Name: isolation of mouse kidney-resident cd8+ t cells for flow cytometry analysis
Uploaded: 2020-06-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis at JoVE.com

ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح AI125701 وAI139721، وبرنامج معهد أبحاث السرطان كليب وجمعية السرطان الأمريكية منحة RSG-222-01-LIB إلى N.Z. نشكر كارلا جورينا وسيباستيان مونتانينو من مرفق تدفق الدراجات. تم دعم البيانات التي تم إنشاؤها في مرفق الموارد المشتركة للتدفق من قبل مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس في سان أنطونيو (UTHSCSA) ، ومنحة المعاهد القومية للصحة / NCI P30 CA054174-20 (مركز البحوث السريرية والترجمة [CTRC] في UTHSCSA) ، وUL1 TR001120 (جائزة العلوم السريرية والترجمة).

يجب أن تتم الموافقة على جميع التجارب الحيوانية التي يتم إجراؤها بعد هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدامها المؤسسية المعنية (IACUC). وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات المذكورة هنا من قبل IACUC UT الصحة سان انطونيو.
1. نقل بالتبني من الخلايا T P14 إلى C57BL/6 المتلقين و LCMV ا?...

<ol>
	<li>Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+T+cell+subsets,+migration+patterns,+and+tissue+residence.">Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence.</a> Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).</li><li>Mueller, S. N., Mackay, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+memory+T+cells:+local+specialists+in+immune+defence.">Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence.</a> Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).</li><li>Park, C. O., Kupper, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+resident+memory+T+cells+in+protective+immunity+and+inflammatory+disease.">The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease.</a> Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).</li><li>Schenkel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+memory.+Resident+memory+CD8+T+cells+trigger+protective+innate+and+adaptive+immune+responses.">T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses.</a> Science. 346, 98-101 (2014).</li><li>Thome, J. J., Farber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+tissue-resident+T+cells:+lessons+from+humans.">Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans.</a> Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).</li><li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hobit+and+Blimp1+instruct+a+universal+transcriptional+program+of+tissue+residency+in+lymphocytes.">Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes.</a> Science. 352, 459-463 (2016).</li><li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-box+Transcription+Factors+Combine+with+the+Cytokines+TGF-beta+and+IL-15+to+Control+Tissue-Resident+Memory+T+Cell+Fate.">T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate.</a> Immunity. 43, 1101-1111 (2015).</li><li>Milner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Runx3+programs+CD8(+)+T+cell+residency+in+non-lymphoid+tissues+and+tumours.">Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours.</a> Nature. 552, 253-257 (2017).</li><li>Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Specific+Control+of+Tissue-Resident+Memory+T+Cells.">Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells.</a> Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).</li><li>Steinert, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Memory+CD8+T+Cells+Reveals+Regionalization+of+Immunosurveillance.">Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance.</a> Cell. 161, 737-749 (2015).</li><li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Lymphocytes+from+the+Mouse+Small+Intestinal+Immune+System.">Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).</li><li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes.">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).</li><li>Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+Controls+the+Formation+of+Kidney-Resident+T+Cells+via+Promoting+Effector+T+Cell+Extravasation.">TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation.</a> Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).</li><li>Gebhardt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+patterns+of+peripheral+migration+by+memory+CD4++and+CD8++T+cells.">Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells.</a> Nature. 477, 216-219 (2011).</li><li>Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARTC2.2/P2RX7+Signaling+during+Cell+Isolation+Distorts+Function+and+Quantification+of+Tissue-Resident+CD8(+)+T+Cell+and+Invariant+NKT+Subsets.">ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets.</a> Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).</li><li>Fernandez-Ruiz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-Resident+Memory+CD8(+)+T+Cells+Form+a+Front-Line+Defense+against+Malaria+Liver-Stage+Infection.">Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection.</a> Immunity. 45, 889-902 (2016).</li><li>Beura, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalizing+the+environment+recapitulates+adult+human+immune+traits+in+laboratory+mice.">Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice.</a> Nature. 532, 512-516 (2016).</li></ol>

وبما أن مناعة الأنسجة المحددة هي مجال سريع التوسع في البحث، فإن تراكم الأدلة يشير إلى أن الخلايا المناعية، وخاصة الخلايا اللمفاوية يمكن تحديدها في جميع الأعضاء تقريبًا في الفئران البشرية أو المصابة أو المحصنة. LCMV نموذج عدوى الماوس هو نموذج راسخ لدراسة مستضدية محددة الخلية استجابة، والمف...

تمثل الخلايا التائية الخلايا النسيجية المقيمة (TRM)واحدة من أكثر الخلايا T في وفرة في الفئران البشرية المصابة والبالغة. TRM الخلايا توفير الخط الأول من الدفاع المناعي وتشارك بشكل حاسم في مختلف العمليات الفسيولوجية والمرضية1,2,3,4,5. مقارنة مع الخلايا T المتداولة، TRM الخلايا تحمل علامات سطح متميزة مع برامج النسخ فريدة من نوعها6،7،8. توسيع معرفتنا ببيولوجيا TRM هو المفتاح لفهم استجابات الخلايا التاتية التي تعتبر ضرورية لتطوير اللقاحات و العلاج المناعي في المستقبل.
بالإضافة إلى العلامات الجزيئية المشتركة المشتركة من TRMs عبر جميع الأنسجة غير اللمفاوية ، تشير الأدلة المتراكمة إلى أن السمات الخاصة بالأنسجة هي مكون مركزي من مادة البرمجة9. الكلى المرافئ العديد من الخلايا المناعية بما في ذلك خلاياجمهورية مقدونيا T بعد العدوى، ويوفر فرصة كبيرة لدراسة الخلايا TRM البيولوجيا في الأنسجة غير المخاطية. LCMV الحاد (التهاب الكورميات اللمفاوية فيروس) العدوى عن طريق الطريق intraperitoneal هو نموذج العدوى النظامية راسخة لدراسة استجابات الخلايا التائية المستضدية محددة في الفئران. وعادة ما يتم حل العدوى في 7-10 أيام في الفئران من النوع البري وترك عدد كبير من الخلايا T الذاكرة LCMV محددة في مجموعة متنوعة من الأنسجة، بما في ذلك الكلى10. P14 TCR (T cell receptor) الفئران المعدلة وراثيا تحمل CD8+ T الخلايا تعترف واحدة من epitopes المناعي المهيمنة من LCMV التي قدمها MHC-I (الفئة الأولى الرئيسية مجمع الهس القدرة على المنافسة) جزيء H2-Db في C57BL/6 الفئران. الجمع بين congenically P14 T نقل بالتبني الخلية وعدوى LCMV في الفئران، CD8+ effector والذاكرة الخلايا T يتم تتبعها، بما في ذلك TRM التمايز و homeostasis.
في بعض الأنسجة الحاجز، مثل الغدد الليمفاوية داخل الأمعاء (IEL) مقصورات الغدد اللعابية، أنشئت عملية عزل الخلايا الليمفاوية تسفر عن نسبة عالية من خلايا TRM مع الحد الأدنى من التلوث الخلايا T المنقولة بالدم في نموذج LCMV الماوس11. ومع ذلك، في الأنسجة غير الحاجز، مثل الكلى، شبكة الأوعية الدموية الكثيفة يحتوي على عدد كبير من الخلايا CD8+ T تعميم. وقد تم توثيقها جيدا أنه حتى perfusion ناجحة لا يمكن أن إزالة بكفاءة جميع تعميم CD8+ الخلايا T. للتغلب على هذه العقبة التقنية ، تم تأسيس تلطيخ الأجسام المضادة داخل الأوعية كواحد من التقنيات الأكثر استخدامًا في TRM مختبرات12. وباختصار، قبل 3-5 دقائق من القتل الرحيم، يتم تسليم 3 ميكروغرام/فأرة مضادة للأجسام المضادة CD8 (لتسمية CD8+ T cells) عن طريق الوريد. جدار الأوعية الدموية سليمة يمنع الانتشار السريع للجسم المضاد في غضون هذه الفترة القصيرة من الزمن (أي 3-5 دقائق) ويتم تسمية الخلايا داخل الأوعية فقط. بعد بروتوكول عزل الخلايا الليمفاوية القياسية، يمكن تمييز الخلايا داخل الأوعية مقابل الخلايا الإكستائية بسهولة باستخدام عملية استئصال الخلايا المتدفقة.
هنا، سوف نصف بروتوكول قياسي يستخدم عادة في مختبراتT RM لأداء وضع العلامات داخل الأوعية الدموية، والعزل اللمفاوي وتحليل تدفق الخلايا الخلوية CD8+ الخلايا التائية باستخدام C57BL/6 الماوس الذي تلقى CD45.1+ P14 الخلايا T و LCMV العدوى قبل 30 يوما13. ويمكن استخدام نفس البروتوكول لدراسة كل من الخلايا التي تؤثر على الجسم والذاكرة T في الكلى.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37C incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>30-0081-U025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf Serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30073.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collegenase B</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11088807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS 5692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mojosort Mouse CD8 Na&#239;ve T Cells Isolation Kit</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>overhead heat lamp</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00333PZZG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17089101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rocker</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30096.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid Brass Mouse Restrainer</td>
			<td>Braintree Scientific, Inc</td>
			<td>SAI-MBR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing Bucket Centrifuge with refrigerator</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture 6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse kidney-resident cd8+ t cells for flow cytometry analysis

الأنسجة المقيمة الخلية T (TRM)هو حقل سريع التوسع من بحوث المناعة. عزل الخلايا التائية من الأنسجة غير اللمفاوية المختلفة هي واحدة من الخطوات الرئيسية للتحقيق TRMs. هناك اختلافات طفيفة في بروتوكولات عزل الخلايا الليمفاوية لمختلف الأعضاء. الكلى هو جهاز أساسي غير اللمفي مع العديد من اختراق الخلايا المناعية خاصة بعد التعرض لمسببات الأمراض أو تنشيط المناعة الذاتية. في السنوات الأخيرة، بدأت مختبرات متعددة بما في ذلك منطقتنا تميز الكلى مقيم CD8+ الخلايا التائية في مختلف الإعدادات الفسيولوجية والمرضية في كل من الماوس والإنسان. بسبب وفرة الخلايا الليمفاوية T، الكلى يمثل جهاز نموذج جذاب لدراسة TRMs في الأنسجة غير المخاطية أو غير الحاجز. هنا، سوف نصف بروتوكول يستخدم عادة في TRM-مختبرات تركز على عزل CD8+ الخلايا T من الكلى الماوس بعد العدوى الفيروسية الجهازية. باختصار، باستخدام فيروس التهاب الكورميات اللمفاوية الحاد (LCMV) نموذج العدوى في C57BL/6 الفئران، ونحن نبرهن على CD8 داخل الأوعيةالدموية + T الخلايا التسميات، والهضم الأنزيمية، وكثافة الانحدار الطرد المركزي لعزل وإثراء الخلايا الليمفاوية من الكلى الماوس لجعل العينات جاهزة لتحليل تدفق الخلايا اللاحقة.

البروتوكول الموضح هنا ملخص في مخطط تدفقي (الشكل 1A). في اليوم 30 بعد عدوى LCMV، قمنا بالوسم داخل الأوعية الدموية من الخلايا CD8+ T. بعد 5 دقائق ، تم تشريح كليتي الحيوان ، وتم سلخه ، وإخضاعه لعملية الهضم الكولاجينية. تم تنقية الخلايا الليمفاوية من العينات المهضومة عبر الطرد ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis at JoVE.com

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

بعد العدوى الفيروسية, الكلى المرافئ عددا كبيرا نسبيا من CD8+ الخلايا T ويوفر فرصة لدراسة غير المخاطية Tالخلايا RM. هنا، نحن وصف بروتوكول لعزل الخلايا الليمفاوية الكلى الماوس لتحليل تدفق الخلايا.

عزل الماوس الكلى المقيم CD8+ الخلايا T لتحليل تدفق cytometry

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

تحتوي خلايا CD8+T على ميزات مميزة في الأنسجة المختلفة، كمثال حاسم على الأنسجة غير المخاطية وغير اللمفاوية. من الضروري أن تميز مباشرة الخلايا المقيمة في الكلى لفهم كامل بيولوجيا الخلايا التائية. هنا سوف نبرهن على طريقتنا المريحة لعزل خلايا CD8 + T المقيمة في الكلى التي تستوعب تحليل قياس الخلايا في التدفق اللاحق.هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة دراسات من الخلايا CD8 + T الأثر والذاكرة ولدت بعد العدوى، فضلا عن الاستجابات المناعة الذاتية. سيتم إجراء العملية من قبل الدكتور تشاويو ما، وهو عالم أبحاث لمختبري. تبدأ عن طريق تخفيف البيوتين المضادة لتكلس CD8 ألفا إلى 15 ميكروغرام لكل ملليلتر في برنامج تلفزيوني، والتأكد من أن هناك ما يكفي لإدارة 200 ميكرولترات لكل فأرة.قبل الحقن، سخني الوريد الذيل من الفأرة بمصباح حرارة علوي لمدة خمس إلى 10 دقائق لتمدده. رسم 200 ميكرولترات من مزيج الأجسام المضادة المخففة قبل إلى حقنة الأنسولين 28 قياس وإزالة أي فقاعات الهواء عن طريق تحريك المكبس صعودا وهبوطا. ثني الإبرة لخلق زاوية 150 درجة بين الإبرة والمحاقن، شطب، بحيث الإبرة موازية للوريد الذيل.كبح جماح الماوس مع تقييد القوارض ورش الذيل مع 70٪ الإيثانول لجعل الوريد مرئية بوضوح. عقد الذيل في نهاية القاصي مع الإبهام والأصابع الوسطى من اليد غير المهيمنة، ثم وضع السبابة تحت موقع الحقن. مع اليد المهيمنة إدراج الإبرة في الوريد في موازاة اتجاه القلب وحقن ببطء 200 ميكرولترات من الجسم المضاد.إزالة الإبرة وضغط بلطف موقع الحقن حتى يتوقف النزيف. بعد القتل الرحيم الماوس، تشريح الكلى مع مقص ونقلها إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 ملليلتر. اترك العينات على الجليد حتى مزيد من المعالجة.إعداد لوحات ستة-جيدا مع ثلاثة ملليلتر من حل الهضم في كل بئر, باستخدام بئر واحد لكل فأر, وتخزينها على الجليد. إضافة 300 ميكرولترات من حل الهضم في كل أنبوب عينة و mince عينات الكلى مع مقص الربيع على التوالي. نقل عينات الكلى المفروم إلى لوحات ستة- جيدا مع حل الهضم.احتضان العينات في 37 درجة مئوية مع هزاز لطيف لمدة 45 دقيقة، ثم التجانس الأنسجة مع شفة المكبس من حقنة ثلاثة ملليلتر ونقلها إلى أنابيب مخروطية 15 ملليلتر. تدور العينات في أسفل 500 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. إزالة افرنح و resuspend بيليه في ثلاثة ملليلتر من RPMI مع 10٪ FCS.تدور أسفل العينة في 500 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق، ثم إزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية مع خمسة ملليلتر من 44٪ كثافة التدرج المتوسطة ومزيج RPMI. وضع غيض من ماصة ثلاثة ملليلتر تحتوي على ثلاثة ملليلتر من 67٪ كثافة الانحدار المتوسطة وBBS مباشرة إلى الجزء السفلي من كل أنبوب والإفراج ببطء الحل بحيث يشكل الحل الثقيل طبقة متميزة في الجزء السفلي. قم بتدوير العينات بمعدل 900 مرة من g لمدة 20 دقيقة مع إعدادات المسرع والفرامل المخفضة، ثم قم بإزالة الأنابيب بعناية من جهاز الطرد المركزي دون إزعاج الطبقات.إزالة الطبقة العليا مع ماصة نقل دون لمس طبقة الخلايا الليمفاوية ونقل طبقة الخلايا الليمفاوية إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر. ملء أنبوب مع برنامج تلفزيوني و5٪ FCS، ثم مزيج عن طريق عكس ببطء الأنبوب أربع إلى ست مرات. بعد الطرد المركزي للعينات في 500 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق، وإزالة سوبرنات وإعادة بناء بيليه الخلية مع 500 ميكرولترات من كامل متوسطة RPMI.الخلايا جاهزة الآن للانطلاق في التلطخ للخلايا. حتى بعد كثافة الطارد المركزي بوساطة الغدد الليمفاوية التخصيب، كان من الشائع جدا أن نرى جزءا كبيرا من الخلايا الليمفاوية غير في المنتج النهائي. ومع ذلك، بعد الحصول على الخلايا الليمفاوية الحية، كان من السهل تحديد الخلايا الليمفاوية CD8 + T.كما هو متوقع، فقط خارج الأوعية الدموية CD8 + T الخلايا المكتسبة بكفاءة الأنسجة الذاكرة المقيمة T-الخلايا الظاهرية، مثل رفع من CD69 و downregulation من Ly6C. وعلى النقيض من الفئران المصابة، فإن الغالبية العظمى من خلايا CD8 +T المعزولة عن الفئران الساذجة الصغيرة الموجودة في مرفق SPF كانت تحمل اسمًا باجسام مضادة لـ CD8 Alpha وبالتالي فهي تنتمي إلى المقصورة داخل الأوعية الدموية. وقد سرّع هذا الأسلوب إلى حد كبير من التحقيق في الخلايا المناعية المقيمة في الأنسجة في الأعضاء ذات الأوعية الدموية الكثيفة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

تحليل التدفق الخلوي للخلايا المناعية وفي الفئران Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

التصوير كله والحيوان وتدفق Cytometric تقنيات CD8 + T الردود خلية التحليل من Antigen محددة بعد الجسيمات النانوية التطعيم

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

استخدام التدفق الخلوي لتقييم حالة لونين في خلايا T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من الخلايا المناعية من الدماغ الدماغية ماوس

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

مضان تنشيط الفرز الخليوي لتنقية الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل من الفأر نخاع العظم

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

العزلة وتدفق Cytometric تحليل الإنسان باطن عنق الرحم غاما دلتا الخلايا التائية

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

قياس T خلية Alloreactivity عن طريق التصوير التدفق الخلوي

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

التدفق متعدد الألوان المستندة إلى الخلوي الكمي الميتوكوندريا وليسوسوميس في خلايا تي

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

إعداد نخاع العظام كله لتحليل الكتلة الخلايا من الخلايا العدلية النسب

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...