Name: differentiation of monocytes into phenotypically distinct macrophages after treatment with human cord blood stem cell (cb-sc)-derived exosomes
Uploaded: 2020-11-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell CB-SC-Derived Exosomes at JoVE.com

We zijn de heer Poddar en de heer Ludwig dankbaar voor de genereuze financiering via Hackensack UMC Foundation. We waarderen Laura Zhao voor Engelse montage.

Het protocol volgt de richtlijnen van de institutionele human research ethische commissie van Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health. Menselijke buffy jas bloed eenheden werden gekocht bij de New York Blood Center (New York, NY). Menselijke navelstrengbloed eenheden werden verzameld van gezonde donoren en gekocht bij Cryo-Cell International bloedbank (Oldsmar, FL). Zowel New York Blood Center als Cryo-Cell hebben alle accreditaties voor bloedcollecties en distributies ontvangen, met IRB-goedkeuri...

<ol>
	<li>Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+educator+therapy+and+induction+of+immune+balance.">Stem cell educator therapy and induction of immune balance.</a> Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+type+1+diabetes+via+islet+beta+cell+regeneration+following+immune+modulation+by+cord+blood-derived+multipotent+stem+cells.">Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells.</a> BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+insulin+resistance+in+type+2+diabetes+via+immune+modulation+of+cord+blood-derived+multipotent+stem+cells+(CB-SCs)+in+stem+cell+educator+therapy:+phase+I/II+clinical+trial.">Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial.</a> BMC Medicine. 11, 160 (2013).</li><li>Delgado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+autoimmune+T-cell+memory+by+stem+cell+educator+therapy:+phase+1/2+clinical+trial.">Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial.</a> EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+regrowth+in+alopecia+areata+patients+following+Stem+Cell+Educator+therapy+BMC.">Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC.</a> Medicine. 13 (1), 87 (2015).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer:+small+vesicular+transporters+for+cancer+progression+and+metastasis,+biomarkers+in+cancer+therapeutics.">Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics.</a> PeerJ. 6, 4763 (2018).</li><li>Adamiak, M., Sahoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+myocardial+repair:+advances+and+challenges+in+the+development+of+next-generation+therapeutics.">Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics.</a> Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).</li><li>Akyurekli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+preclinical+studies+on+the+therapeutic+potential+of+mesenchymal+stromal+cell-derived+microvesicles.">A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles.</a> Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).</li><li>Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Released+exosomes+contribute+to+the+immune+modulation+of+cord+blood-derived+stem+cells+(CB-SC).">Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC).</a> Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).</li><li>Jacobson, G., K&#229;rsn&#228;s, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+parameters+in+semi-dry+electrophoretic+transfer.">Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer.</a> Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).</li><li>Dykstra, M. J., Reuss, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , (2011).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+vesicles:+general+methodologies+and+latest+trends.">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization:+different+gene+signatures+in+M1(LPS+)+vs.+classically+and+M2(LPS-)+vs.+alternatively+activated+macrophages.">Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).</li></ol>

Toepassing van exosomen is een opkomend gebied voor klinische diagnose, medicijnontwikkelingen en regeneratieve geneeskunde. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol met betrekking tot de voorbereiding van cb-SC-afgeleide exosomen en de functionele studie van exosomen over de differentiatie van menselijke monocyten. Het huidige protocol toonde aan dat functionele CB-SC-afgeleide exosomen worden geïsoleerd door sequentiële centrifugatie en ultracentrifugatie met een hoge zuiverheid en het vertonen van de immuunmod...

Navelstrengbloedstamcellen (CB-SC) zijn uniek type stamcellen die zijn geïdentificeerd uit menselijk navelstrengbloed en onderscheiden zich van andere bekende soorten stamcellen zoals mesenchymale stamcellen (MSC) en hematopoietische stamcellen (HSC)1. Op basis van hun unieke eigenschappen van immuunmodulatie en hun vermogen om zich strak aan het oppervlak van petrischaaltjes te houden, ontwikkelden we een nieuwe technologie die is aangewezen als Stem Cell Educator (SCE) therapie in klinische studies2,3. Tijdens de SCE-therapie worden de perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC) van een patiënt verzameld en verspreid via een celafscheider en co-gekweekt met aanhangende CB-SC in vitro. Deze "opgeleide" cellen (CB-SC-behandelde PBMC) worden vervolgens teruggegeven aan de circulatie van de patiënt in een gesloten-lus systeem. Klinische studies hebben al aangetoond dat de klinische veiligheid en werkzaamheid van SCE-therapie voor de behandeling van auto-immuunziekten, waaronder type 1 diabetes (T1D)2,4 en alopecia areata (AA)5.
Exosomen zijn een familie van nanodeeltjes met diameters variërend 30\u2012150 nm en bestaan in alle biofluïde en celkweek media6. Exosomen zijn verrijkt met vele bioactieve moleculen, waaronder lipiden, mRNAs, eiwitten en microRNAs (miRNA), en spelen een belangrijke rol in cel-tot-cel communicatie. De laatste tijd zijn exosomen aantrekkelijker geworden voor onderzoekers en farmaceutische bedrijven vanwege hun therapeutische mogelijkheden in klinieken7,8,9. Onlangs hebben onze mechanistische studies aangetoond dat CB-SC-vrijgegeven exosomen bijdragen aan de immuunmodulatie van SCE therapie10.
Hier beschrijven we het protocol om het mechanisme van SCE-therapie te verkennen gericht op monocyten door CB-SC-vrijgegeven exosomen. Ten eerste werden door CB-SC vrijgegeven exosomen geïsoleerd van door CB-SC afgeleide geconditioneerde media met behulp van ultracentrifugeringsmethoden en gevalideerd door stromingscytometrie, western blot (WB) en dynamic light scattering (DLS). Ten tweede werden cb-SC-afgeleide exosomen gelabeld met een groene fluorescerende lipofiele kleurstof: Dio. Ten derde werden ze samen met PBMC gecoökt om de positieve percentages van dio-gelabelde CB-SC-afgeleide exosomen te onderzoeken op de verschillende subpopulaties van PBMC door flow cytometrie. Dit protocol biedt richtlijnen om de werking van exosomen te bestuderen die ten grondslag liggen aan de immuunmodulatie van stamcellen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>Non-tissue culture 
			plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio)</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>D4292-20MG</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 Mesh Grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td>Tissue culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td>Tissue culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Alix</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>634501</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2268110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Calnexin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>699401</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2728519</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561356</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_10611859</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B36294</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2728099</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD163 antibody, PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>556018</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_396296</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD19 antibody, PC5</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2643U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_131160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD206 antibody, FITC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>551135</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_394065</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>564127</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2738610</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD270 antibody, PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>318806</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2203703</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300431</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_1595437</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD34 antibody, APC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2427U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD4 antibody, APC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555349</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_398593</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM3548U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_1575969</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD56 antibody, PE</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2073U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_131195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD63 antibody,PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561925</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_10896821</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94686</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD80 antibody, APC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30642</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD81 antibody, FITC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561956</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_394049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30646</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD9 antibody, FITC</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>MA5-16860</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2538339</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>348919</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2716134</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>50-5841-82</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_11218882</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>53-9811-82</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2574479</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A1933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffy coat</td>
			<td>New York Blood Center</td>
			<td></td>
			<td>40-60 ml/unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable semi-micro cuvette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97000590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>131510014</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Chanber cell counting slides</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Human CD63 Detection reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10606D</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS density grandient media</td>
			<td>GE Health</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor(25&#176;)</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75003698</td>
			<td>Maxium 24,700 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>3 lasers 
			10 Color Max</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cord blood</td>
			<td>Cryo-Cell International</td>
			<td></td>
			<td>40-100 ml/unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fc Block</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>564220</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentriguge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker MP4</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>S-3500-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>56-66211E</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti2 microscope</td>
			<td>Nikon instruments Inc</td>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>NIS-Elements software version 5.11.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hochest 33342</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>62249</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revert microsopy</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12563518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor 41 Ti</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td>Maxium 41,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75003655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-20 cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-2100 PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X&#39;VIVO 15 Serum-free medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BEBP04-744Q</td>
			<td>1000 ml Culture medium, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of monocytes into phenotypically distinct macrophages after treatment with human cord blood stem cell (cb-sc)-derived exosomes

Stamcel educator (SCE) therapie is een nieuwe klinische aanpak voor de behandeling van type 1 diabetes en andere auto-immuunziekten. SCE-therapie circuleert de bloedmononucleaire cellen van de geïsoleerde patiënt (bijvoorbeeld lymfocyten en monocyten) via een aferesemachine, co-culturen van de patiënt bloed mononucleaire cellen met aanhangende navelstrengbloed afgeleide stamcellen (CB-SC) in de SCE-apparaat, en vervolgens keert deze "opgeleide" immuuncellen naar het bloed van de patiënt. Exosomen zijn nano-sized extracellulaire vesicles tussen 30\u2012150 nm bestaande in alle biofluïde en celkweek media. Om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan SCE-therapie verder te onderzoeken en de acties van exosomen die vrijkomen bij CB-SC te bepalen, onderzoeken we welke cellen deze exosomen phagocytiseren tijdens de behandeling met CB-SC. Door dio-gelabelde CB-SC-afgeleide exosomen met menselijke perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC) mede te kweken, ontdekten we dat cb-SC-afgeleide exosomen voornamelijk werden overgenomen door menselijke CD14-positieve monocyten, wat leidde tot de differentiatie van monocyten in type 2 macrofagen (M2), met spindelachtige morfologie en expressie van M2-geassocieerde oppervlaktemoleculaire markers. Hier presenteren we een protocol voor de isolatie en karakterisering van cb-SC-afgeleide exosomen en het protocol voor de co-cultuur van CB-SC-afgeleide exosomen met menselijke monocyten en het toezicht op M2 differentiatie.

Aanvankelijk werden het fenotype en de zuiverheid van CB-SC onderzocht door stromingscytometrie met CB-SC-geassocieerde markers zoals leukocyten gemeenschappelijk antigeen CD45, ES-celspecifieke transcriptiefactoren OCT3/4 en SOX2. CB-SC tonen hoge niveaus van CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 en galectine 9 expressie, maar geen uitdrukking van CD34 (Figuur 1A). Flow cytometrie analyse bevestigde de expressie van exosoom-specifieke markers, waaronder CD9, CD81, en CD63 waren op CB-SC-afgeleide exoso...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell CB-SC-Derived Exosomes at JoVE.com

Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell CB-SC-Derived Exosomes

Exosoom toepassing is een opkomende tool voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en regeneratieve geneeskunde. We stellen een exosoom isolatieprotocol op met een hoge zuiverheid om exosomen te isoleren van nieuw geïdentificeerde stamcellen genaamd CB-SC voor mechanistische studies. We cocultuur cb-sc-afgeleide exosomen met menselijke monocyten, wat leidt tot hun differentiatie in fenotypically verschillende macrofagen.

Differentiatie van monocyten in fenotypisch verschillende macrofagen na behandeling met Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Afgeleide Exosomen

Stem Cell Educator (SCE) therapy is a novel clinical approach for the treatment of type 1 diabetes and other autoimmune diseases. SCE therapy circulates ...

De Stem Cell Educator therapie werd ontwikkeld om diabetes type I en de andere auto-immuunziekte te behandelen. Deze methode is ontwikkeld om het molecuulmechanisme te verkennen dat ten grondslag ligt aan immuunmatigheid van de stamcelopvoedertherapie via CB-SC vrijgegeven exosomen. Dit protocol biedt richtlijnen over hoe exosomen te zuiveren uit een menselijke navelstrengbloed stamcellen culturen en bepalen hun immuun modulatie van monocyten.Het aantonen van de procedure zal Wei Hu, een promovendus, uit mijn lab. Om te beginnen centrifuge het cb-SC-afgeleide geconditioneerde medium drie keer zoals beschreven in het tekstmanuscript, het verzamelen van de supernatant in een nieuwe 50 milliliter conische buis na elke centrifugatie. Na de derde centrifugatie filtert u de verkregen supernatant met een filter van 0,22 microliter en breng 15 milliliter media over naar elke 10 kilodaltoncentrifugaalfiltereenheid.Centrifuges op 4, 000 x g gedurende 30 minuten om de geconcentreerde exosoom media te isoleren. Breng de geconcentreerde exosomen over naar een ultracentrifugebuis. Dan pellet de exosomen op 100, 000 x g gedurende 80 minuten op vier graden Celsius.Gooi vervolgens de supernatant weg en zet de pelleted exosomen in 10 milliliter PBS terug. Voer een laatste ultracentrifugatie uit om de exomepel te verzamelen en opnieuw op te hangen in 200 microliters van PBS. Voeg 30 miljoen menselijke PBMCs toe aan een buis van 15 milliliter en centrifuge op 300 x g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.Resuspend de cellen in 300 microliter van koude PBS en voeg 60 microliter van CD14 microbeads toe. Meng goed en incubeer de cellen op ijs gedurende 15 minuten. Voeg nog zes milliliter koude PBS en centrifuge op 300 x g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.Dan resuspend de pelleted cellen in 500 microliters van koude lopende buffer. Plaats de scheidingskolom in de magneetafscheider en was deze drie keer met twee milliliter koudlopende buffer. Breng de geresuspended cellen over in de scheidingskolom en laat ze passeren.Nogmaals, was de kolom drie keer met twee milliliter lopende buffer per wasbeurt. Til vervolgens de kolom van de magneetafscheider en plaats deze over een 15 milliliter centrifugebuis op ijs. Elute de CD14 positieve cellen met twee milliliter koude lopende buffer en centrifuged op 300 x g gedurende 10 minuten op vier graden Celsius om de cellen pellet.Resuspend de pellet in twee milliliter koude chemische gedefinieerde serum medium en breng 50 microliter van het in een 1,5 milliliter buis. Bevlek de verkregen cellen met 10 microliter van Krome Orange-geconjugeerde anti-menselijke CD14 monoklonale antilichamen gedurende 20 minuten. Voeg een milliliter PBS en centrifuge op 300 x g gedurende 10 minuten om de cellen pellet.Resuspend de cel pellet in 200 microliters van PBS en breng het in een vijf milliliter buis. Bepaal de zuiverheid van CD14+monocyten door flow cytometrie. Zaad een miljoen van de verkregen gezuiverde monocyten in een weefselkweek behandeld zes-put plaat en incubbaat voor twee uur op 37 graden Celsius onder 5%kooldioxide.Na incubatie gooi de supernatant en voeg voorzichtig twee milliliter van 37 graden voorverwarmde chemische gedefinieerde serum-vrije kweekmedium, voeg vervolgens 80 microgram van de CB-SC-afgeleide exosomen toe aan de monocytencultuur in de zes-put plaat met een totaal volume van twee milliliter. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius onder 5%kooldioxide gedurende drie tot vier dagen. Beeld vervolgens de celmorfologie met behulp van een omgekeerde microscoop bij vergroting van 200x.Voeg een milliliter pbs-gebaseerde celdissociatie buffer om de cellen los te maken door pipetting op en neer en oogst de resterende cellen met een cel schraper. Verzamel de cellen door vijf minuten lang te centrifugeren op 1, 690 x g en ze opnieuw op te stellen in 200 microliters van PBS. Voeg vijf microliter van FC blocker toe om de niet-specifieke binding te blokkeren en voeg vervolgens de antilichamen toe.Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Voeg een milliliter PBS toe aan de geïncubeerde cellen en centrifugeer ze gedurende 10 minuten op 300 x g. Resuspend de pellet in 200 microliters van PBS en voeg vijf microliter propidium jodide per monster.Breng de cellen over naar een nieuwe stroombuis van vijf milliliter en voer stroomcytometrie uit om de niveaus van cd14, CD80, CD86, CD163, CD206 en CD209-expressie te evalueren. Het fenotype en de zuiverheid van CB-SCs werden onderzocht door stromingscytometrie met CB-SC geassocieerde markers. De analyse toonde hoge niveaus van CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 en galectine 9 uitdrukking maar geen uitdrukking van CD34 werd waargenomen.Flow cytometrie analyse bevestigt ook de expressie van exoom specifieke markers, CD9, CD 81, en CD63 op CB-SC-afgeleide exosomen. De groottemorfologie van exosomen werd gekenmerkt door TEM en de grootteverdeling werd bepaald door DLS. Westelijke vlek bewijst verder de uitdrukking van de exoom bijbehorende teller Alix zonder uitdrukking van de ER geassocieerde marker, calnexin.De directe interactie van Dio-gelabelde CB-SC-Exo met PBMC werd waargenomen met behulp van fluorescentiemicroscopie. Om beter te definiëren welke celpopulatie interactie had met de wijzerplaat met het label CB-SC-Exo, werden verschillende celcompartimenten afgesloten met celspecifieke markers, zoals CD3 voor T-cellen, CD11C voor myeloïde dendritische cellen, CD14 voor monocyten, CD19 voor B-cellen en CD56 voor NK-cellen. Monocyten waren voornamelijk het doelwit van de CB-SC-afgeleide exosomen omdat ze hogere mediane fluorescentieintensiteiten vertoonden dan die van andere immuuncellen.De exosoom behandelde monocyten onderscheidden zich met succes in spindelachtige morfologieën. Er was een upregulation in het niveau van M2 geassocieerde markers, zoals CD163, CD206, en CD209 na de behandeling met CB-SC-afgeleide exosomen. De fenotypische vergelijking tussen conventionele M2-macrofagen en de door CB-SC geïnduceerde M2-macrofagen vertoonde geen significante verschillen.De belangrijkste stap in dit protocol is het toevoegen van CB-SC-afgeleide exosomen aan de monocyte van cultuur in zes-put plaat en uitbroeden voor drie tot vier dagen, die nodig zijn om de cel differentiatie naar andere type 2 macrofagen met spindel-achtige morfologie. Vervolgens gaan we de molecule componenten in cb-SC-afgeleide exosomen die hebben bijgedragen aan de inductie van differentiatie van monocyt in type 2 macrofagen te verkennen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Derived Exosomes

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Uitbreiden cytotoxische T-lymphocyten uit navelstrengbloed dat Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, en Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Klinische toepassing van<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; En Kunstmatige antigeen presenterende cellen genetisch te wijzigen T-cellen uit perifeer en navelstrengbloed

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolatie van Precursor B-cel subsets van navelstrengbloed

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Isolatie van humane monocyten door Double gradiëntcentrifugering en hun differentiatie tot macrofagen in Teflon-coating Cell Culture Tassen

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Cultuur van macrofaag kolonie-stimulerende factor Gedifferentieerde Human monocyt-afgeleide macrofagen

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran verbetert de efficiëntie van de lentivirale transductie van lymfkliertest en menselijke primaire NK-cellen

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse van lymfocyt extravasatie gebruik van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van het menselijk bloed-hersenbarrière

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyt differentiatie en bloedplaatjes vorming van mens koord bloed afkomstige CD34+ cellen

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

Geïnduceerde differentiatie van M cel-achtige cellen in menselijke stamcel-afgeleide Ileal Enteroid monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Isolatie, transfectie en cultuur van primaire humane monocyten

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...