Name: functional assessment of brca1 variants using crispr-mediated base editors
Uploaded: 2021-02-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Research Foundation of Korea (tilskud 2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637 og 2018R1A5A20732 til Y.K.).

BEMÆRK: Metode 1 (generering af HAP1-BE3-cellelinjer) er valgfri. I stedet for at konstruere en BE3-udtrykkende cellelinje, kan BE3-kodning plasmid DNA co-transfected med gRNA-kodning plasmid DNA. Andre varianter af cytosin base redaktører, såsom BE4max, også kan bruges til meget effektiv base redigering.
1. Generering af HAP1-BE3-cellelinjer
<ol><li>Konstruktion af plasmid DNA<ol>
<li>For at konstruere lentiBE3-blast plasmid DNA til produktion af lentivirus skal BE3-kodningssekvenserne ...

<ol>
	<li>Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1+and+BRCA2:+different+roles+in+a+common+pathway+of+genome+protection.">BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).</li><li>Kuchenbaecker, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+of+Breast,+Ovarian,+and+Contralateral+Breast+Cancer+for+BRCA1+and+BRCA2+Mutation+Carriers.">Risks of Breast, Ovarian, and Contralateral Breast Cancer for BRCA1 and BRCA2 Mutation Carriers.</a> Journal of the American Medical Association. 317 (23), 2402-2416 (2017).</li><li>Millot, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+for+functional+analysis+of+BRCA1+variants+of+uncertain+significance.">A guide for functional analysis of BRCA1 variants of uncertain significance.</a> Human Mutation. 33 (11), 1526-1537 (2012).</li><li>Santos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+evaluation+of+BRCA1+and+BRCA2+unclassified+variants+identified+in+Portuguese+breast/ovarian+cancer+families.">Pathogenicity evaluation of BRCA1 and BRCA2 unclassified variants identified in Portuguese breast/ovarian cancer families.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 16 (3), 324-334 (2014).</li><li>Starita, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multiplex+Homology-Directed+DNA+Repair+Assay+Reveals+the+Impact+of+More+Than+1,000+BRCA1+Missense+Substitution+Variants+on+Protein+Function.">A Multiplex Homology-Directed DNA Repair Assay Reveals the Impact of More Than 1,000 BRCA1 Missense Substitution Variants on Protein Function.</a> American Journal of Human Genetics. 103 (4), 498-508 (2018).</li><li>Anantha, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+mutational+landscapes+of+BRCA1+for+homology-directed+repair+and+therapy+resistance.">Functional and mutational landscapes of BRCA1 for homology-directed repair and therapy resistance.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).</li><li>Quann, K., Jing, Y., Rigoutsos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulation+of+BRCA1+through+its+coding+sequence+by+the+miR-15/107+group+of+miRNAs.">Post-transcriptional regulation of BRCA1 through its coding sequence by the miR-15/107 group of miRNAs.</a> Frontiers in Genetics. 6, 242 (2015).</li><li>Saunus, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+regulation+of+the+breast+cancer+susceptibility+gene+BRCA1+by+the+RNA+binding+protein+HuR.">Posttranscriptional regulation of the breast cancer susceptibility gene BRCA1 by the RNA binding protein HuR.</a> Cancer Research. 68 (22), 9469-9478 (2008).</li><li>Knott1, G. J., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+guides+the+future+of+genetic+engineering.">CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering.</a> Science. 361, 866-869 (2018).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Hess, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+using+dCas9-targeted+somatic+hypermutation+in+mammalian+cells.">Directed evolution using dCas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells.</a> Nature Methods. 13 (12), 1036-1042 (2016).</li><li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+base+editing+in+mouse+embryos.">Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos.</a> Nature Biotechnology. 35 (5), 435-437 (2017).</li><li>Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+editing+of+a+target+base+in+genomic+DNA+without+double-stranded+DNA+cleavage.">Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage.</a> Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).</li><li>Park, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Base+Editing+via+RNA-Guided+Cytidine+Deaminases+in+Xenopus+laevis+Embryos.">Targeted Base Editing via RNA-Guided Cytidine Deaminases in Xenopus laevis Embryos.</a> Molecules and Cells. 40 (11), 823-827 (2017).</li><li>Kweon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-based+base-editing+screen+for+the+functional+assessment+of+BRCA1+variants.">A CRISPR-based base-editing screen for the functional assessment of BRCA1 variants.</a> Oncogene. 39 (1), 30-35 (2020).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).</li><li>Nageshwaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+Guide+RNA+Cloning+for+Mammalian+Systems.">CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li><li>Findlay, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+classification+of+BRCA1+variants+with+saturation+genome+editing.">Accurate classification of BRCA1 variants with saturation genome editing.</a> Nature. 562 (7726), 217-222 (2018).</li><li>Kweon, J., Kim, D. E., Jang, A. H., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas-based+customization+of+pooled+CRISPR+libraries.">CRISPR/Cas-based customization of pooled CRISPR libraries.</a> PLoS One. 13 (6), 0199473 (2018).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+library+of+TAL+effector+nucleases+spanning+the+human+genome.">A library of TAL effector nucleases spanning the human genome.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 251-258 (2013).</li><li>Sayers, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GenBank.">GenBank.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 94-99 (2019).</li><li>Hwang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+design+and+analysis+tools+for+CRISPR+base+editing.">Web-based design and analysis tools for CRISPR base editing.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 542 (2018).</li><li>Kim, D., Kim, D. E., Lee, G., Cho, S. I., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+target+specificity+of+CRISPR+RNA-guided+adenine+base+editors.">Genome-wide target specificity of CRISPR RNA-guided adenine base editors.</a> Nature Biotechnology. 37 (4), 430-435 (2019).</li><li>Clement, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPResso2+provides+accurate+and+rapid+genome+editing+sequence+analysis.">CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis.</a> Nature Biotechnology. 37 (3), 224-226 (2019).</li><li>Hu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolved+Cas9+variants+with+broad+PAM+compatibility+and+high+DNA+specificity.">Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity.</a> Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).</li><li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+CRISPR-Cas9+nuclease+with+expanded+targeting+space.">Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space.</a> Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).</li><li>Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unconstrained+genome+targeting+with+near-PAMless+engineered+CRISPR-Cas9+variants.">Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants.</a> Science. , (2020).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+target+specificities+of+CRISPR+RNA-guided+programmable+deaminases.">Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases.</a> Nature Biotechnology. 35 (5), 475-480 (2017).</li><li>Zuo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosine+base+editor+generates+substantial+off-target+single-nucleotide+variants+in+mouse+embryos.">Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos.</a> Science. 364 (6437), 289-292 (2019).</li><li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosine,+but+not+adenine,+base+editors+induce+genome-wide+off-target+mutations+in+rice.">Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice.</a> Science. 364 (6437), 292-295 (2019).</li><li>Grunewald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+off-target+RNA+editing+induced+by+CRISPR-guided+DNA+base+editors.">Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors.</a> Nature. 569 (7756), 433-437 (2019).</li><li>Doman, J. L., Raguram, A., Newby, G. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+minimization+of+Cas9-independent+off-target+DNA+editing+by+cytosine+base+editors.">Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 620-628 (2020).</li><li>Gaudelli, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+base+editing+of+A*T+to+G*C+in+genomic+DNA+without+DNA+cleavage.">Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage.</a> Nature. 551 (7681), 464-471 (2017).</li><li>Anzalone, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Search-and-replace+genome+editing+without+double-strand+breaks+or+donor+DNA.">Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA.</a> Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).</li></ol>

Denne protokol beskriver en enkel metode til funktionelle vurderinger af BRCA1-varianter ved hjælp af CRISPR-mediteret cytosinbaseeditor. Protokollen beskriver metoder til udformning af gRNA'er på mål locus og konstruktion af plasmid DLA'er, hvorfra de udtrykkes. Cytosinbaseredaktører fremkalder nukleotidkonvertering i et aktivt vindue (i tilfælde af BE3, nukleotider 4-8 i PAM-distalenden af gRNA-målsekvenserne). Forskeren bør omhyggeligt vælge målsekvenser, fordi alle cytosiner i aktivt vindue kan erst...

Brystkræft type 1 modtagelighed gen (BRCA1) er en almindeligt kendt tumor suppressor gen. Fordi BRCA1 genet er relateret til reparation af DNA-skader, mutationer i dette gen ville føre til en større risiko for kræft udvikling i en individuel1. Bryst-, æggestokkene, prostata, og kræft i bugspytkirtlen er knyttet til arvelige tab-of-funktion (LOF) mutationer af BRCA1 genet2. Funktionel vurdering og identifikation af BRCA1-varianter kan hjælpe med at forebygge og diagnosticere de forskellige sygdomme. For at løse funktionen af BRCA1 varianter, flere metoder er blevet udviklet og bredt anvendt til at undersøge patogenicitet BRCA1 varianter såsom embryonale stamceller levedygtighed assays, fluorescerende reporter assays, og terapeutisk stof-baserede følsomhed assays3,4,5,6. Selv om disse metoder har vurderet funktionen af mange BRCA1-varianter, udgør metoderne, der involverer eksogent udtrykte BRCA1-varianter, begrænsninger med hensyn til overekspression, der kan påvirke downstream-regulering, gendosering og proteinfoldning7. Desuden kan disse assays ikke udnyttes til posttranscriptional regulering såsom mRNA splejsning, udskrift stabilitet, og effekten af uoversatte region8,9.
CRISPR-Cas9-systemet muliggør målrettet genomredigering i levende celler og organismer10. Gennem en enkelt-guide RNA, cas9 kan fremkalde dobbelt-streng pauser (DSBs) i kromosomal DNA på specifikke genomiske loci med henblik på at aktivere to DNA reparation veje: fejl-tilbøjelige nonhomologous ende-sammenføjning (NHEJ) vej og fejlfri homologi-rettet reparation (HDR) vej11. HDR er en præcis reparationsmekanisme; DSB'er, der er induceret af Cas9-kerner til HDR, resulterer dog ofte i uønsket indsættelse og sletning (indel) mutation. Derudover har den brug for homologe donor-DNA-skabeloner til reparation af DNA-skader og har relativt lav effektivitet. For nylig, Cas9 nickase (nCas9) er blevet fusioneret med cytidin deaminase domæner for at målrette C: G til T: A substitutioner, uden behov for homologe DNA-skabeloner og DNA dobbelt streng pauser12,13,14,15. Ved hjælp af cytosinbaseeditoren udviklede vi en ny metode til funktionel analyse af BRCA1 varianter16.
I denne undersøgelse brugte vi CRISPR-medieret cytosin base editor, BE314, som fremkalder effektive C:G til T:A punkt mutationer, til at gennemføre den funktionelle vurdering af BRCA1 varianter og med succes identificeret funktionerne i flere BRCA1 varianter (Figur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61557/61557fig01.jpg"> Figur 1: En oversigt over arbejdsgangen for funktionel vurdering. (A)Skematisk, der viser BRCA1'sfunktionelle vurdering . Fordi LOF af BRCA1 påvirker celle levedygtighed, når BRCA1 mutation er patogen, cellerne dør som passage nummer stiger. B) Stadier i den funktionelle vurdering af BRCA1. Prikket boks er valgfri. Det kan erstattes af co-transfekt af gRNA-udtryk og BE3, der udtrykker plasmids DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61557/61557fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3136</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113903</td>
			<td>Drug for selecting transduced cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0535</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td>Genomic DNA prep. kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Medium for HEK293T/17 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000036</td>
			<td>Supplemetal for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611L</td>
			<td>Gibson assembly kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s modified Dulbecco&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440046</td>
			<td>Medium for HAP1 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lentiCas9-Blast</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52962</td>
			<td>Plasmids DNA for lentiBE3 cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Transfection materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-BE3</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>73021</td>
			<td>Plasmids DNA for lentiBE3 cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td>Supplemetal for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530SQ</td>
			<td>High-fidelity polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td>Plasmids DNA for virus prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRG2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>104174</td>
			<td>gRNA cloning vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td>Plasmids DNA for virus prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>Plasmid DNA prep. Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>Gel extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>PCR product prep. kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Ligation Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2200</td>
			<td>Ligase for gRNA cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0302</td>
			<td>Materials for T7E1 assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0145</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional assessment of brca1 variants using crispr-mediated base editors

Nylige undersøgelser har undersøgt de risici, der er forbundet med BRCA1 genmutationer ved hjælp af forskellige funktionelle vurderingsmetoder såsom fluorescerende reporter assays, embryonale stamceller levedygtighed assays, og terapeutiske lægemiddel-baserede følsomhed assays. Selv om de har afklaret en masse BRCA1 varianter, disse assays involverer brug af eksogent udtrykt BRCA1 varianter er forbundet med overekspression spørgsmål og kan ikke anvendes til post-transskriptionel regulering. For at løse disse begrænsninger har vi tidligere rapporteret en metode til funktionel analyse af BRCA1-varianter via CRISPR-medieret cytosinbaseeditor, der fremkalder målrettet nukleotiderstatning i levende celler. Ved hjælp af denne metode vi identificerede varianter, hvis funktioner forbliver tvetydige, herunder c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T og c.4986+5G>A, og bekræftede, at CRISPR-medierede basisredaktører er nyttige værktøjer til omklassificering af varianter af usikker betydning i BRCA1. Her beskriver vi en protokol til funktionel analyse af BRCA1-varianter ved hjælp af CRISPR-baseret cytosinbaseeditor. Denne protokol indeholder retningslinjer for udvælgelse af målsteder, funktionel analyse og evaluering af BRCA1-varianter.

De eksperimentelle tilgange, der er beskrevet i denne protokol, muliggør funktionel vurdering af endogene BRCA1-varianter genereret af CRISPR-baserede cytosinbaseredaktører. For at vælge passende cellelinjer til funktionel vurdering af BRCA1-varianter bør forskere bekræfte, at BRCA1 er vigtigt gen i de målrettede cellelinjer. For eksempel transfected vi først Cas9 og gRNA'er til HAP1-cellelinjer for at forstyrre BRCA1 og analyserede mutationsfrekvenser ved målrettet dyb sekvent...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors at JoVE.com

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Mennesker med BRCA1 mutationer har en højere risiko for at udvikle kræft, hvilket berettiger præcis evaluering af funktionen af BRCA1 varianter. Heri beskrev vi en protokol til funktionel vurdering af BRCA1-varianter ved hjælp af CRISPR-medierede cytosinbaseredaktører, der muliggør målrettet C:G til T:A-konvertering i levende celler.

Funktionel vurdering af BRCA1-varianter ved hjælp af CRISPR-medierede basiseditorer

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

Ved effektivt at fremkalde punktmutationer ved hjælp af CRISPR-medieret cytosinbaseredaktør kan funktionaliteten af BRCA1-varianter, som er vigtig for sygdomsforebyggelse og diagnose, identificeres. Fordelen ved denne teknik er, at den direkte muterer endogent udtrykt BRCA1, som overvinder begrænsningen af funktionel evaluering ved hjælp af eksogent udtrykt BRCA1. Identifikation af tabet af funktion mutationer af BRCA1 kan bruges til at forudsige chancen for at udvikle kræft i forbindelse med BRCA1 mutationer, såsom bryst, æggestokkene, prostata, og kræft i bugspytkirtlen.Det kan også bruges til at finde potentielle lægemiddelmål ved at søge efter essentielle gener, hvis levedygtighed reduceres gennem funktionel udtømning. Til at begynde med, få BRCA1 genom sekvens fra GenBank på NCBI og søge de 20 base par mål steder med protospacer tilstødende motiv sekvens, NGGNCCN, omkring mutation af interesse. Mutationen af interesse bør være placeret inden for fire til otte nukleotider i PAM-distal slutningen af de vejledende RNA-målsekvenser.Bestil to gratis oligonukleotider pr. guide RNA. For de forreste oligonukleotider tilsættes CACCG til 5'enden af føringssekvensen og for de omvendte oligonukleotider tilsættes AAC til 5'enden og C til 3'enden. Efter at have modtaget oligonukleotider, genbruges dem i destilleret vand til en endelig koncentration på 100 mikromolar.Bland de to gratis oligonukleotider til en endelig koncentration på 10 mikromolar med T4 ligation buffer og varme dem til 95 grader Celsius i fem minutter derefter afkøle dem til stuetemperatur for udglødning. Digest pRG2 ved hjælp af restriktionsenzymet Bsa1 i en time ved 37 grader Celsius, kør derefter det fordøjede produkt på en 1%agarose gel og rense det passende størrelse bånd. Ligate den udglødede oligonukleotid duplex til vektor DNA ved hjælp af den købte DNA ligase i henhold til producentens protokol og omdanne dem til DH5-alpha kompetente celler.Tilsæt transformanterne til en agarplade, der indeholder 100 mikrogram pr. milliliter ampicillin, og inkuber pladen natten over ved 37 grader Celsius. Rense plasma DNA fra flere transformanter og analysere deres guide RNA sekvenser af Sanger sekventering med primere, primers at prime på U6 promotor. Frø fem gange 10 til den femte HAP1-BE3 celler per brønd i 24-brønd plader en dag før transfekt og kultur dem til at nå 70 til 80% sammenløb for transfekt.Transfect BRCA1 målretning guide RNA'er ved hjælp af de købte transfection reagenser i henhold til producentens protokol. Brug et mikrogram BRCA1 målretning guide RNA'er til at fremkalde CG til TA konvertering på BRCA1 målsteder derefter inkubere cellerne ved 37 grader Celsius og subkultur hver tredje til fire dage. Høst cellepillerne tre, 10 og 24 dage efter transfekten for at analysere basisredigeringseffektivitet.Udtræk genomisk DNA ved hjælp af det genomiske DNA-rensesæt. Design de første PCR-primere til at forstærke BRCA1-målsteder. Selv om der ikke er nogen begrænsning på størrelsen af det første PCR-produkt, anbefales en produktstørrelse på mindre end en kilobase for effektivt at forstærke en bestemt region.Design den anden PCR primere placeret inde i den første PCR produkt, under hensyntagen til størrelsen af amplicon i henhold til NGS læse længde. For at vedhæfte væsentlige sekvenser til NGS-analyse skal du tilføje yderligere sekvenser til 5'enderne af de anden PCR-primere. Forstærk BRCA1-målstederne på det genomiske DNA, der er opnået fra de tre tidspunkter ved hjælp af high-fidelity polymerase.Til den første PCR-reaktion skal du bruge 100 nanogram genomisk DNA til forstærkning over 15 cyklusser. Til den anden PCR-reaktion skal du bruge en mikroliter af det første PCR-produkt til forstærkning over 20 cyklusser. Kør fem mikroliter af det andet PCR-produkt på 2%agarose gel og bekræft størrelsen.Fastgør derefter de væsentlige sekvenser til NGS-analyse ved at forstærke det andet PCR-produkt ved hjælp af primere, der er anført i tekstmanuskriptet. Forstærk hver prøve ved hjælp af forskellige primersæt. Brug en mikroliter af det andet PCR-produkt i op til 30 cyklusser af forstærkning med en high-fidelity polymerase.Kør fem mikroliter af PCR-produktet på 2%agarose gel for at bekræfte størrelsen og rense ampliconen ved hjælp af et kommercielt PCR-oprydningssæt. Bland hvert eksempel i lige store mængder for at oprette et NGS-bibliotek. Quantify NGS biblioteket ved hjælp af et spektrofotometer og fortynd det til en koncentration af en nanomolar ved hjælp af resuspension buffer eller 10 millimolar Tris-HCl ved pH 8,5.Forbered 100 mikroliter af biblioteket fortyndet til den relevante lastekoncentration. Som en kontrol kombineret PhiX med den fortyndede prøve. Indlæs biblioteket på patronen, og kør NGS i henhold til producentens protokol.Få over 10.000 aflæsninger pr. mål amplicon til dybdegående analyse af basisredigeringseffektivitet. Denne protokol blev brugt til at udføre en funktionel vurdering af endogene BRCA1-varianter genereret af CRISPR-baserede cytosinbaseredaktører. CAS-9 og guide RNA'er blev transfected i HAP1 cellelinjer for at forstyrre BRCA1, og mutationsfrekvenser blev analyseret.Mutationsfrekvenser faldt betydeligt over tid i HAP1 cellelinjer, hvilket indikerer, at BRCA1 er et vigtigt gen for celle levedygtighed i disse celler. For at undersøge, om CG til TA substituerede varianter påvirker funktionen af BRCA1, DNA plasmider og kodning guide RNA'er, der kunne fremkalde hver mutation blev transfected at have HAP1-BE3 cellelinjer. Og substitutionsfrekvenserne blev analyseret.De relative substitutionsfrekvenser på 3598C til T, en patogen variant, der fremkalder en nonsensmutation, faldt dramatisk. Mens de af 4527C til T, en godartet variant, der fremkalder en nonsens mutation, forblev ens med tiden. Det konstateredes, at nukleotidsubstitutionsfrekvenserne for disse tre varianter faldt på en tidsafhængig måde.Da det er nødvendigt at opnå en høj indledende mutationsfrekvens for klart at genkende ændringen i celle levedygtighed med vedtagelsen af datoen, er det en prioritet at etablere optimerede transfektforhold. Denne procedure kan anvendes til verificering af andre ukendte genetiske varianter såsom BRCA VUS. Det kan give fingerpeg om patogeniteten af patient-afledte ukendte varianter og deres behandling.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Brug RNA-sekventering til Detect Novel Splice Varianter Relateret til Drug Resistance i<em&gt; In vitro</em&gt; Kræft Modeller

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Ved hjælp af Functional Genomics Screening at identificere potentielt nyt lægemiddel mod cancer Cell sfæroide Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Vurdering af primære leukæmiceller metaboliske profil

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps

Morfologi-baserede skelnen mellem sund og patologiske celler udnytte Fourier transformeringer og selvorganiserende kort

The appearance and the movements of immune cells are driven by their environment. As a reaction to a pathogen invasion, the immune cells are recruited to ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Gær som et chassis til udvikling af funktionelle assays til undersøgelse af humane P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Magnetic Resonance Imaging Assessment of Carcinogen-induced Murine Bladder Tumors

Magnetic Resonance Imaging vurdering af kræftfremkaldende-inducerede Murine blære tumorer

Murine bladder tumor models are critical for the evaluation of new therapeutic options. Bladder tumors induced with the N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patient-afledt heterogene xenograft model af kræft i bugspytkirtlen ved hjælp af Zebrafish larver som værter for sammenlignende Lægemiddelvurdering

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipulation af cirkulerende tumor celler til downstream Molekylær analyse og metastatisk potentiel vurdering

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolering og funktionel vurdering af stamceller fra brystkræft fra celle- og vævsprøver

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues

Karakterisering og funktionel forudsigelse af bakterier i æggestokkene væv

The theory of a "sterile" female upper reproductive tract has been encountering increasing opposition due to advancements in bacterial detection. However, ...