Name: isolation of mouse kidney-resident cd8+ t cells for flow cytometry analysis
Uploaded: 2020-06-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis at JoVE.com

Bu çalışma NIH hibe AI125701 ve AI139721, Kanser Araştırma Enstitüsü CLIP programı ve Amerikan Kanser Derneği hibe RSG-18-222-01-LIB n.z tarafından desteklenir. Flow Sitometri Tesisi'nden Karla Gorena ve Sebastian Montagnino'ya teşekkür ederiz. Flow Cytometry Paylaşılan Kaynak Tesisi'nde oluşturulan veriler San Antonio'daki Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi (UTHSCSA), NIH/NCI hibe P30 CA054174-20 (UTHSCSA'daki Klinik ve Çeviriaraştırma Merkezi [CTRC] ve UL1 TR001120 (Klinik ve ÇeviriBilim Ödülü) tarafından desteklenmiştir.

Bu protokole göre yapılan tüm hayvan deneyleri ilgili kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmalıdır. Burada açıklanan tüm prosedürler IACUC UT Health San Antonio tarafından onaylanmıştır.
1. P14 T hücrelerinin C57BL/6 alıcılarına ve LCMV enfeksiyonuna benimsendirici transferi
<ol><li>6-12 haftalık kenP14 farelerini kullanın. Donör P14 TCR transgenik farenin cinsiyetinin C57BL/6 alıcı farelerinin cinsiyetine uygun olduğundan emin olun. ...

<ol>
	<li>Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+T+cell+subsets,+migration+patterns,+and+tissue+residence.">Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence.</a> Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).</li><li>Mueller, S. N., Mackay, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+memory+T+cells:+local+specialists+in+immune+defence.">Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence.</a> Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).</li><li>Park, C. O., Kupper, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+resident+memory+T+cells+in+protective+immunity+and+inflammatory+disease.">The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease.</a> Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).</li><li>Schenkel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+memory.+Resident+memory+CD8+T+cells+trigger+protective+innate+and+adaptive+immune+responses.">T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses.</a> Science. 346, 98-101 (2014).</li><li>Thome, J. J., Farber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+tissue-resident+T+cells:+lessons+from+humans.">Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans.</a> Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).</li><li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hobit+and+Blimp1+instruct+a+universal+transcriptional+program+of+tissue+residency+in+lymphocytes.">Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes.</a> Science. 352, 459-463 (2016).</li><li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-box+Transcription+Factors+Combine+with+the+Cytokines+TGF-beta+and+IL-15+to+Control+Tissue-Resident+Memory+T+Cell+Fate.">T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate.</a> Immunity. 43, 1101-1111 (2015).</li><li>Milner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Runx3+programs+CD8(+)+T+cell+residency+in+non-lymphoid+tissues+and+tumours.">Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours.</a> Nature. 552, 253-257 (2017).</li><li>Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Specific+Control+of+Tissue-Resident+Memory+T+Cells.">Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells.</a> Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).</li><li>Steinert, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Memory+CD8+T+Cells+Reveals+Regionalization+of+Immunosurveillance.">Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance.</a> Cell. 161, 737-749 (2015).</li><li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Lymphocytes+from+the+Mouse+Small+Intestinal+Immune+System.">Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).</li><li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes.">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).</li><li>Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+Controls+the+Formation+of+Kidney-Resident+T+Cells+via+Promoting+Effector+T+Cell+Extravasation.">TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation.</a> Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).</li><li>Gebhardt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+patterns+of+peripheral+migration+by+memory+CD4++and+CD8++T+cells.">Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells.</a> Nature. 477, 216-219 (2011).</li><li>Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARTC2.2/P2RX7+Signaling+during+Cell+Isolation+Distorts+Function+and+Quantification+of+Tissue-Resident+CD8(+)+T+Cell+and+Invariant+NKT+Subsets.">ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets.</a> Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).</li><li>Fernandez-Ruiz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-Resident+Memory+CD8(+)+T+Cells+Form+a+Front-Line+Defense+against+Malaria+Liver-Stage+Infection.">Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection.</a> Immunity. 45, 889-902 (2016).</li><li>Beura, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalizing+the+environment+recapitulates+adult+human+immune+traits+in+laboratory+mice.">Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice.</a> Nature. 532, 512-516 (2016).</li></ol>

Dokuya özgü bağışıklık araştırma hızlı genişleyen bir alan olduğu gibi, kanıt birikmesi bağışıklık hücreleri, özellikle lenfositler nüfus yetişkin insan veya enfekte veya aşılanmış farelerde hemen hemen tüm organlarda tespit edilebilir öneririz. LCMV fare enfeksiyonu modeli, antijene özgü T hücre yanıtı, efektör ve bellek T hücre farklılaşmasını incelemek için kurulmuş bir modeldir. Burada böbrekteki CD8+ T hücrelerini analiz etmek için bir protokol tanı...

Doku da yerleşik bellek (TRM)T hücreleri yetişkin insan ve enfekte farelerde en bol T hücre popülasyonlarından birini temsil eder. TRM hücreleri bağışıklık savunmasının ilk hattını sağlar ve çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde kritik olarak yer alır1,2,3,4,5. Dolaşımdaki T hücreleri ile karşılaştırıldığında, TRM hücreleri benzersiz transkripsiyon programları6,7,8ile farklı yüzey belirteçleri taşır. TRM biyolojisi hakkındaki bilgimizi genişletmek, T hücre bazlı aşıların ve immünoterapilerin gelecekteki gelişimi için gerekli olan T hücre yanıtlarını anlamanın anahtarıdır.
Tüm lenfoid olmayan dokularda TRM'ninyaygın olarak paylaşılan moleküler belirteçlerine ek olarak, biriken kanıtlar dokuya özgü özelliklerin TRM biyolojisi 9'unmerkezi bir bileşeni olduğunu göstermektedir. Böbrek enfeksiyon sonrası TRM hücreleri de dahil olmak üzere birçok bağışıklık hücreleri barındırır ve olmayan bir mukozal dokuda TRM hücre biyolojisi çalışma için büyük bir fırsat sunuyor. İntraperitoneal yol ile akut LCMV (lenfositik koryomeningit virüsü) enfeksiyonu farelerde antijene özgü T hücre yanıtlarını incelemek için kurulmuş bir sistemik enfeksiyon modelidir. Enfeksiyon genellikle yabani tip farelerde 7-10 gün içinde çözülür ve böbrek10dahil olmak üzere çeşitli dokularda LCMV özgü bellek T hücrelerinin çok sayıda bırakın. P14 TCR (T hücre reseptörü) transgenik fareler CD8+ T hücreleri taşır, C57BL/6 farelerde MHC-I (sınıf I majör histokompatibilite kompleksi) molekülü H2-Db tarafından sunulan LCMV'nin immün dominant epitoplarından birini tanır. Farelerde konjenik olarak işaretlenmiş P14 T hücre evlat edinen transferi ve LCMV enfeksiyonu ile tom8+ efektör ve bellek T hücreleri, TRM farklılaşması ve homeostaz dahil olmak üzere izlenir.
Bağırsak intraepitelyal lenfositler (IEL) bölmesi ve tükürük bezleri gibi bazı bariyer dokularında, kurulan lenfosit izolasyon prosedürü fare LCMV modelinde en az kan kaynaklı T hücre kontaminasyonu ile TRM hücrelerinin yüksek yüzdesini verir11. Ancak, böbrek gibi bariyer olmayan dokularda, yoğun vasküler ağ dolaşımdaki CD8+ T hücrelerinin çok sayıda içerir. Başarılı perfüzyonun bile dolaşımdaki tüm CD8+ T hücrelerini verimli bir şekilde çıkaramadığı iyi belgelenmiştir. Bu teknik engeli aşmak için, intravasküler antikor boyama TRM laboratuvarlarında en sık kullanılan tekniklerden biri olarak kurulmuştur12. Kısaca, ötanaziden 3-5 dakika önce, 3 μg/mouse anti-CD8 antikor (CD8+ T hücrelerini etiketlemek için) intravenöz olarak teslim edilir. Sağlam kan damarı duvarı bu kısa sürede antikorların hızlı difüzyonunu önler (yani 3-5 dakika) ve sadece intravasküler hücreler etiketlenir. Standart lenfosit izolasyon protokolü takip, intravasküler karşı ekstravasküler hücreler kolayca akış sitometri kullanılarak ayırt edilebilir.
Burada, trm laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılan standart bir protokolü,13gün önce 30 gün önce CD45.1+ P14 T hücreleri ve LCMV enfeksiyonu aldı C57BL/6 fare kullanarak böbrek CD8+ T hücrelerinin lenfosit izolasyonve akış sitometri analizi gerçekleştirmek için açıklayacağız. Aynı protokol böbrekte hem efektör hem de bellek T hücrelerini incelemek için kullanılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37C incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>30-0081-U025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf Serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30073.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collegenase B</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11088807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS 5692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mojosort Mouse CD8 Na&#239;ve T Cells Isolation Kit</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>overhead heat lamp</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00333PZZG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17089101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rocker</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30096.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid Brass Mouse Restrainer</td>
			<td>Braintree Scientific, Inc</td>
			<td>SAI-MBR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing Bucket Centrifuge with refrigerator</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture 6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse kidney-resident cd8+ t cells for flow cytometry analysis

Doku da yerleşik bellek T hücresi (TRM)immünoloji araştırmalarının hızla genişleyen bir alanıdır. Çeşitli lenfoid olmayan dokulardan T hücrelerinin izole TRMaraştırmak için önemli adımlardan biridir. Farklı organlar için lenfosit izolasyon protokollerinde hafif farklılıklar vardır. Böbrek patojen maruziyet veya otoimmün aktivasyon özellikle sonra çok sayıda bağışıklık hücresi infiltrasyonu ile önemli bir non-lenfoid organdır. Son yıllarda, bizim de dahil olmak üzere birden fazla laboratuvar fare ve insan çeşitli fizyolojik ve patolojik ortamlarda böbrek yerleşik CD8+ T hücreleri karakterize başlamıştır. T lenfositlerin bolluğu nedeniyle, böbrek non-mukozal veya non-bariyer dokularda TRMçalışmak için cazip bir model organ temsil eder. Burada, sistemik viral enfeksiyon sonrasında fare böbreklerinden CD8+ T hücrelerini izole etmek için TRModaklı laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılan bir protokolü açıklayacağız. Kısaca, C57BL/6 farelerinde akut lenfositik koryomeningit (LCMV) enfeksiyon modeli kullanarak, örnekleri sonraki akış sitometri analizine hazır hale getirmek için fare böbreklerinden lenfositleri izole etmek ve zenginleştirmek için intravasküler CD8+ T hücre etiketleme, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyan santrifüjünü gösteriyoruz.

Burada açıklanan protokol bir akış grafiğinde özetlenmiştir (Şekil 1A). 30. gün sonrası LCMV enfeksiyonunda CD8+ T hücrelerinin intravasküler etiketlemesini yaptık. 5 dakika sonra, hayvanın her iki böbrek leri kesildi, kıyıldı ve kollajenaz sindirime tabi tutuldu. Lenfositler Percoll santrifüj yoluyla sindirilmiş örneklerden daha fazla saflaştırılmış ve akış sitometri sitometrisi ile analiz edilmiştir. Şekil 1B'degösteri...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis at JoVE.com

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Viral enfeksiyonutaki böbrek, nispeten çok sayıda CD8+ T hücrebarındırır ve mukozal olmayan TRM hücrelerini inceleme fırsatı sunar. Burada, akış sitometri analizi için fare böbrek lenfositleri izole etmek için bir protokol açıklar.

Akış Sitometri Analizi için Fare Böbrek-Resident CD8+ T hücrelerinin izolasyonu

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

CD8+T hücreleri farklı dokularda farklı özellikler taşırlar, mukozal olmayan ve lenfoid olmayan dokunun kritik bir örneğidir. Doğrudan tam T-hücre biyolojisi anlamak için böbrek yerleşik hücreleri karakterize etmek esastır. Burada böbrek yerleşik CD8 + T hücreleri sonraki akış sitometri analizi barındıran izole etmek için uygun yöntemimizi gösterecektir.Bu yöntem, enfeksiyonlar dan sonra oluşturulan efektör ve bellek CD8+T hücrelerinin çalışmaları ve otoimmün yanıtlar hakkında bilgi sağlayabilir. İşlem, laboratuvarımiçin araştırma görevlisi olan Dr. Chaoyu Ma tarafından yapılacak. Biotin anti CD8 alfa antikorseyreltme ile başlayın 15 PBS başına mikrogram, her fare için 200 mikrolitre yönetmek için yeterli olduğundan emin olun.Enjeksiyondan önce, farenin kuyruk damarını bir havai ısı lambası ile 5 ila 10 dakika boyunca ısıtın. Önceden seyreltilmiş antikor karışımından 200 mikrolitreyi 28 kalibrelik bir insülin şırıngasına çekin ve pistonu yukarı aşağı hareket ettirerek hava kabarcıklarını çıkarın. İğne ve şırınga arasında 150 derecelik bir açı oluşturmak için iğneyi bükün, böylece iğne kuyruk damarına paralel olacak şekilde yukarı doğru eğilin.Bir kemirgen dizginleyici ile fareyi dizginlemek ve damar açıkça görünür hale getirmek için% 70 etanol ile kuyruk sprey. Baskın olmayan elin başparmak ve orta parmakları ile distal ucunda kuyruk tutun, sonra enjeksiyon sitesi altına işaret parmağı yerleştirin. Baskın el ile kalp yönüne paralel olarak damar içine iğne takın ve yavaş yavaş antikor 200 mikrolitre enjekte.İğneyi çıkarın ve kanama durana kadar enjeksiyon bölgesini hafifçe sıkıştırın. Fareyi ötenazi yaptıktan sonra böbreği makasla inceleyin ve 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Daha fazla işleme kadar buz üzerinde örnekleri bırakın.Fare başına bir kuyu kullanarak, her kuyuda üç mililitre sindirim çözeltisi içeren altı kuyulu tabaklar hazırlayın ve bunları buzüzerinde saklayın. Her numune tüpüne 300 mikrolitre sindirim çözeltisi ekleyin ve böbrek örneklerini düz bir yay makasla dolayın. Kıymalı böbrek örneklerini sindirim solüsyonu ile altı kuyulu tabaklara aktarın.Örnekleri 37 derecede, yumuşak bir şekilde 45 dakika sallayarak kuluçkaya yatırın, sonra üç mililitrelik şırınganın dalgıç flanşıyla dokuyu homojenize edin ve 15 mililitrelik konik tüplere aktarın. Örnekleri 500 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca aşağı çevirin. Supernatant çıkarın ve% 10 FCS rpmi üç mililitre pelet resuspend.Beş dakika boyunca 500 kez g ve dört santigrat derece örnek aşağı spin, sonra supernatant kaldırmak ve% 44 yoğunlukgradient orta ve RPMI karışımı beş mililitre ile hücre pelet yeniden askıya. %67 yoğunlukgrad orta ve PBS üç mililitre içeren üç mililitrelik pipet ucu doğrudan her tüpün altına koyun ve ağır çözelti alt kısmında ayrı bir tabaka oluşturur, böylece yavaş yavaş solüsyon bırakın. Azaltılmış gaz ve fren ayarlarıyla numuneleri 20 dakika boyunca 900 kez g'de döndürün ve katmanları bozmadan tüpleri santrifüjden dikkatlice çıkarın.Lenfosit tabakasıdokunmadan bir transfer pipet ile üst tabaka çıkarın ve yeni bir 15 mililitrelik tüp lenfosit tabakası transfer. Tüpü PBS ve %5 FCS ile doldurun, sonra tüpü yavaşça 4-6 kez ters çevirerek karıştırın. Örnekleri 500 kez G ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj ettikten sonra, süpernatantı çıkarın ve 500 mikrolitre tam RPMI ortamıile hücre peletini yeniden askıya alın.Hücreler şimdi akış sitometri boyama için hazırdır. Yoğunluk santrifüj aracılı lenfosit zenginleştirme sonra bile, son ürün olmayan lenfositlerin büyük bir kısmını görmek çok yaygındı. Ancak canlı lenfositler kazandıktan sonra CD8+T lenfositlerinin tanımlanması kolaydı.Beklendiği gibi, sadece ekstra vasküler CD8+T hücreleri verimli doku yerleşik bellek T-hücre fenotipler, CD69 upregülasyonu ve Ly6C downregulation gibi elde. Enfekte farelerin aksine, SPF tesisinde bulunan genç naif farelerden izole edilen CD8+T hücrelerinin büyük çoğunluğu CD8 alfa antikoru ile etiketlendi ve bu nedenle intravasküler bölmeye aitti. Bu teknik, yoğun vaskülarize organlarda doku yerleşik bağışıklık hücrelerinin araştırılması büyük ölçüde hızlandırmıştır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Akış Sitometrinin Kullanımı T Hücrelerinde Kromatin Devleti değerlendirmek için

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

İnsan Endoservikal Gamma Delta T Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Görüntüleme Akım Sitometri Kullanımı T Hücresi alloreaktivitesini Ölçümü

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...