Name: differentiation of monocytes into phenotypically distinct macrophages after treatment with human cord blood stem cell (cb-sc)-derived exosomes
Uploaded: 2020-11-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell CB-SC-Derived Exosomes at JoVE.com

Vi er taknemmelige for Mr. Poddar og Mr. Ludwig for generøs finansiering støtte via Hackensack UMC Foundation. Vi sætter pris på Laura Zhao for engelsk redigering.

Protokollen følger retningslinjerne for institutionelle menneskelige forskning etiske udvalg på Center for Discovery og Innovation, Hackensack Meridian Health. Human buffy pels blod enheder blev købt fra New York Blood Center (New York, NY). Human navlestrengsblod enheder blev indsamlet fra raske donorer og købt fra Cryo-Cell International blodbank (Oldsmar, FL). Både New York Blood Center og Cryo-Cell har modtaget alle akkrediteringer for blodtapninger og distributioner, med IRB godkendelse og underskrevet Samtykke...

<ol>
	<li>Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+educator+therapy+and+induction+of+immune+balance.">Stem cell educator therapy and induction of immune balance.</a> Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+type+1+diabetes+via+islet+beta+cell+regeneration+following+immune+modulation+by+cord+blood-derived+multipotent+stem+cells.">Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells.</a> BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+insulin+resistance+in+type+2+diabetes+via+immune+modulation+of+cord+blood-derived+multipotent+stem+cells+(CB-SCs)+in+stem+cell+educator+therapy:+phase+I/II+clinical+trial.">Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial.</a> BMC Medicine. 11, 160 (2013).</li><li>Delgado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+autoimmune+T-cell+memory+by+stem+cell+educator+therapy:+phase+1/2+clinical+trial.">Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial.</a> EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+regrowth+in+alopecia+areata+patients+following+Stem+Cell+Educator+therapy+BMC.">Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC.</a> Medicine. 13 (1), 87 (2015).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer:+small+vesicular+transporters+for+cancer+progression+and+metastasis,+biomarkers+in+cancer+therapeutics.">Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics.</a> PeerJ. 6, 4763 (2018).</li><li>Adamiak, M., Sahoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+myocardial+repair:+advances+and+challenges+in+the+development+of+next-generation+therapeutics.">Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics.</a> Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).</li><li>Akyurekli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+preclinical+studies+on+the+therapeutic+potential+of+mesenchymal+stromal+cell-derived+microvesicles.">A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles.</a> Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).</li><li>Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Released+exosomes+contribute+to+the+immune+modulation+of+cord+blood-derived+stem+cells+(CB-SC).">Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC).</a> Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).</li><li>Jacobson, G., K&#229;rsn&#228;s, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+parameters+in+semi-dry+electrophoretic+transfer.">Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer.</a> Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).</li><li>Dykstra, M. J., Reuss, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , (2011).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+vesicles:+general+methodologies+and+latest+trends.">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization:+different+gene+signatures+in+M1(LPS+)+vs.+classically+and+M2(LPS-)+vs.+alternatively+activated+macrophages.">Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).</li></ol>

Anvendelse af exosomer er et nyt område for klinisk diagnose, lægemiddeludvikling og regenerativ medicin. Her præsenterer vi en detaljeret protokol om fremstilling af CB-SC-afledte eksosomer og den funktionelle undersøgelse af exosomer om differentiering af menneskelige monocytter. Den nuværende protokol viste, at funktionelle CB-SC-afledte eksosomer er isoleret ved sekventiel centrifugering og ultracentrifugering med høj renhed og udviser immunmodulering på monocytter.
Sammenlignet med...

Navlestrengsblod stamceller (CB-SC) er unikke type stamceller identificeret fra humant navlestrengsblod og adskiller sig fra andre kendte typer stamceller såsom mesenkymale stamceller (MSC) og hæmatopoietiske stamceller (HSC)1. Baseret på deres unikke egenskaber af immun modulering og deres evne til stramt at holde sig til overfladen af petriskåle, vi udviklet en ny teknologi udpeget som Stem Cell Educator (SCE) terapi ikliniske forsøg 2,3. Under SCE terapi, en patients perifere blod mononukleare celler (PBMC) indsamles og cirkuleres gennem en celle separator og co-kulturperler med klæbende CB-SC in vitro. Disse "uddannede" celler (CB-SC-behandlet PBMC) returneres derefter til patientens cirkulation i et lukket kredsløb. Kliniske forsøg har allerede vist den kliniske sikkerhed og virkning af SCE-behandling til behandling af autoimmune sygdomme, herunder type 1-diabetes (T1D)2,4 ogalopeci areata (AA)5.
Exosomer er en familie af nanopartikler med diametre på 30\u2012150 nm og findes i alle biofluid og cellekultur medier6. Exosomer er beriget med mange bioaktive molekyler, herunder lipider, mRNAs, proteiner og microRNA 'er (miRNA), og spiller en vigtig rolle i celle-til-celle kommunikation. For sent, exosomer er blevet mere attraktivt for forskere og farmaceutiske virksomheder på grund af deres terapeutiske potentialer i klinikker7,8,9. For nylig, vores mekanistiske undersøgelser viste, at CB-SC-frigivet exosomer bidrage til immunmodulering af SCE terapi10.
Her beskriver vi protokollen for at udforske mekanismen i SCE terapi rettet mod monocytter af CB-SC-frigivet exosomer. For det første blev EXosomer, der blev frigivet af CB-SC, isoleret fra CB-SC-afledte betingede medier ved hjælp af ultracentrifugeringsmetoder og valideret ved flowcytometri, western blot (WB) og dynamisk lyssprændering (DLS). For det andet, CB-SC-afledte exosomer blev mærket med en grøn fluorescerende lipofile farvestof: Dio. For det tredje var de co-kulturperler med PBMC at undersøge de positive procenter af Dio-mærket CB-SC-afledte exosomer på de forskellige delpopulationer af PBMC ved flow cytometri. Denne protokol giver vejledning til at undersøge handlingen af exosomer underliggende immunmodulering af stamceller.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>Non-tissue culture 
			plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio)</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>D4292-20MG</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 Mesh Grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td>Tissue culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td>Tissue culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Alix</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>634501</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2268110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Calnexin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>699401</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2728519</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561356</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_10611859</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B36294</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2728099</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD163 antibody, PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>556018</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_396296</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD19 antibody, PC5</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2643U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_131160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD206 antibody, FITC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>551135</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_394065</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>564127</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2738610</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD270 antibody, PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>318806</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2203703</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300431</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_1595437</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD34 antibody, APC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2427U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD4 antibody, APC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555349</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_398593</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM3548U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_1575969</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD56 antibody, PE</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2073U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_131195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD63 antibody,PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561925</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_10896821</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94686</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD80 antibody, APC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30642</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD81 antibody, FITC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561956</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_394049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30646</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD9 antibody, FITC</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>MA5-16860</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2538339</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>348919</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2716134</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>50-5841-82</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_11218882</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>53-9811-82</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2574479</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A1933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffy coat</td>
			<td>New York Blood Center</td>
			<td></td>
			<td>40-60 ml/unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable semi-micro cuvette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97000590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>131510014</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Chanber cell counting slides</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Human CD63 Detection reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10606D</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS density grandient media</td>
			<td>GE Health</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor(25&#176;)</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75003698</td>
			<td>Maxium 24,700 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>3 lasers 
			10 Color Max</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cord blood</td>
			<td>Cryo-Cell International</td>
			<td></td>
			<td>40-100 ml/unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fc Block</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>564220</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentriguge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker MP4</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>S-3500-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>56-66211E</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti2 microscope</td>
			<td>Nikon instruments Inc</td>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>NIS-Elements software version 5.11.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hochest 33342</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>62249</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revert microsopy</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12563518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor 41 Ti</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td>Maxium 41,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75003655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-20 cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-2100 PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X&#39;VIVO 15 Serum-free medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BEBP04-744Q</td>
			<td>1000 ml Culture medium, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of monocytes into phenotypically distinct macrophages after treatment with human cord blood stem cell (cb-sc)-derived exosomes

Stamcellepædagog (SCE) terapi er en ny klinisk tilgang til behandling af type 1 diabetes og andre autoimmune sygdomme. SCE terapi cirkulerer den isolerede patientens blod mononuclear celler (f.eks lymfocytter og monocytter) gennem en aferese maskine, co-kulturer patientens blod mononukleare celler med klæbende navlestrengsblod-afledte stamceller (CB-SC) i SCE-enheden, og derefter returnerer disse "uddannede" immunceller til patientens blod. Exosomer er nano-størrelse ekstracellulære vesikler mellem 30 \u2012150 nm eksisterende i alle biofluid og cellekultur medier. For yderligere at udforske molekylære mekanismer, der ligger til grund for SCE-behandling og bestemme handlinger exosomer frigivet fra CB-SC, undersøger vi, hvilke celler der er omfattende disse exosomer under behandlingen med CB-SC. Ved at co-culturing Dio-mærket CB-SC-afledte exosomer med menneskelige perifere blod mononukleare celler (PBMC), fandt vi, at CB-SC-afledte exosomer overvejende blev taget op af menneskelige CD14-positive monocytter, hvilket fører til differentiering af monocytter i type 2 makrofager (M2), med spindel-lignende morfologi og udtryk for M2-associerede overflademolekyliske markører. Her præsenterer vi en protokol for isolering og karakterisering af CB-SC-afledte eksosomer og protokollen for co-kultur CB-SC-afledte exosomer med menneskelige monocytter og overvågning af M2 differentiering.

I første omgang blev CB-SC's fænotype og renhed undersøgt ved flowcytometri med CB-SC-tilknyttede markører såsom leukocytgenereret antigen CD45, ES-cellespecifikke transskriptionsfaktorer OCT3/4 og SOX2. CB-SC viser høje niveauer af CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 og galectin 9-udtryk, men intet udtryk for CD34 (Figur 1A). Flowcytometrianalyse bekræftede eksosomspecifikke markører, herunder CD9, CD81 og CD63, var på CB-SC-afledte eksosomer (Figur 1B). Morfolo...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell CB-SC-Derived Exosomes at JoVE.com

Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell CB-SC-Derived Exosomes

Exosome ansøgning er et nyt værktøj til udvikling af lægemidler og regenerativ medicin. Vi etablerer en exosome isolation protokol med høj renhed til at isolere exosomer fra nye identificerede stamceller kaldet CB-SC for mekanistiske undersøgelser. Vi har også coculture CB-SC-afledte exosomer med menneskelige monocytter, hvilket fører til deres differentiering i fænocypisk forskellige makrofager.

Differentiering af monocytter til fænocypisk forskellige makrofager efter behandling med human navlestrengsblod stamceller (CB-SC)-Afledte Exosomer

Stem Cell Educator (SCE) therapy is a novel clinical approach for the treatment of type 1 diabetes and other autoimmune diseases. SCE therapy circulates ...

Stem Cell Educator terapi blev udviklet til behandling af type I diabetes og den anden autoimmune sygdom. Denne metode blev udviklet til at udforske molekyle mekanisme underliggende immun moderation af Stamcellepædagog terapi gennem CB-SC frigivet exosomer. Denne protokol giver vejledning om, hvordan man renser exosomer fra en menneskelig navlestrengsblod stamceller kulturer og bestemme deres immun modulering af monocytter.Demonstration af proceduren vil være Wei Hu, en ph.d.-studerende, fra mit laboratorium. Til at begynde med centrifugeres cb-SC-det afledte konditionerede medium tre gange som beskrevet i tekstmanuskriptet og samler supernatanten i et nyt konisk rør på 50 milliliter efter hver centrifugering. Efter den tredje centrifugering filtreres den opnåede supernatant med et 0,22 mikroliterfilter, og der overføres 15 ml medie til hver 10 kilodaltoncentrifugalfilterenhed.Centrifuger ved 4, 000 x g i 30 minutter for at isolere de koncentrerede exosome medier. Overfør de koncentrerede exosomer til et ultracentrifugerør. Derefter pellet exosomer på 100, 000 x g i 80 minutter ved fire grader Celsius.Derefter kasseres supernatant og resuspend de pelleterede exosomer i 10 milliliter PBS. Udfør en endelig ultracentrifugering for at indsamle exome pellet og resuspend det i 200 mikroliter af PBS. Tilsæt 30 millioner menneskelige PBM'er til et 15 milliliterrør og centrifuge ved 300 x g i 10 minutter ved fire grader Celsius.Opslænt cellerne i 300 mikroliter af kold PBS og tilsæt 60 mikroliter cd14 mikroperler. Bland godt og inkuber cellerne på is i 15 minutter. Der tilsættes yderligere seks milliliter kold PBS og centrifuge ved 300 x g i 10 minutter ved fire grader Celsius.Derefter resuspend de pelleterede celler i 500 mikroliter af kold kører buffer. Sæt skillesøjlen i magnetseparatoren og vask den tre gange med to milliliter koldløbsbuffer. Overfør de resuspenderede celler til separationskolonnen, og lad dem passere.Igen, vaske kolonnen tre gange med to milliliter løbebuffer per vask. Løft derefter kolonnen fra magnetseparatoren og læg den over et 15 milliliter centrifugerør på is. Eluter cd14 positive celler med to milliliter koldløb buffer og centrifugeret ved 300 x g i 10 minutter ved fire grader Celsius at pellet cellerne.Pelletsuspendrer pellet i to milliliter koldt kemisk defineret serummedium og overfører 50 mikroliter af den til et 1,5 milliliterrør. Pletten de opnåede celler med 10 mikroliter krome Orange-konjugeret anti-human CD14 monoklonale antistoffer i 20 minutter. Der tilsættes en milliliter PBS og centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter for at pelletere cellerne.Opslæmning af cellepillerne i 200 mikroliter AF PBS og overføre det til en fem milliliter rør. Bestemme renheden af CD14+monocytter ved flowcytometri. Frø en million af de opnåede renset monocytter i et væv kultur behandlet seks-brønd plade og inkubere i to timer ved 37 grader Celsius under 5% kuldioxid.Efter inkubation kassere supernatant og forsigtigt tilføje to milliliter af 37 graders forvarmt kemisk defineret serum-fri kultur medium, derefter tilføje 80 mikrogram af CB-SC-afledte exosomer til monocyt kultur i seks-brønd plade med et samlet volumen på to milliliter. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius under 5% kuldioxid i tre til fire dage. Derefter billede cellen morfologi ved hjælp af en omvendt mikroskop ved 200X forstørrelse.Tilføj en milliliter PBS-baseret celle dissociation buffer til at frigøre cellerne ved pipettering op og ned og høste de resterende celler med en celle skraber. Cellerne opsamls ved centrifugering ved 1, 690 x g i fem minutter, og de skal opslæskes i 200 mikroliter PBS. Tilføj fem mikroliter af FC-blokker for at blokere den ikke-specifikke binding, og tilsæt derefter antistofferne.Inkuber cellerne ved stuetemperatur i 30 minutter. Tilsæt en milliliter PBS til de inkuberede celler og centrifuge dem ved 300 x g i 10 minutter. Pelletsuspendrer pelletet i 200 mikroliter PBS og tilsættes fem mikroliter propidiumidodid pr. prøve.Overfør cellerne til et nyt fem milliliterflowrør, og udfør flowcytometri for at evaluere niveauerne af CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 og CD209-udtryk. CB-SC'ernes fænotype og renhed blev undersøgt ved flowcytometri med CB-SC-tilknyttede markører. Analysen viste høje niveauer af CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 og galectin 9 udtryk, men ingen udtryk for CD34 blev observeret.Flow cytometri analyse bekræfter også udtrykket af exome specifikke markører, CD9, CD 81, og CD63 på CB-SC-afledte exosomer. Størrelsen morfologi af exosomer var karakteriseret ved TEM og størrelsesfordelingen blev bestemt af DLS. Western blot yderligere bevise udtryk for exome tilhørende markør Alix uden udtryk for ER tilhørende markør, calnexin.Den direkte interaktion mellem Dio-mærket CB-SC-Exo med PBMC blev observeret ved hjælp af fluorescensmikroskopi. For bedre at kunne definere, hvilken cellepopulation der interagerede med den kaldte cb-SC-Exo, blev forskellige cellerum gated med cellespecifikke markører, såsom CD3 til T-celler, CD11C for myeloid dendritiske celler, CD14 for monocytter, CD19 for B-celler og CD56 for NK-celler. Monocytter blev primært ramt af CB-SC-afledte eksosomer, da de udviste højere median fluorescensintensitet end andre immuncellers.De exosom behandlede monocytter med succes differentieret i spindel-lignende morfologier. Der var en opregulering i niveauet af M2 associerede markører, såsom CD163, CD206, og CD209 efter behandlingen med CB-SC-afledte exosomer. Fænotopypisk sammenligning mellem konventionelle M2-makrofager og CB-SC exome-induceret M2-makrofager viste ingen væsentlige forskelle.Det vigtigste skridt i denne protokol er at tilføje CB-SC-afledte exosomer til monocyt af kultur i seks-brønd plade og inkubere det i tre til fire dage, som er nødvendige for cellens differentiering til andre type 2 makrofager med spindel-lignende morfologi. Dernæst vil vi udforske molekylekomponenterne inde i CB-SC-afledte exosomer, der bidrog til induktionen af differentiering af monocyt i type 2 makrofager.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Derived Exosomes

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Klinisk anvendelse af<em&gt; Tornerose</em&gt; Artificial og antigen-præsenterende celler til genetisk at modificere T-celler fra perifert og navlestrengsblod

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolering af precursor B-celle-undergrupper fra navlestrengsblod

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Isolering af humanmonocytter af Double Gradient centrifugering og deres differentiering til makrofager i teflonbelagte Cell Culture Tasker

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Dyrkning af makrofag kolonistimulerende faktor differentierede humane monocytafledte makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran effektiviserer Lentiviral transduktion af Murine og menneskelige primære NK-celler

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse af lymfocyt Ekstravasation Ved anvendelse af en<em&gt; In vitro</em&gt; Model af humant blod-hjernebarrieren

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte differentiering og trombocyttal dannelse fra menneskelige ledning blod-afledte CD34+ celler

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

Induceret differentiering af M celle-lignende celler i humane stamcelle-afledte ileal Enteroid Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Isolation, Transfection og kultur af primære humane monocytter

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...