Name: isolation of mouse kidney-resident cd8+ t cells for flow cytometry analysis
Uploaded: 2020-06-27T14:00:00
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这项工作得到了NIH赠款AI125701和AI139721，癌症研究所剪辑计划和美国癌症协会赠款RSG-18-222-01-LIB到N.Z的支持。我们感谢来自流细胞测量设施的卡拉·戈雷纳和塞巴斯蒂安·蒙塔尼诺。在流量细胞学共享资源设施中生成的数据得到位于圣安东尼奥的德克萨斯大学健康科学中心（UTHSCSA）、NIH/NCI赠款P30 CA054174-20（UTHSCSA的临床和转化研究中心[CTRC]）和UL1 TR001120（临床和转化科学奖）的支持。

所有按照本协议进行的动物实验都必须得到相关机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。此处描述的所有程序都已由 IACUC UT 健康圣安东尼奥批准。
1. P14 T细胞的采用性转移至C57BL/6接受者和LCMV感染
<ol><li>在6-12周大时使用P14小鼠。确保捐赠P14 TCR转基因小鼠的性别应与C57BL/6受接受小鼠的性别相匹配。否则，雄性T细胞等细胞转移到雌性小鼠中，将在12天14左右导致循环供体T...

<ol>
	<li>Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+T+cell+subsets,+migration+patterns,+and+tissue+residence.">Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence.</a> Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).</li><li>Mueller, S. N., Mackay, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+memory+T+cells:+local+specialists+in+immune+defence.">Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence.</a> Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).</li><li>Park, C. O., Kupper, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+resident+memory+T+cells+in+protective+immunity+and+inflammatory+disease.">The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease.</a> Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).</li><li>Schenkel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+memory.+Resident+memory+CD8+T+cells+trigger+protective+innate+and+adaptive+immune+responses.">T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses.</a> Science. 346, 98-101 (2014).</li><li>Thome, J. J., Farber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+tissue-resident+T+cells:+lessons+from+humans.">Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans.</a> Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).</li><li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hobit+and+Blimp1+instruct+a+universal+transcriptional+program+of+tissue+residency+in+lymphocytes.">Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes.</a> Science. 352, 459-463 (2016).</li><li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-box+Transcription+Factors+Combine+with+the+Cytokines+TGF-beta+and+IL-15+to+Control+Tissue-Resident+Memory+T+Cell+Fate.">T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate.</a> Immunity. 43, 1101-1111 (2015).</li><li>Milner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Runx3+programs+CD8(+)+T+cell+residency+in+non-lymphoid+tissues+and+tumours.">Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours.</a> Nature. 552, 253-257 (2017).</li><li>Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Specific+Control+of+Tissue-Resident+Memory+T+Cells.">Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells.</a> Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).</li><li>Steinert, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Memory+CD8+T+Cells+Reveals+Regionalization+of+Immunosurveillance.">Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance.</a> Cell. 161, 737-749 (2015).</li><li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Lymphocytes+from+the+Mouse+Small+Intestinal+Immune+System.">Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).</li><li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes.">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).</li><li>Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+Controls+the+Formation+of+Kidney-Resident+T+Cells+via+Promoting+Effector+T+Cell+Extravasation.">TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation.</a> Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).</li><li>Gebhardt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+patterns+of+peripheral+migration+by+memory+CD4++and+CD8++T+cells.">Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells.</a> Nature. 477, 216-219 (2011).</li><li>Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARTC2.2/P2RX7+Signaling+during+Cell+Isolation+Distorts+Function+and+Quantification+of+Tissue-Resident+CD8(+)+T+Cell+and+Invariant+NKT+Subsets.">ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets.</a> Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).</li><li>Fernandez-Ruiz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-Resident+Memory+CD8(+)+T+Cells+Form+a+Front-Line+Defense+against+Malaria+Liver-Stage+Infection.">Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection.</a> Immunity. 45, 889-902 (2016).</li><li>Beura, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalizing+the+environment+recapitulates+adult+human+immune+traits+in+laboratory+mice.">Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice.</a> Nature. 532, 512-516 (2016).</li></ol>

由于组织特异性免疫是一个快速扩展的研究领域，积累证据表明，免疫细胞，特别是淋巴细胞种群可以在成人人类或受感染或免疫小鼠的几乎所有器官中识别。LCMV小鼠感染模型是研究抗原特异性T细胞反应、效应和记忆T细胞分化（包括TRM生物学在内的多个组织） 的成熟模型。在这里，我们描述了一个分析肾中的CD8+T 细胞的协议。该协议在很大程度上改编自以TRM<sup class="xre...

组织居民记忆 （TRM） T 细胞是成年人类和受感染小鼠中最丰富的 T 细胞群之一.TRM细胞提供免疫防御的第一线，并严重参与各种生理和病理过程1，2，3，4，5。与循环T细胞相比，TRM细胞携带独特的表面标记与独特的转录程序6，7，8。扩大我们对TRM生物学的了解是了解T细胞反应的关键，而T细胞反应对于T细胞疫苗和免疫疗法的未来发展至关重要。
除了在所有非淋巴组织中共同共享的TRM分子标记外，积累的证据表明，组织特异性特征是TRM 生物学9的核心成分。肾脏在感染后含有许多免疫细胞，包括TRM 细胞，为研究非粘膜组织中TRM 细胞生物学提供了绝佳的机会。急性LCMV（淋巴细胞性胆囊炎病毒）通过内皮内途径感染是研究小鼠抗原特异性T细胞反应的成熟系统感染模型。感染通常在野生型小鼠的7-10天内解决，并在各种组织中留下大量的LCMV特异性记忆T细胞，包括肾脏10。P14 TCR（T细胞受体）转基因小鼠携带CD8+T 细胞，可识别由MHC-I（I类主要组织相容性复合物）分子H2-D b在C57BL/6小鼠 中呈现的LCMV免疫显性表一。结合在小鼠中结合标记的P14 T细胞收养转移和LCMV感染，CD8+效应 和记忆T细胞被跟踪，包括TRM 分化和平衡。
在某些屏障组织中，如肠道内腹淋巴细胞（IEL）隔间和唾液腺，建立的淋巴细胞分离程序产生高百分比的TRM细胞 与最小的血性T细胞污染在小鼠LCMV模型11。然而，在非屏障组织中，如肾脏，密集的血管网络中含有大量的循环CD8+T 细胞。有据可查，即使成功灌注也不能有效去除所有循环的CD8+T 细胞。为了克服这一技术障碍，血管内抗体染色已确立为T RM实验室12中最常用的 技术之一。简言之，在安乐死前3-5分钟，静脉注射3微克/小鼠抗CD8抗体（给CD8+T 细胞贴标签）。完整的血管壁可防止抗体在如此短的时间内（即3-5分钟）快速扩散，并且只有血管内细胞被标记。按照标准的淋巴细胞分离方案，血管内细胞与血管外细胞可以很容易地区分使用流细胞学。
在这里，我们将描述一个标准协议，常用在TRM 实验室执行血管内标签，淋巴细胞分离和流动细胞分析肾脏CD8+ T细胞使用C57BL/6小鼠，已收到CD45.1+ P14 T细胞和LCMV感染30天前13。相同的协议可用于研究肾脏中的效应器和记忆T细胞。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37C incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>30-0081-U025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf Serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30073.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collegenase B</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11088807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS 5692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mojosort Mouse CD8 Na&#239;ve T Cells Isolation Kit</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>overhead heat lamp</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00333PZZG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17089101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rocker</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30096.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid Brass Mouse Restrainer</td>
			<td>Braintree Scientific, Inc</td>
			<td>SAI-MBR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing Bucket Centrifuge with refrigerator</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture 6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse kidney-resident cd8+ t cells for flow cytometry analysis

组织驻留记忆T细胞（TRM）是免疫学研究领域的一个迅速扩展的领域。将T细胞从各种非淋巴组织中隔离是研究T RM s的关键步骤之一。不同器官的淋巴细胞分离方案有轻微的变异。肾脏是一种重要的非淋巴器官，具有许多免疫细胞渗透，尤其是在病原体暴露或自身免疫激活之后。近年来，包括我们自己的实验室已经开始在小鼠和人类的各种生理和病理环境中对肾脏居民CD8+T 细胞进行特征化。由于T淋巴细胞的丰富，肾脏是一个有吸引力的模型器官，研究TRM在非粘膜或非屏障组织。在这里，我们将描述一个协议，常用在TRM为重点的实验室，以分离CD8+T 细胞从小鼠肾脏后，全身病毒感染。简单地说，在C57BL/6小鼠中，使用急性淋巴细胞性胆囊炎病毒（LCMV）感染模型，我们演示血管内CD8+T 细胞标记、酶消化和密度梯度离心，以分离和丰富小鼠肾脏中的淋巴细胞，使样本为随后的流动囊细胞分析做好准备。

此处描述的协议在流程图中汇总（图1A）。在LCMV感染后的第30天，我们进行了CD8+T细胞的血管内标记。5分钟后，动物的两个肾脏被解剖，切碎，并受到胶原酶消化。淋巴细胞通过 Percoll 离心从消化的样品中进一步纯化，并通过流式细胞学进行分析。如图1B所示，即使在密度离心-中继淋巴细胞富集之后，在最终产品中看到大量非淋巴细胞也是很常...

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Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

病毒感染后，肾脏含有相对大量的CD8+T 细胞，并提供一个机会来研究非粘膜TRM 细胞。在这里，我们描述了一个方案，分离小鼠肾淋巴细胞流动细胞学分析。

小鼠肾-居民CD8+T 细胞的分离，用于流细胞测量分析

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

CD8+T细胞在不同的组织中具有独特的特征，是非粘膜和非淋巴组织的关键例子。要充分了解T细胞生物学，必须直接描述肾居民细胞的特征。在这里，我们将演示我们分离肾居民CD8+T细胞的方便方法，以容纳随后的流动细胞学分析。这种方法可以深入了解感染后产生的效应器和记忆CD8+T细胞的研究以及自身免疫反应。手术将由我实验室的研究科学家马超宇博士进行。首先将生物素抗CD8 alpha抗体稀释至PBS中每毫升15微克，确保每只小鼠有足够的200微升。注射前，用架空热灯加热小鼠的尾静脉 5 到 10 分钟，以扩张。将200微升的预稀释抗体混合物抽入28量胰岛素注射器中，通过上下移动活塞去除任何气泡。弯曲针头，在针头和注射器之间形成150度角，斜向上，使针头平行于尾静脉。用啮齿动物抑制鼠标，用70%乙醇喷洒尾巴，使静脉清晰可见。用非显性手的拇指和中指将尾巴放在端端，然后将食指放在注射部位下方。用主导性手将针头平行插入静脉，向心脏方向插入，并缓慢注射200微升抗体。取出针头并轻轻压缩注射部位，直到出血停止。对鼠标进行安乐死后，用剪刀解剖肾脏，将其转移到1.5毫升的微型离心管中。将样品留在冰上，直到进一步处理。在每个井中用三毫升的消化液准备六孔板，每只鼠标使用一孔，并将其储存在冰上。在每个样品管中加入300微升的消化液，用直弹簧剪刀将肾脏样品切碎。使用消化液将切碎的肾脏样本转移到六孔板。在37摄氏度下用轻轻摇动孵育样品45分钟，然后用三毫升注射器的柱塞法兰使组织均匀化，然后转移到15毫升锥形管中。将样品在 500 倍 g 和 4 摄氏度下旋转 5 分钟。取出上一提液，用10%FCS将颗粒重新用三毫升的RPMI中重新暂停。在 500 倍 g 和 4 摄氏度下旋转样品 5 分钟，然后取出上总因物，然后用 5 毫升 44% 密度梯度介质和 RPMI 混合物重新填充细胞颗粒。将含有三毫升67%密度梯度介质和PBS的三毫升移液器的尖端直接放在每个管的底部，然后慢慢释放溶液，使重溶液在底部形成一个独特的层。在减少油门和制动设置的情况下，以 900 次 g 旋转样品 20 分钟，然后小心地将管子从离心机中拆下，而不会干扰层。在不接触淋巴细胞层的情况下，用转移移液器去除顶层，将淋巴细胞层转移到新的 15 毫升管中。用 PBS 和 5%FCS 填充管子，然后缓慢反转管四到六次。在 500 倍 G 和 4 摄氏度下离心样品 5 分钟后，取出上经剂，用 500 微升完整的 RPMI 介质重新暂停细胞颗粒。细胞现在已准备好流动细胞测量染色。即使在密度离心-中继淋巴细胞富集之后，在最终产品中看到大部分非淋巴细胞也是很常见的。然而，在获得活淋巴细胞后，CD8+T淋巴细胞很容易识别。正如预期的那样，只有血管外CD8+T细胞有效获得组织驻留记忆T细胞表型，如CD69的上调节和Ly6C的降低调节。与受感染的小鼠相比，从位于SPF设施的年轻天真小鼠身上分离出的绝大多数CD8+T细胞都标有CD8α抗体，因此属于血管内。这项技术大大加快了对密集血管器官组织居民免疫细胞的培养。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

流式细胞仪分析小鼠主动脉内流的免疫细胞

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

科研

免疫与感染

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

对于纳米颗粒疫苗接种后的分析抗原特异性CD8 + T细胞应答整体动物成像和流式细胞技术

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

流式细胞仪用来评估染色质的T细胞国家

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

分离和流式细胞仪分析从缺血小鼠脑免疫细胞

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

荧光激活细胞分选从小鼠骨髓浆树突状细胞的分离纯化

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

人类宫颈的γδT细胞的分离和流式细胞仪分析

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

使用成像流式细胞仪T细胞同种异体反应性测定

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

小鼠与人肺泡巨噬细胞的分离和体外培养

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

基于多色流式细胞仪的 t 细胞线粒体和溶酶体的定量

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

全骨髓的制备,用于中性粒系细胞的大规模细胞测定分析

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...