Name: differentiation of monocytes into phenotypically distinct macrophages after treatment with human cord blood stem cell (cb-sc)-derived exosomes
Uploaded: 2020-11-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell CB-SC-Derived Exosomes at JoVE.com

Nous sommes reconnaissants à MM. Poddar et Ludwig pour leur généreux soutien financier par l’intermédiaire de la Fondation Hackensack UMC. Nous apprécions Laura Zhao pour le montage en anglais.

Le protocole suit les lignes directrices du comité institutionnel d’éthique de la recherche humaine au Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health. Des unités humaines de sang de manteau buffy ont été achetées du centre de sang de New York (New York, NY). Des unités humaines de sang de cordon ombilical ont été recueillies auprès de donneurs en bonne santé et achetées auprès de la banque de sang Cryo-Cell International (Oldsmar, FL). Le New York Blood Center et Cryo-Cell ont tous deux re...

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	<li>Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+educator+therapy+and+induction+of+immune+balance.">Stem cell educator therapy and induction of immune balance.</a> Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+type+1+diabetes+via+islet+beta+cell+regeneration+following+immune+modulation+by+cord+blood-derived+multipotent+stem+cells.">Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells.</a> BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+insulin+resistance+in+type+2+diabetes+via+immune+modulation+of+cord+blood-derived+multipotent+stem+cells+(CB-SCs)+in+stem+cell+educator+therapy:+phase+I/II+clinical+trial.">Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial.</a> BMC Medicine. 11, 160 (2013).</li><li>Delgado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+autoimmune+T-cell+memory+by+stem+cell+educator+therapy:+phase+1/2+clinical+trial.">Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial.</a> EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+regrowth+in+alopecia+areata+patients+following+Stem+Cell+Educator+therapy+BMC.">Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC.</a> Medicine. 13 (1), 87 (2015).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer:+small+vesicular+transporters+for+cancer+progression+and+metastasis,+biomarkers+in+cancer+therapeutics.">Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics.</a> PeerJ. 6, 4763 (2018).</li><li>Adamiak, M., Sahoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+myocardial+repair:+advances+and+challenges+in+the+development+of+next-generation+therapeutics.">Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics.</a> Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).</li><li>Akyurekli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+preclinical+studies+on+the+therapeutic+potential+of+mesenchymal+stromal+cell-derived+microvesicles.">A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles.</a> Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).</li><li>Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Released+exosomes+contribute+to+the+immune+modulation+of+cord+blood-derived+stem+cells+(CB-SC).">Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC).</a> Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).</li><li>Jacobson, G., K&#229;rsn&#228;s, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+parameters+in+semi-dry+electrophoretic+transfer.">Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer.</a> Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).</li><li>Dykstra, M. J., Reuss, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , (2011).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+vesicles:+general+methodologies+and+latest+trends.">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization:+different+gene+signatures+in+M1(LPS+)+vs.+classically+and+M2(LPS-)+vs.+alternatively+activated+macrophages.">Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).</li></ol>

L’application d’exosomes est un domaine émergent pour le diagnostic clinique, le développement de médicaments et la médecine régénérative. Ici, nous présentons un protocole détaillé concernant la préparation des exosomes CB-SC-dérivés et l’étude fonctionnelle des exosomes sur la différenciation des monocytes humains. Le protocole actuel a démontré que les exosomes fonctionnels CB-SC-dérivés sont isolés par centrifugation séquentielle et ultracentrifugation avec la pureté élevée et présentan...

Les cellules souches du sang de cordon ombilical (CB-SC) sont un type unique de cellules souches identifiées à partir du sang de cordon ombilical humain et se distinguent d’autres types connus de cellules souches telles que les cellules souches mésenchymales (MSC) et les cellules souches hématopoïétiques (HSC)1. En fonction de leurs propriétés uniques de modulation immunitaire et de leur capacité à adhérer étroitement à la surface des boîtes de Pétri, nous avons développé une nouvelle technologie désignée comme thérapie d’éducateur de cellules souches (SCE) dans les essaiscliniques 2,3. Pendant la thérapie de SCE, les cellules mononucléaires périphériques de sang d’un patient (PBMC) sont rassemblées et distribuées par un séparateur cellulaire et co-cultivés avec le CB-SC adhérent in vitro. Ces cellules « instruites » (CB-SC-traitées PBMC) sont alors retournées à la circulation du patient dans un système à boucle fermée. Les essais cliniques ont déjà démontré l’innocuité clinique et l’efficacité de la thérapie SCE pour le traitement des maladies auto-immunes, y compris le diabète de type 1 (T1D)2,4 et l’alopécie areata (AA)5.
Les exosomes sont une famille de nanoparticules dont le diamètre est de 30\u2012150 nm et existent dans tous les médias biofluides et de culture cellulaire6. Les exosomes sont enrichis de nombreuses molécules bioactives, y compris les lipides, les ARNM, les protéines et les microARN (miARN), et jouent un rôle important dans les communications cellule à cellule. Ces derniers temps, les exosomes sont devenus plus attrayants pour les chercheurs et les compagnies pharmaceutiques en raison de leur potentiel thérapeutique dans les cliniques7,8,9. Récemment, nos études mécanistes ont démontré que les exosomes CB-SC-libérés contribuent à la modulation immunisée de la thérapie de SCE10.
Ici, nous décrivons le protocole pour explorer le mécanisme de la thérapie de SCE ciblant des monocytes par des exosomes CB-SC-libérés. Premièrement, les exosomes libérés par CB-SC ont été isolés des supports conditionnés dérivés du CB-SC à l’aide de méthodes d’ultracentrifugation et validés par cytométrie d’écoulement, tache occidentale (WB) et diffusion dynamique de la lumière (DLS). Deuxièmement, les exosomes dérivés de CB-SC ont été étiquetés avec un colorant lipophile fluorescent vert : Dio. Troisièmement, ils ont été co-cultivés avec PBMC pour examiner les pourcentages positifs d’exosomes dérivés de CB-SC étiquetés Dio aux différentes sous-populations de PBMC par cytométrie de flux. Ce protocole fournit des conseils pour étudier l’action des exosomes sous-jacents à la modulation immunitaire des cellules souches.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>Non-tissue culture 
			plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio)</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>D4292-20MG</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 Mesh Grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td>Tissue culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td>Tissue culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Alix</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>634501</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2268110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Calnexin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>699401</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2728519</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561356</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_10611859</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B36294</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2728099</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD163 antibody, PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>556018</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_396296</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD19 antibody, PC5</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2643U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_131160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD206 antibody, FITC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>551135</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_394065</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>564127</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2738610</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD270 antibody, PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>318806</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2203703</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300431</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_1595437</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD34 antibody, APC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2427U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD4 antibody, APC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555349</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_398593</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM3548U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_1575969</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD56 antibody, PE</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2073U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_131195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD63 antibody,PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561925</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_10896821</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94686</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD80 antibody, APC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30642</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD81 antibody, FITC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561956</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_394049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30646</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD9 antibody, FITC</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>MA5-16860</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2538339</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>348919</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2716134</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>50-5841-82</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_11218882</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>53-9811-82</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2574479</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A1933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffy coat</td>
			<td>New York Blood Center</td>
			<td></td>
			<td>40-60 ml/unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable semi-micro cuvette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97000590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>131510014</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Chanber cell counting slides</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Human CD63 Detection reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10606D</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS density grandient media</td>
			<td>GE Health</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor(25&#176;)</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75003698</td>
			<td>Maxium 24,700 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>3 lasers 
			10 Color Max</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cord blood</td>
			<td>Cryo-Cell International</td>
			<td></td>
			<td>40-100 ml/unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fc Block</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>564220</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentriguge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker MP4</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>S-3500-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>56-66211E</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti2 microscope</td>
			<td>Nikon instruments Inc</td>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>NIS-Elements software version 5.11.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hochest 33342</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>62249</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revert microsopy</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12563518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor 41 Ti</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td>Maxium 41,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75003655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-20 cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-2100 PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X&#39;VIVO 15 Serum-free medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BEBP04-744Q</td>
			<td>1000 ml Culture medium, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of monocytes into phenotypically distinct macrophages after treatment with human cord blood stem cell (cb-sc)-derived exosomes

La thérapie d’éducateur de cellules souches (SCE) est une nouvelle approche clinique pour le traitement du diabète de type 1 et d’autres maladies auto-immunes. La thérapie de SCE fait circuler les cellules mononucléaires de sang du patient isolé (par exemple, lymphocytes et monocytes) par une machine d’apheresis, co-cultures les cellules mononucléaires de sang du patient avec des cellules souches adhérentes dérivées du sang de cordon ombilical (CB-SC) dans le dispositif de SCE, et retourne alors ces cellules immunitaires « instruites » au sang du patient. Les exosomes sont des vésicules extracellulaires de taille nanométrique entre 30\u2012150 nm existant dans tous les médias biofluidés et de culture cellulaire. Pour explorer davantage les mécanismes moléculaires sous-jacents à la thérapie SCE et déterminer les actions des exosomes libérés par CB-SC, nous étudions quelles cellules phagocytisent ces exosomes pendant le traitement par CB-SC. En co-culturant les exosomes dérivés du CB-SC étiquetés PAR Dio avec les cellules mononucléaires sanguines périphériques humaines (PBMC), nous avons constaté que les exosomes dérivés du CB-SC étaient principalement pris en charge par des monocytes humains CD14 positifs, conduisant à la différenciation des monocytes en macrophages de type 2 (M2), avec morphologie spindle-like et expression des marqueurs moléculaires de surface associés à M2. Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement et la caractérisation des exosomes cb-SC-dérivés et le protocole pour la co-culture des exosomes CB-SC-dérivés avec les monocytes humains et la surveillance de la différenciation M2.

Au commencement, le phénotype et la pureté du CB-SC ont été examinés par cytométrie de flux avec des marqueurs CB-SC-associés tels que l’antigène commun de leucocyte CD45, les facteurs de transcription cellule-spécifiques d’ES OCT3/4, et SOX2. Cb-SC afficher des niveaux élevés de CD45, OCT3/4, SOX2, CD270, et galectin 9 expression, mais aucune expression de CD34 (Figure 1A). L’analyse de cytométrie de flux a confirmé l’expression des marqueurs exosome-spécifiques compre...

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Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell CB-SC-Derived Exosomes

L’application Exosome est un outil émergent pour le développement de médicaments et la médecine régénérative. Nous établissons un protocole d’isolement exosome avec une grande pureté pour isoler les exosomes de nouvelles cellules souches identifiées appelées CB-SC pour les études mécanistes. Nous coculture également cb-SC-dérivé exosomes avec des monocytes humains, conduisant à leur différenciation en macrophages phénotypiquement distincts.

Différenciation des monocytes en macrophages phénotypiquement distincts après traitement par des exosomes dérivés de cellules souches de sang de cordon humain (CB-SC)-Dérivés

Stem Cell Educator (SCE) therapy is a novel clinical approach for the treatment of type 1 diabetes and other autoimmune diseases. SCE therapy circulates ...

La thérapie d’éducateur de cellules souches a été développée pour traiter le diabète de type I et l’autre maladie auto-immune. Cette méthode a été développée pour explorer le mécanisme de molécule sous-jacent à la modération immunitaire de la thérapie d’éducateur de cellules souches par des exosomes libérés de CB-SC. Ce protocole fournit des conseils sur la façon de purifier les exosomes à partir d’une culture de cellules souches du sang de cordon humain et de déterminer leur modulation immunitaire des monocytes.Wei Hu, doctorant, de mon labo, démontrera la procédure. Pour commencer, centrifugez le milieu conditionné dérivé du CB-SC trois fois tel que décrit dans le manuscrit du texte, recueillant le supernatant dans un nouveau tube conique de 50 millilitres après chaque centrifugation. Après la troisième centrifugation, filtrer le supernatant obtenu à l’aide d’un filtre de 0,22 microlitre et transférer 15 millilitres de médias à chaque unité de filtre centrifuge de 10 kilodaltons.Centrifugeuses à 4000 x g pendant 30 minutes pour isoler les médias exosome concentrés. Transférer les exosomes concentrés dans un tube d’ultracentrifugeuse. Puis pelleter les exosomes à 100 000 x g pendant 80 minutes à quatre degrés Celsius.Puis jetez le supernatant et resuspendez les exosomes granulés dans 10 millilitres de PBS. Effectuez une ultracentrifugation finale pour collecter la pastille d’exome et la résuspendre dans 200 microlitres de PBS. Ajouter 30 millions de PBMCs humains à un tube de 15 millilitres et une centrifugeuse à 300 x g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.Resuspendez les cellules en 300 microlitres de PBS froid et ajoutez 60 microlitres de microlitres de microbilles CD14. Bien mélanger et incuber les cellules sur la glace pendant 15 minutes. Ajouter six millilitres de PBS froid et centrifugeuse à 300 x g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.Puis résuspendez les cellules granulées dans 500 microlitres de tampon de fonctionnement à froid. Placez la colonne de séparation dans le séparateur d’aimant et lavez-la trois fois avec deux millilitres de tampon de fonctionnement à froid. Transférez les cellules résuspendées dans la colonne de séparation et laissez-les passer.Encore une fois, lavez la colonne trois fois avec deux millilitres de tampon en cours d’exécution par lavage. Soulevez ensuite la colonne du séparateur d’aimant et placez-la sur un tube de centrifugeuse de 15 millilitres sur la glace. Elute les cellules positives CD14 avec deux millilitres de tampon de fonctionnement à froid et centrifugés à 300 x g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour pelleter les cellules.Resuspendez la pastille en deux millilitres de sérum chimique froid défini moyen et transférer 50 microlitres de celui-ci dans un tube de 1,5 millilitre. Tacher les cellules obtenues avec 10 microlitres d’anticorps monoclonaux CD14 anti-humains conjugués à l’orange pendant 20 minutes. Ajouter un millilitre de PBS et centrifugeuse à 300 x g pendant 10 minutes pour pelleter les cellules.Resuspendez la pastille cellulaire dans 200 microlitres de PBS et transférez-la dans un tube de cinq millilitres. Déterminer la pureté des monocytes CD14+par cytométrie d’écoulement. Graines un million des monocytes purifiés obtenus dans une culture tissulaire traité plaque de six puits et incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone.Après l’incubation jeter le supernatant et ajouter doucement deux millilitres de 37 degrés de produit chimique préchauffé défini milieu de culture sans sérum, puis ajouter 80 microgrammes des exosomes CB-SC dérivés à la culture monocyte dans la plaque de six puits avec un volume total de deux millilitres. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone pendant trois à quatre jours. Puis l’image de la morphologie cellulaire à l’aide d’un microscope inversé à 200X grossissement.Ajouter un millilitre de tampon de dissociation cellulaire à base de PBS pour détacher les cellules en pipetting de haut en bas et de récolter les cellules restantes avec un grattoir cellulaire. Recueillir les cellules en centrifugant à 1690 x g pendant cinq minutes et les résuspendre dans 200 microlitres de PBS. Ajouter cinq microlitres de bloqueur FC pour bloquer la liaison non spécifique, puis ajouter les anticorps.Incuber les cellules à température ambiante pendant 30 minutes. Ajouter un millilitre de PBS aux cellules incubées et les centrifuger à 300 x g pendant 10 minutes. Resuspendez la pastille dans 200 microlitres de PBS et ajoutez cinq microlitres d’iodure de propidium par échantillon.Transférez les cellules dans un nouveau tube d’écoulement de cinq millilitres et effectuez la cytométrie d’écoulement pour évaluer les niveaux d’expression CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 et CD209. Le phénotype et la pureté des CB-SCs ont été examinés par cytométrie de flux avec des marqueurs associés à CB-SC. L’analyse a montré des niveaux élevés d’expression CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 et galectin 9, mais aucune expression de CD34 n’a été observée.L’analyse de cytométrie de flux confirme également l’expression des marqueurs spécifiques d’exome, CD9, CD 81, et CD63 sur des exosomes CB-SC-dérivés. La morphologie de taille des exosomes a été caractérisée par TEM et la distribution de taille a été déterminée par DLS. La tache occidentale prouve encore l’expression du marqueur associé d’exome Alix sans expression du marqueur associé d’ER, calnexin.L’interaction directe du CB-SC-Exo étiqueté Dio avec PBMC a été observée à l’aide de microscopie de fluorescence. Afin de mieux définir la population cellulaire qui interagissait avec le cadran étiqueté CB-SC-Exo, différents compartiments cellulaires ont été fermés avec des marqueurs spécifiques aux cellules, tels que le CD3 pour les lymphocytes T, le CD11C pour les cellules dendritiques myéloïdes, le CD14 pour les monocytes, le CD19 pour les cellules B et le CD56 pour les cellules NK. Les monocytes ont été principalement visés par les exosomes CB-SC-dérivés car ils ont exhibé des intensités médianes plus élevées de fluorescence que ceux d’autres cellules immunisées.Les monocytes traités exosome se sont différenciés avec succès en morphologies spindle-like. Il y avait une augmentation du niveau des marqueurs associés à M2, tels que CD163, CD206, et CD209 après le traitement avec des exosomes CB-SC-dérivés. La comparaison phénotypique entre les macrophages M2 conventionnels et les macrophages M2 induits par l’exome CB-SC n’a montré aucune différence significative.L’étape clé de ce protocole est l’ajout d’exosomes dérivés du CB-SC au monocyte de culture dans une plaque de six puits et l’incuber pendant trois à quatre jours, ce qui a eu besoin de la différenciation de la cellule à d’autres macrophages de type 2 avec morphologie spindle-like. Ensuite, nous allons explorer les composants des molécules à l’intérieur des exosomes dérivés du CB-SC qui ont contribué à l’induction de la différenciation des monocytes en macrophages de type 2.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Derived Exosomes

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L&#39;expansion des lymphocytes T cytotoxiques à partir de sang de cordon ombilical qui cytomégalovirus cible, le virus Epstein-Barr Virus et Adénovirus

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Recherche

Immunologie et infection

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Application clinique de<em&gt; Belle au Bois Dormant</em&gt; Et artificielle cellules présentatrices d&#39;antigènes pour modifier génétiquement des cellules T du sang de cordon ombilical et périphériques

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Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

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