Name: isolation of mouse kidney-resident cd8+ t cells for flow cytometry analysis
Uploaded: 2020-06-27T14:00:00
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Diese Arbeit wird unterstützt durch NIH-Stipendien AI125701 und AI139721, Cancer Research Institute CLIP-Programm und American Cancer Society Grant RSG-18-222-01-LIB an N.Z. Wir danken Karla Gorena und Sebastian Montagnino von Flow Cytometry Facility. Die in der Flow Cytometry Shared Resource Facility generierten Daten wurden vom University of Texas Health Science Center in San Antonio (UTHSCSA), dem NIH/NCI-Stipendium P30 CA054174-20 (Clinical and Translational Research Center [CTRC] at UTHSCSA) und UL1 TR001120 (Clinical and Translational Science Award) unterstützt.

Alle Tierversuche, die nach diesem Protokoll durchgeführt werden, müssen vom jeweiligen institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -nutzung (IACUC) genehmigt werden. Alle hier beschriebenen Verfahren wurden von IACUC UT Health San Antonio genehmigt.
1. Adoptivtransfer von P14-T-Zellen in C57BL/6-Empfänger und LCMV-Infektion
<ol><li>Verwenden Sie P14-Mäuse im Alter von 6-12 Wochen. Stellen Sie sicher, dass das Geschlecht der spenderischen P14 TCR transgene Maus mit dem Geschlecht von ...

<ol>
	<li>Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+T+cell+subsets,+migration+patterns,+and+tissue+residence.">Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence.</a> Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).</li><li>Mueller, S. N., Mackay, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+memory+T+cells:+local+specialists+in+immune+defence.">Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence.</a> Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).</li><li>Park, C. O., Kupper, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+resident+memory+T+cells+in+protective+immunity+and+inflammatory+disease.">The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease.</a> Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).</li><li>Schenkel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+memory.+Resident+memory+CD8+T+cells+trigger+protective+innate+and+adaptive+immune+responses.">T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses.</a> Science. 346, 98-101 (2014).</li><li>Thome, J. J., Farber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+tissue-resident+T+cells:+lessons+from+humans.">Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans.</a> Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).</li><li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hobit+and+Blimp1+instruct+a+universal+transcriptional+program+of+tissue+residency+in+lymphocytes.">Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes.</a> Science. 352, 459-463 (2016).</li><li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-box+Transcription+Factors+Combine+with+the+Cytokines+TGF-beta+and+IL-15+to+Control+Tissue-Resident+Memory+T+Cell+Fate.">T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate.</a> Immunity. 43, 1101-1111 (2015).</li><li>Milner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Runx3+programs+CD8(+)+T+cell+residency+in+non-lymphoid+tissues+and+tumours.">Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours.</a> Nature. 552, 253-257 (2017).</li><li>Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Specific+Control+of+Tissue-Resident+Memory+T+Cells.">Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells.</a> Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).</li><li>Steinert, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Memory+CD8+T+Cells+Reveals+Regionalization+of+Immunosurveillance.">Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance.</a> Cell. 161, 737-749 (2015).</li><li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Lymphocytes+from+the+Mouse+Small+Intestinal+Immune+System.">Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).</li><li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes.">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).</li><li>Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+Controls+the+Formation+of+Kidney-Resident+T+Cells+via+Promoting+Effector+T+Cell+Extravasation.">TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation.</a> Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).</li><li>Gebhardt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+patterns+of+peripheral+migration+by+memory+CD4++and+CD8++T+cells.">Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells.</a> Nature. 477, 216-219 (2011).</li><li>Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARTC2.2/P2RX7+Signaling+during+Cell+Isolation+Distorts+Function+and+Quantification+of+Tissue-Resident+CD8(+)+T+Cell+and+Invariant+NKT+Subsets.">ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets.</a> Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).</li><li>Fernandez-Ruiz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-Resident+Memory+CD8(+)+T+Cells+Form+a+Front-Line+Defense+against+Malaria+Liver-Stage+Infection.">Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection.</a> Immunity. 45, 889-902 (2016).</li><li>Beura, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalizing+the+environment+recapitulates+adult+human+immune+traits+in+laboratory+mice.">Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice.</a> Nature. 532, 512-516 (2016).</li></ol>

Da die gewebespezifische Immunität ein schnell wachsendes Forschungsgebiet ist, deuten anhäufende Beweise darauf hin, dass Immunzellen, insbesondere Lymphozytenpopulation, in fast allen Organen von erwachsenen menschlichen oder infizierten oder immunisierten Mäusen identifiziert werden können. LCMV-Mausinfektionsmodell ist ein etabliertes Modell zur Untersuchung der antigenspezifischen T-Zell-Reaktion, Despezifikum und Speicher-T-Zelldifferenzierung einschließlichT RM-Biologie über mehrere Gewebe hinweg....

Gewebe-Resident-Gedächtnis (TRM) T-Zellen stellen eine der am häufigsten vorkommenden T-Zellpopulationen bei erwachsenen menschlichen und infizierten Mäusen dar. TRM-Zellen bieten die erste Linie der Immunabwehr und sind kritisch in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt1,2,3,4,5. Im Vergleich zu zirkulierenden T-Zellen tragenT-RM-Zellen unterschiedliche Oberflächenmarker mit einzigartigen Transkriptionsprogrammen6,7,8. Die Erweiterung unseres Wissens über tRM-Biologie ist der Schlüssel zum Verständnis von T-Zell-Antworten, die für die zukünftige Entwicklung von T-Zell-basierten Impfstoffen und Immuntherapien unerlässlich sind.
Zusätzlich zu den gemeinsam genutzten molekularen Markern von TRMs über alle nicht-lymphoiden Gewebe deuten ansammelnde Beweise darauf hin, dass gewebespezifische Merkmale ein zentraler Bestandteil der TRM-Biologie sind 9. Niere beherbergt viele Immunzellen einschließlich TRM Zellen nach der Infektion und bietet eine große Chance, TRM Zellbiologie in einem nicht-mukosalen Gewebe zu studieren. Akute LCMV (lymphocytic choriomeningitis virus) Infektion über intraperitonealen Weg ist ein gut etabliertes systemisches Infektionsmodell, um antigenspezifische T-Zell-Reaktionen bei Mäusen zu untersuchen. Die Infektion wird in der Regel in 7-10 Tagen in Wildtyp Mäuse gelöst und hinterlässt eine große Anzahl von LCMV-spezifischen Speicher T-Zellen in einer Vielzahl von Geweben, einschließlich der Niere10. P14 TCR (T-Zellrezeptor) transgene Mäuse tragen CD8+ T-Zellen erkennen eines der immun-dominanten Epitope von LCMV präsentiert von MHC-I (Klasse I Haupt Histokompatibilitätskomplex) Molekül H2-Db in C57BL/6 Mäusen. Die Kombination kongenös markierter P14 T-Zell-Adoptivübertragung und LCMV-Infektion bei Mäusen, CD8+ Effektor- und Memory-T-Zellen werden verfolgt, einschließlich TRM-Differenzierung und Homöostase.
In einigen Barrieregeweben, wie intestinalen intraepitheliaalen Lymphozyten (IEL) und Speicheldrüsen, führt etablierte Lymphozytenisolationsverfahren zu einem hohen Prozentsatz von TRM-Zellen mit minimaler blutübertragener T-Zellkontamination im Maus-LCMV-Modell11. Jedoch, in Nicht-Barriere-Gewebe, wie die Niere, dichte skuläre Netzwerk enthält eine große Anzahl von zirkulierenden CD8+ T-Zellen. Es ist gut dokumentiert, dass selbst eine erfolgreiche Perfusion nicht alle zirkulierenden CD8+ T-Zellen effizient entfernen kann. Um diese technische Hürde zu überwinden, wurde die intravaskuläre Antikörperfärbung als eine der am häufigsten verwendeten Techniken in TRM Laboren12etabliert. Kurz gesagt, 3-5 Minuten vor der Euthanasie, wird 3 g/Maus-Anti-CD8-Antikörper (zur Kennzeichnung von CD8+ T-Zellen) intravenös abgegeben. Intakte Blutgefäßwand verhindert eine schnelle Diffusion des Antikörpers innerhalb dieses kurzen Zeitraums (d. h. 3-5 Minuten) und nur intravaskuläre Zellen werden gekennzeichnet. Nach dem Standard-Lymphozyten-Isolationsprotokoll können intravaskuläre versus extravaskuläre Zellen leicht mit Derflusszytometrie unterschieden werden.
Hier beschreiben wir ein Standardprotokoll, das häufig in TRM-Labors verwendet wird, um intravaskuläre Etikettierung, Lymphozytenisolation und Durchflusszytometrieanalyse von Nieren-CD8+ T-Zellen mit einer C57BL/6-Maus durchzuführen, die CD45.1+ P14 T-Zellen und LCMV-Infektion 30 Tage vor13erhalten hat. Das gleiche Protokoll kann verwendet werden, um sowohl Effektor- als auch Memory-T-Zellen in der Niere zu untersuchen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37C incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>30-0081-U025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf Serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30073.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collegenase B</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11088807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS 5692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mojosort Mouse CD8 Na&#239;ve T Cells Isolation Kit</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>overhead heat lamp</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00333PZZG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17089101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rocker</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30096.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid Brass Mouse Restrainer</td>
			<td>Braintree Scientific, Inc</td>
			<td>SAI-MBR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing Bucket Centrifuge with refrigerator</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture 6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse kidney-resident cd8+ t cells for flow cytometry analysis

Gewebe-Resident Memory T-Zelle (TRM) ist ein schnell wachsendes Feld der immunologischen Forschung. Die Isolierung von T-Zellen aus verschiedenen nicht-lymphoiden Geweben ist einer der wichtigsten Schritte zur Untersuchung von TRMs. Es gibt leichte Unterschiede in den Lymphozyten-Isolationsprotokollen für verschiedene Organe. Die Niere ist ein essentielles nicht-lymphoides Organ mit zahlreichen Immunzellinfiltrationen, insbesondere nach Pathogen-Exposition oder Autoimmunaktivierung. In den letzten Jahren haben mehrere Labore, darunter unsere eigenen, begonnen, nierenansässige CD8+ T-Zellen in verschiedenen physiologischen und pathologischen Umgebungen sowohl in der Maus als auch im Menschen zu charakterisieren. Aufgrund der Fülle von T-Lymphozyten stellt die Niere ein attraktives Modellorgan dar, um TRMs in nicht-mukosen- oder nicht-barrierefreien Geweben zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das häufig in TRM-orientiertenLabors verwendet wird, um CD8+ T-Zellen von Mausnieren nach einer systemischen Virusinfektion zu isolieren. Kurz gesagt, mit einem akuten lymphatischen Choriomeningitis-Virus (LCMV) Infektionsmodell in C57BL/6 Mäusen, zeigen wir intravaskuläre CD8+ T-Zell-Etikettierung, enzymatische Verdauung, und Dichte Gradient Zentrifugation zu isolieren und anreichern Lymphozyten aus Mausnieren, um Proben bereit für die nachfolgende Durchflusszytometrie-Analyse zu machen.

Das hier beschriebene Protokoll ist in einem Flussdiagramm zusammengefasst (Abbildung 1A). An Tag 30 nach der LCMV-Infektion führten wir eine intravaskuläre Kennzeichnung von CD8+ T-Zellen durch. 5 Minuten später wurden beide Nieren des Tieres seziert, gehackt und der Kollagennaseverdauung unterzogen. Lymphozyten wurden durch Percoll-Zentrifugation aus den verdauten Proben weiter gereinigt und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Wie in Abbildung 1B</st...

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Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Nach einer Virusinfektion beherbergt die Niere eine relativ große Anzahl von CD8+ T-Zellen und bietet die Möglichkeit, nicht-mukosaleT-RM-Zellen zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung von Mausnierenlymphozyten für die Analyse der Durchflusszytometrie.

Isolierung von Maus-Kidney-Resident-CD8+ T-Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

CD8+T-Zellen tragen unterschiedliche Merkmale in verschiedenen Geweben, als kritisches Beispiel für nicht-mukoseses und nicht-lymphoides Gewebe. Es ist wichtig, nierenresidente Zellen direkt zu charakterisieren, um die T-Zellbiologie vollständig zu verstehen. Hier zeigen wir unsere praktische Methode, um nierenresidente CD8+T-Zellen zu isolieren, die eine nachfolgende Durchflusszytometrieanalyse aufnehmen.Diese Methode könnte Einblick in die Studien von Effektor und Speicher CD8 + T-Zellen nach Infektionen sowie Autoimmunreaktionen erzeugt geben. Das Verfahren wird von Dr.Chaoyu Ma, einem Forscher für mein Labor, durchgeführt. Beginnen Sie mit der Verdünnung von Biotin anti CD8 Alpha Antikörper auf 15 Mikrogramm pro Milliliter in PBS, stellen Sie sicher, dass es genug, um 200 Mikroliter zu jeder Maus zu verabreichen.Vor der Injektion die Schwanzvene der Maus mit einer Wärmelampe über Dementhon fünf bis zehn Minuten erhitzen, um sie zu verdünnen. Ziehen Sie 200 Mikroliter des vorverdünnten Antikörpers in eine 28-Spur-Insulinspritze und entfernen Sie Luftblasen, indem Sie den Kolben nach oben und unten bewegen. Biegen Sie die Nadel, um einen 150-Grad-Winkel zwischen der Nadel und der Spritze zu schaffen, abschrägen, so dass die Nadel parallel zur Schwanzvene ist.Halten Sie die Maus mit einem Nagetier-Restrainer zurück und sprühen Sie den Schwanz mit 70% Ethanol, um die Vene deutlich sichtbar zu machen. Halten Sie den Schwanz am distalen Ende mit dem Daumen und Mittelfinger der nicht-dominanten Hand, dann legen Sie den Zeigefinger unter die Injektionsstelle. Mit der dominanten Hand die Nadel parallel in die Herzrichtung einstecken und langsam 200 Mikroliter des Antikörpers injizieren.Entfernen Sie die Nadel und komprimieren Sie die Injektionsstelle, bis die Blutung aufhört. Nach der Einschläferung der Maus die Niere mit einer Schere sezieren und in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr übertragen. Lassen Sie die Proben bis zur weiteren Verarbeitung auf Eis.Bereiten Sie sechs-Well-Platten mit drei Milliliter Nat-Der-Faullösung in jedem Brunnen, mit einem Brunnen pro Maus, und lagern Sie sie auf Eis. Fügen Sie 300 Mikroliter Verdauungslösung in jedes Probenröhrchen und Hacken der Nierenproben mit einer geraden Federschere. Übertragen Sie die gehackten Nierenproben mit der Verdauungslösung auf die Sechs-Brunnen-Platten.Die Proben bei 37 Grad Celsius mit sanftem Schaukeln 45 Minuten lang inkubieren, dann mit dem Kolbenflansch einer Drei-Milliliter-Spritze homogenisieren und in 15-Milliliter-Konusröhren übertragen. Drehen Sie die Proben bei 500 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten nach unten. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in drei Milliliter n.R.O. mit 10%FCS wieder auf.Drehen Sie die Probe bei 500 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten, entfernen Sie dann den Überstand und setzen Sie das Zellpellet mit fünf Millilitern 44%Dichte Gradienten Medium und RPMI-Mix wieder auf. Legen Sie die Spitze einer Drei-Milliliter-Pipette mit drei Millilitern 67%Dichte Gradientenmedium und PBS direkt an den Boden jedes Rohres und lösen Sie die Lösung langsam los, so dass die schwere Lösung eine deutliche Schicht am Boden bildet. Drehen Sie die Proben mit 900 mal g für 20 Minuten mit reduzierten Gaspedal- und Bremseinstellungen, dann entfernen Sie vorsichtig die Rohre aus der Zentrifuge, ohne die Schichten zu stören.Entfernen Sie die obere Schicht mit einer Transferpipette, ohne die Lymphozytenschicht zu berühren, und übertragen Sie die Lymphozytenschicht in ein neues 15-Milliliter-Rohr. Füllen Sie das Rohr mit PBS und 5%FCS, dann mischen, indem Sie langsam invertieren das Rohr vier bis sechs Mal. Nach der Zentrifugierung der Proben bei 500 mal G und vier Grad Celsius für fünf Minuten, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet mit 500 Mikroliter nkomplettem RPMI-Medium wieder auf.Die Zellen sind nun bereit für die Durchflusszytometriefärbung. Selbst nach der Dichtezentrifugations-vermittelten Lymphozytenanreicherung war es sehr häufig, einen großen Teil der Nichtlymphozyten im Endprodukt zu sehen. Nach dem Gewinn an lebenden Lymphozyten waren CD8+T-Lymphozyten jedoch leicht zu identifizieren.Wie erwartet, nur extra-vaskuläre CD8 +T-Zellen effizient erfasst Gewebe Resident Memory T-Zell-Phänotypen, wie Upregulation von CD69 und Downregulation von Ly6C. Im Gegensatz zu den infizierten Mäusen wurden die überwiegende Mehrheit der CD8+T-Zellen, die von jungen naiven Mäusen isoliert wurden, die in der SPF-Anlage untergebracht waren, mit CD8-Alpha-Antikörpern gekennzeichnet und gehörten daher zum intravaskulären Fach. Diese Technik hat die Untersuchung von geweberesidenten Immunzellen in dicht vaskularisierten Organen stark beschleunigt.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Die Verwendung von Durchflusszytometrie, um den Zustand von Chromatin in T-Zellen bewerten

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolation und Analyse über Durchflusszytometrie von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn der Maus

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie der Menschen Endozervikale Gamma-Delta-T-Zellen

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Die Messung der T-Zell-Alloreaktivität Mit Imaging Durchflusszytometrie

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Multicolor Flow Cytometry-basierte Quantifizierung der Mitochondrien, Lysosomen in T-Zellen

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...