенотипа и функции

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Анализ миграционных потока индуцированного сдвига мышиных маргинальные зоны B клеток In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...