Name: isolation of mouse kidney-resident cd8+ t cells for flow cytometry analysis
Uploaded: 2020-06-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי NIH מעניק AI125701 ו AI139721, תוכנית CLIP המכון לחקר הסרטן האגודה האמריקנית לסרטן להעניק RSG-18-222-01-LIB כדי N.Z. אנו מודים לקרלה גורנה וסבסטיאן מונטנינו ממתקן Flow Cytometry. נתונים שנוצרו במתקן המשאבים המשותפים של Cytometry זרימה נתמכו על ידי המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו (UTHSCSA), NIH / NCI מענק P30 CA054174-20 (מרכז מחקר קליני ותרגום [CTRC] ב UTHSCSA), ו UL1 TR001120 (פרס מדע קליני ותרגום).

כל הניסויים בבעלי חיים המבוצעים על פי פרוטוקול זה חייבים להיות מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC). כל ההליכים המתוארים כאן אושרו על ידי IACUC UT בריאות סן אנטוניו.
1. העברה מאמצת של תאי P14 T לנמעני C57BL/6 וזיהום LCMV
<ol><li>השתמש בעכברים P14 בגיל 6-12 שבועות. ודא כי ?...

<ol>
	<li>Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+T+cell+subsets,+migration+patterns,+and+tissue+residence.">Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence.</a> Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).</li><li>Mueller, S. N., Mackay, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+memory+T+cells:+local+specialists+in+immune+defence.">Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence.</a> Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).</li><li>Park, C. O., Kupper, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+resident+memory+T+cells+in+protective+immunity+and+inflammatory+disease.">The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease.</a> Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).</li><li>Schenkel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+memory.+Resident+memory+CD8+T+cells+trigger+protective+innate+and+adaptive+immune+responses.">T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses.</a> Science. 346, 98-101 (2014).</li><li>Thome, J. J., Farber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+tissue-resident+T+cells:+lessons+from+humans.">Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans.</a> Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).</li><li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hobit+and+Blimp1+instruct+a+universal+transcriptional+program+of+tissue+residency+in+lymphocytes.">Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes.</a> Science. 352, 459-463 (2016).</li><li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-box+Transcription+Factors+Combine+with+the+Cytokines+TGF-beta+and+IL-15+to+Control+Tissue-Resident+Memory+T+Cell+Fate.">T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate.</a> Immunity. 43, 1101-1111 (2015).</li><li>Milner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Runx3+programs+CD8(+)+T+cell+residency+in+non-lymphoid+tissues+and+tumours.">Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours.</a> Nature. 552, 253-257 (2017).</li><li>Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Specific+Control+of+Tissue-Resident+Memory+T+Cells.">Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells.</a> Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).</li><li>Steinert, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Memory+CD8+T+Cells+Reveals+Regionalization+of+Immunosurveillance.">Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance.</a> Cell. 161, 737-749 (2015).</li><li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Lymphocytes+from+the+Mouse+Small+Intestinal+Immune+System.">Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).</li><li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes.">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).</li><li>Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+Controls+the+Formation+of+Kidney-Resident+T+Cells+via+Promoting+Effector+T+Cell+Extravasation.">TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation.</a> Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).</li><li>Gebhardt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+patterns+of+peripheral+migration+by+memory+CD4++and+CD8++T+cells.">Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells.</a> Nature. 477, 216-219 (2011).</li><li>Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARTC2.2/P2RX7+Signaling+during+Cell+Isolation+Distorts+Function+and+Quantification+of+Tissue-Resident+CD8(+)+T+Cell+and+Invariant+NKT+Subsets.">ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets.</a> Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).</li><li>Fernandez-Ruiz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-Resident+Memory+CD8(+)+T+Cells+Form+a+Front-Line+Defense+against+Malaria+Liver-Stage+Infection.">Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection.</a> Immunity. 45, 889-902 (2016).</li><li>Beura, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalizing+the+environment+recapitulates+adult+human+immune+traits+in+laboratory+mice.">Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice.</a> Nature. 532, 512-516 (2016).</li></ol>

כמו חסינות ספציפית לרקמות הוא אזור מתרחב במהירות של מחקר, הצטברות ראיות עולה כי תאים חיסוניים, במיוחד אוכלוסיית לימפוציטים ניתן לזהות כמעט בכל האיברים בעכברים אנושיים או נגועים או מחוסנים. מודל זיהום עכבר LCMV הוא מודל מבוסס היטב ללמוד תגובת תאי T ספציפיים אנטיגן, מחולל ובידול תאי T זיכרון כ?...

זיכרון תושב רקמות (TRM) תאי T מייצגים את אחת מאוכלוסיות תאי T הנפוצות ביותר בעכברים אנושיים ונדבקים בוגרים. תאיT RM מספקים את הקו הראשון של ההגנה החיסונית ומעורבים באופן קריטי בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגייםשונים 1,2,3,4,5. בהשוואה לתאי T במחזור, תאי T RM נושאיםסמני משטח ברורים עם תוכניות שעתוקייחודיות 6,7,8. הרחבת הידע שלנו בביולוגיה של TRM היא המפתח להבנת תגובות תאי T החיוניים לפיתוח עתידי של חיסונים ואימונותרפיות מבוססי תאי T.
בנוסף סמנים מולקולריים משותפים נפוצים של TRMs על פני כל הרקמות שאינן לימפואידיות, הצטברות ראיות עולה כי תכונות ספציפיותלרקמות הם מרכיב מרכזי של ביולוגיה T RM9. הכליות מחסה תאים חיסוניים רביםכולל תאי T RM לאחר ההדבקה ומציע הזדמנותמצוינת ללמוד ביולוגיה של תאי T RM ברקמה שאינה ריר. LCMV חריפה (וירוס choriomeningitis לימפוציטית) זיהום באמצעות מסלול תוך-פרטית הוא מודל זיהום מערכתי מבוסס היטב ללמוד תגובות תאי T ספציפיים אנטיגן בעכברים. הזיהום נפתר בדרך כלל ב 7-10 ימים בעכברים מסוג בר ולהשאיר מספר רב של תאי T זיכרון ספציפי LCMV במגוון של רקמות, כוללהכליה 10. P14 TCR (קולטן תא T) עכברים מהודקים לשאת CD8+ תאי T לזהות את אחד האפיטופים הדומיננטיים במערכת החיסון של LCMV שהוצגו על ידי MHC-I (סוג I מורכב היסטו-תאימות) מולקולה H2-Db בעכברים C57BL/6. שילוב של העברה מאמצת תא P14 T מסומן באופן מולד וזיהום LCMV בעכברים, CD8+ אפקט ותאי T זיכרון נמצאים במעקב, כוללהתביור T RM והומלוסטזיס.
ברקמות מחסום מסוימות, כגון תא לימפוציטים intraepithelial מעיים (IEL) ובלוטות הרוק, הליך בידוד לימפוציטים הוקמה מניב אחוז גבוה של תאי TRM עם זיהום תאי T נשא דם מינימלי בעכבר LCMVמודל 11. עם זאת, ברקמות שאינן מחסום, כגון הכליה, רשת כלי דם צפופה מכילה מספר רב של תאים CD8+ T במחזור. זה כבר מתועד היטב כי אפילו חיסון מוצלח לא יכול להסיר ביעילות את כל תאי CD8+ T במחזור. כדי להתגבר על משוכה טכנית זו, כתמי נוגדנים תוך וסקולריים הוקמה כ אחת הטכניקות הנפוצות ביותר במעבדות TRM 12. בקצרה, 3-5 דקות לפני המתת חסד, 3 מיקרוגרם / עכבר נוגדן נגד CD8 (כדי לסמן CD8+ תאי T) מועבר דרך הווריד. קיר כלי דם שלם מונע דיפוזיה מהירה של הנוגדן בתוך פרק זמן קצר זה (כלומר, 3-5 דקות) ורק תאים תוך-וסקולריים מסומנים. בעקבות פרוטוקול בידוד לימפוציטים סטנדרטי, תאים תוך וסקולריים לעומת חוץ וסקולריים ניתן להבדיל בקלות באמצעות ציטומטריית זרימה.
כאן, נתאר פרוטוקולסטנדרטי נפוץ במעבדות T RM לביצוע תיוג תוך וסקולרי, בידוד לימפוציטים וניתוח ציטומטריה זרימה של תאי CD8+ T בכליות באמצעות עכבר C57BL/6 שקיבל CD45.1+ תאי P14 T וזיהום LCMV 30 יוםלפני 13. ניתן להשתמש באותו פרוטוקול כדי ללמוד הן את תאי T משפיעים והן זיכרון T בכליה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37C incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>30-0081-U025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf Serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30073.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collegenase B</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11088807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS 5692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mojosort Mouse CD8 Na&#239;ve T Cells Isolation Kit</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>overhead heat lamp</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00333PZZG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17089101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rocker</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30096.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid Brass Mouse Restrainer</td>
			<td>Braintree Scientific, Inc</td>
			<td>SAI-MBR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing Bucket Centrifuge with refrigerator</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture 6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse kidney-resident cd8+ t cells for flow cytometry analysis

תא T זיכרון תושב רקמות (TRM)הוא תחום המתרחב במהירות של מחקר אימונולוגיה. בידוד תאי T מרקמות שונות שאינן לימפואידיות הוא אחד השלבים העיקריים לחקור TRMs. ישנן וריאציות קלות בפרוטוקולי בידוד לימפוציטים עבור איברים שונים. הכליה היא איבר חיוני שאינו לימפואידים עם חדירת תאים חיסוניים רבים במיוחד לאחר חשיפה לפתוגן או הפעלה אוטואימונית. בשנים האחרונות, מעבדות מרובות כולל שלנו החלו לאפיין תאי CD8+ T תושבי כליות במסגרות פיזיולוגיות ופתולוגיות שונות הן בעכבר והן בבני אדם. בשל שפע של לימפוציטים T, הכליה מייצגת איבר מודל אטרקטיבי ללמוד TRMs ברקמות שאינן ריר או לא מחסום. כאן, נתאר פרוטוקול נפוץ במעבדות ממוקדות TRMכדי לבודד תאי CD8+ T מכליות עכבר בעקבות זיהום ויראלי מערכתי. בקצרה, באמצעות מודל זיהום וירוס דלקת לימפוציטית חריפה (LCMV) בעכברים C57BL/6, אנו מדגימים CD8תוך וסקולרי + תיוג תא T, עיכול אנזימטי, צנטריפוגה שיפוע צפיפות לבודד ולהעשיר לימפוציטים מכליות העכבר כדי להפוך דגימות מוכנות לניתוח ציטומטריה זרימה הבאים.

הפרוטוקול המתואר כאן מסוכם בתרשים זרימה (איור 1A). ביום 30 לאחר זיהום LCMV, ביצענו תיוג תוך וסקולרי של תאי CD8+ T. 5 דקות לאחר מכן, שתי הכליות של החיה נותו, טחנו ונפלטו לעיכול קולגנס. לימפוציטים טוהרו עוד יותר מהדגימות המתעכלות באמצעות צנטריפוגה פרקול ונותחו על ידי ציטומטריית ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis at JoVE.com

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

בעקבות זיהום ויראלי, הכליות מטפחות מספר גדול יחסית של תאי CD8+ T ומציעות הזדמנות לחקור תאי TRM שאינם ריר. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבודד לימפוציטים כליות העכבר לניתוח ציטומטריה זרימה.

בידוד של עכבר כליות תושב CD8+ תאי T לניתוח ציטומטריה זרימה

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

תאי CD8+T נושאים תכונות שונות ברקמה שונה, כדוגמה קריטית לרקמות לא ריר ולא לימפה. זה חיוני כדי לאפיין ישירות תאים תושבי כליות כדי להבין באופן מלא ביולוגיה של תאי T. כאן נדגים את השיטה הנוחה שלנו לבודד תאי CD8+T תושבי הכליות המתאימים לניתוח ציטומטריית זרימה עוקבת.שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך המחקרים של תאים CD8 + T אפקטר וזיכרון שנוצר לאחר זיהומים, כמו גם תגובות אוטואימוניות. ההליך יתבצע על ידי ד"ר צ'אויו מא, מדען מחקר במעבדה שלי. התחל בדילול נוגדן אלפא נגד CD8 ביוטין ל-15 מיקרוגרם למיליליטר ב-PBS, וודא שיש מספיק כדי לנהל 200 מיקרוליטר לכל עכבר.לפני ההזרקה, מחממים את וריד הזנב של העכבר עם מנורת חום תקורה במשך חמש עד 10 דקות כדי להפוך אותו. ציירו 200 מיקרוליטרים של תערובת הנוגדנים המדוללים מראש למזרק אינסולין של 28 מדים והסירו את כל בועות האוויר על ידי הזזת הבוכנה מעלה ומטה. לכופף את המחט כדי ליצור זווית של 150 מעלות בין המחט לבין המזרק, משופע, כך המחט מקבילה לווריד הזנב.לרסן את העכבר עם מרסן מכרסמים לרסס את הזנב עם 70% אתנול כדי להפוך את הווריד גלוי בבירור. החזק את הזנב בקצה הדיסטלי עם האגודל והאצבעות האמצעיות של היד הלא דומיננטית, ולאחר מכן מקם את האצבע המורה מתחת לאתר ההזרקה. עם היד הדומיננטית להכניס את המחט לתוך וריד במקביל לכיוון הלב לאט להזריק 200 microliters של הנוגדן.הסר את המחט בעדינות לדחוס את אתר ההזרקה עד הדימום מפסיק. לאחר המתת חום העכבר, לנתח את הכליה עם מספריים ולהעביר אותו צינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. השאירו את הדגימות על הקרח עד לעיבוד נוסף.הכינו צלחות שש בארות עם שלושה מיליליטר של פתרון עיכול בכל באר, באמצעות באר אחת לכל עכבר, ולאחסן אותם על קרח. הוסף 300 microliters של פתרון העיכול לתוך כל צינור מדגם טחון דגימות הכליה עם מספריים האביב ישר. מעבירים את דגימות הכליות הטחון לצלחות שש בארות עם פתרון העיכול.הדגירה את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה במשך 45 דקות, ואז הומוגניזציה של הרקמה עם אוגן הבוכנה של מזרק שלושה מיליליטר ולהעביר אותו צינורות חרוט 15 מיליליטר. לסובב את הדגימות למטה ב 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. הסר את supernatant ו resuspend גלולה בשלושה מיליליטר של RPMI עם 10%FCS.לסובב את המדגם ב 500 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant ולתלות מחדש את גלולת התא עם חמישה מיליליטר של 44% צפיפות הדרגתית בינונית תערובת RPMI. שים את הקצה של פיפטה שלושה מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של 67% שיפוע בינוני PBS ישירות לתחתית של כל צינור לאט לשחרר את הפתרון, כך הפתרון הכבד יוצר שכבה ברורה בתחתית. לסובב את הדגימות ב 900 פעמים g במשך 20 דקות עם הגדרות האצה ובלמים מופחתת, ולאחר מכן להסיר בזהירות את הצינורות מן הצנטריפוגה מבלי להפריע את השכבות.הסר את השכבה העליונה עם פיפטה העברה מבלי לגעת בשכבת הלימפוציטים ולהעביר את שכבת הלימפוציטים לצינור חדש של 15 מיליליטר. מלאו את הצינור ב-PBS וב-5%FCS, ואז ערבבו על ידי היפוך איטי של הצינור ארבע עד שש פעמים. לאחר צנטריפוגה הדגימות ב 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, להסיר את supernatant ולתלות מחדש את גלולת התא עם 500 microliters של מדיום RPMI מלא.התאים מוכנים כעת להכתמת ציטומטריית זרימה. גם לאחר העשרת לימפוציטים בתתיווך צנטריפוגה בצפיפות, זה היה נפוץ מאוד לראות חלק גדול של לימפוציטים שאינם במוצר הסופי. עם זאת, לאחר צובר על לימפוציטים חיים, לימפוציטים CD8 +T היו קל לזהות.כצפוי, רק תאי CD8+T חוץ-וסקולריים רכשו ביעילות זיכרון תושב רקמות T-cell phenotypes, כגון רגולציה של CD69 ורגולציה של Ly6C. בניגוד לעכברים הנגועים, הרוב המכריע של תאי CD8+T המבודדים מעכברים נאיביים צעירים שוכנו במתקן SPF תויגו בנוגדן CD8 אלפא ולכן היו שייכים לתא האינטרווסקולרי. טכניקה זו האיצה מאוד את חקירת תאי החיסון תושבי הרקמות באיברים צפופי כלי דם.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך Aortas Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

טכניקות הדמיה כל-החיה והזרימה Cytometric לתגובות ניתוח של אנטיגן ספציפי CD8 + T תא לאחר Nanoparticle חיסון

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

השימוש בcytometry הזרימה מנת להעריך את המצב של הכרומטין בתאי T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

ניתוח בידוד תזרים Cytometric של האדם תאים האנדוצרוויקאלית גמא דלתא T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

מדידת T Cell Alloreactivity שימוש cytometry זרימה הדמיה

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...