Name: differentiation of monocytes into phenotypically distinct macrophages after treatment with human cord blood stem cell (cb-sc)-derived exosomes
Uploaded: 2020-11-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell CB-SC-Derived Exosomes at JoVE.com

אנו אסירי תודה למר פודדר ולמר לודוויג על תמיכה נדיבה במימון באמצעות קרן האקנסק UMC. אנו מעריכים את לורה זאו לעריכה אנגלית.

הפרוטוקול עוקב אחר ההנחיות של ועדת האתיקה של המחקר האנושי המוסדי במרכז לגילוי וחדשנות, Hackensack Meridian Health. יחידות דם של מעיל באפי אנושי נרכשו ממרכז הדם של ניו יורק (ניו יורק, ניו יורק). יחידות דם טבור אנושי נאספו מתורמים בריאים ונרכשו מבנק הדם הבינלאומי Cryo-Cell (Oldsmar, FL). הן מרכז הדם של ניו יורק והן ק...

<ol>
	<li>Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+educator+therapy+and+induction+of+immune+balance.">Stem cell educator therapy and induction of immune balance.</a> Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+type+1+diabetes+via+islet+beta+cell+regeneration+following+immune+modulation+by+cord+blood-derived+multipotent+stem+cells.">Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells.</a> BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+insulin+resistance+in+type+2+diabetes+via+immune+modulation+of+cord+blood-derived+multipotent+stem+cells+(CB-SCs)+in+stem+cell+educator+therapy:+phase+I/II+clinical+trial.">Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial.</a> BMC Medicine. 11, 160 (2013).</li><li>Delgado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+autoimmune+T-cell+memory+by+stem+cell+educator+therapy:+phase+1/2+clinical+trial.">Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial.</a> EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+regrowth+in+alopecia+areata+patients+following+Stem+Cell+Educator+therapy+BMC.">Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC.</a> Medicine. 13 (1), 87 (2015).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer:+small+vesicular+transporters+for+cancer+progression+and+metastasis,+biomarkers+in+cancer+therapeutics.">Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics.</a> PeerJ. 6, 4763 (2018).</li><li>Adamiak, M., Sahoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+myocardial+repair:+advances+and+challenges+in+the+development+of+next-generation+therapeutics.">Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics.</a> Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).</li><li>Akyurekli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+preclinical+studies+on+the+therapeutic+potential+of+mesenchymal+stromal+cell-derived+microvesicles.">A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles.</a> Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).</li><li>Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Released+exosomes+contribute+to+the+immune+modulation+of+cord+blood-derived+stem+cells+(CB-SC).">Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC).</a> Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).</li><li>Jacobson, G., K&#229;rsn&#228;s, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+parameters+in+semi-dry+electrophoretic+transfer.">Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer.</a> Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).</li><li>Dykstra, M. J., Reuss, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , (2011).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+vesicles:+general+methodologies+and+latest+trends.">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization:+different+gene+signatures+in+M1(LPS+)+vs.+classically+and+M2(LPS-)+vs.+alternatively+activated+macrophages.">Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).</li></ol>

יישום אקסוזומים הוא תחום מתפתח לאבחון קליני, פיתוחים תרופתיים ורפואה רגנרטיבית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לגבי הכנת exosomes CB-SC נגזר והמחקר הפונקציונלי של exosomes על ההבידול של מונוציטים אנושיים. הפרוטוקול הנוכחי הוכיח כי exosomes CB-SC פונקציונלי נגזר מבודדים על ידי צנטריפוגה רציף ultracentrifugation ע?...

תאי גזע דם טבורים (CB-SC) הם סוג ייחודי של תאי גזע המזוהים מדם טבור אנושי ומובדלים מסוגים ידועים אחרים של תאי גזע כגון תאי גזע mesenchymal (MSC) ותאי גזע hematopoietic (HSC)1. בהתבסס על המאפיינים הייחודיים שלהם של אפנון חיסוני והיכולת שלהם לדבוק בחוזקה על פני השטח של צחות פטרי, פיתחנו טכנולוגיה חדשה המוגדרת כטיפול מחנך תאי גזע (SCE) בניסוייםקליניים 2,3. במהלך טיפול SCE, תאים חד-גרעיניים בדם היקפי של המטופל (PBMC) נאספים ומופצים דרך מפריד תאים ויתורות בהתרבות עם CB-SC דבק במבחנה. תאים "משכילים" אלה (PBMC שטופלו ב-CB-SC) מוחזרים לאחר מכן למחזור הדם של המטופל במערכת סגורה. ניסויים קליניים כבר הוכיחו את הבטיחות הקלינית ואת היעילות של טיפול SCE לטיפול במחלות אוטואימוניות כולל סוכרת סוג 1 (T1D)2,4 והתקרחות areata (AA)5.
Exosomes הם משפחה של חלקיקים עם קטרים הנעים 30\u2012150 nm והם קיימים בכל biofluid ומדיה תרבות תא6. אקסוזומים מועשרים מולקולות ביואקטיביות רבות כולל שומנים, mRNAs, חלבונים, microRNAs (miRNA), ולשחק תפקיד חשוב בתקשורת תא לתא. לאחרונה, exosomes הפכו אטרקטיביים יותר עבור חוקרים וחברות תרופות בשל הפוטנציאל הטיפולי שלהםבמרפאות 7,8,9. לאחרונה, המחקרים המכניים שלנו הראו כי exosomes CB-SC שפורסמו לתרום אפנון חיסוני של טיפול SCE10.
כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול כדי לחקור את המנגנון של טיפול SCE מיקוד מונוציטים על ידי exosomes CB-SC שפורסמו. ראשית, exosomes CB-SC שוחררו היו מבודדים מ CB-SC נגזר מדיה מותנית באמצעות שיטות ultracentrifugation ואומתו על ידי ציטומטריה זרימה, כתם מערבי (WB) ופיזור אור דינמי (DLS). שנית, אקסוזומים נגזר CB-SC סומנו עם צבע ליפופילי פלורסנט ירוק: דיו. שלישית, הם היו שיתוף תרבות עם PBMC כדי לבחון את האחוזים החיוביים של exosomes CB-SC-מתויג בתת-אוכלוסיות שונות של PBMC על ידי ציטומטריית זרימה. פרוטוקול זה מספק הדרכה ללמוד את הפעולה של exosomes הבסיסית אפנון חיסוני של תאי גזע.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>Non-tissue culture 
			plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio)</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>D4292-20MG</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 Mesh Grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td>Tissue culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td>Tissue culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Alix</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>634501</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2268110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Calnexin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>699401</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2728519</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561356</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_10611859</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B36294</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2728099</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD163 antibody, PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>556018</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_396296</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD19 antibody, PC5</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2643U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_131160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD206 antibody, FITC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>551135</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_394065</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>564127</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2738610</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD270 antibody, PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>318806</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2203703</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300431</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_1595437</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD34 antibody, APC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2427U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD4 antibody, APC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555349</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_398593</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM3548U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_1575969</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD56 antibody, PE</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2073U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_131195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD63 antibody,PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561925</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_10896821</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94686</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD80 antibody, APC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30642</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD81 antibody, FITC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561956</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_394049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30646</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD9 antibody, FITC</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>MA5-16860</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2538339</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>348919</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2716134</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>50-5841-82</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_11218882</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>53-9811-82</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2574479</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A1933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffy coat</td>
			<td>New York Blood Center</td>
			<td></td>
			<td>40-60 ml/unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable semi-micro cuvette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97000590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>131510014</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Chanber cell counting slides</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Human CD63 Detection reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10606D</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS density grandient media</td>
			<td>GE Health</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor(25&#176;)</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75003698</td>
			<td>Maxium 24,700 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>3 lasers 
			10 Color Max</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cord blood</td>
			<td>Cryo-Cell International</td>
			<td></td>
			<td>40-100 ml/unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fc Block</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>564220</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentriguge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker MP4</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>S-3500-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>56-66211E</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti2 microscope</td>
			<td>Nikon instruments Inc</td>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>NIS-Elements software version 5.11.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hochest 33342</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>62249</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revert microsopy</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12563518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor 41 Ti</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td>Maxium 41,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75003655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-20 cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-2100 PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X&#39;VIVO 15 Serum-free medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BEBP04-744Q</td>
			<td>1000 ml Culture medium, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of monocytes into phenotypically distinct macrophages after treatment with human cord blood stem cell (cb-sc)-derived exosomes

טיפול במחנך תאי גזע (SCE) הוא גישה קלינית חדשנית לטיפול בסוכרת מסוג 1 ובמחלות אוטואימוניות אחרות. טיפול SCE מפיץ את תאי הדם החד-גרעיניים של המטופל המבודד (למשל, לימפוציטים ומונוציטים) באמצעות מכונת אפיה, תרבויות ותרביות תרבית הדם של המטופל mononuclear תאים עם תאי גזע טבור דבקים (CB-SC) במכשיר SCE, ולאחר מכן מחזיר תאים חיסוניים "משכילים" אלה לדם של המטופל. Exosomes הם שלל חוץ תאי בגודל ננו בין 30\u2012150 ננומטר קיים בכל מדיה ביו-נוזלים ותרבות תא. כדי להמשיך לחקור מנגנונים מולקולריים הבסיסיים טיפול SCE ולקבוע את הפעולות של exosomes שוחרר CB-SC, אנו חוקרים אילו תאים phagocytize אלה exosomes במהלך הטיפול עם CB-SC. על-ידי שיתוף culturing CB-SC-נגזר אקסוזומים עם תאים חד גרעיניים דם היקפיים אנושיים (PBMC), מצאנו כי exosomes נגזר CB-SC נלקחו בעיקר על ידי מונוציטים אנושיים CD14 חיובי, המוביל הבידול של מונוציטים לתוך סוג 2 מקרופאגים (M2), עם מורפולוגיה דמויי ציר וביטוי של סמנים מולקולריים משטח M2 הקשורים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ואפיון של אקסוזומים הנגזרים מ-CB-SC ולפרוטוקול לתרבות ההפוכחה של אקסוזומים שמקורם ב-CB-SC עם מונוציטים אנושיים וניטור בידול M2.

בתחילה, הפנוטיפ והטוהר של CB-SC נבדקו על ידי ציטומיה זרימה עם סמנים הקשורים CB-SC כגון leukocyte נפוץ אנטיגן CD45, ES תא ספציפי תמלול גורמי OCT3/4, ו SOX2. CB-SC להציג רמות גבוהות של CD45, OCT3/4, SOX2, CD270, ו ביטוי galectin 9, אבל אין ביטוי של CD34 (איור 1A). ניתוח ציטומטריית זרימה אישר את הביטוי של סמנים אקסוזום ס...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell CB-SC-Derived Exosomes at JoVE.com

Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell CB-SC-Derived Exosomes

יישום Exosome הוא כלי מתפתח לפיתוח תרופות ורפואה רגנרטיבית. אנו מקימים פרוטוקול בידוד אקסו-זמני עם טוהר גבוה כדי לבודד אקסוזומים מתאי גזע שזוהו על ידי רומן הנקראים CB-SC למחקרים מכניים. אנחנו גם coculture CB-SC נגזר אקסוזומים עם מונוציטים אנושיים, המוביל ההבדל שלהם לתוך מקרופאגים שונים phenotypically.

בידול של מונוציטים לתוך מקרופאגים שונים Phenotypically לאחר טיפול עם תאי גזע דם חוט אנושי (CB-SC)נגזר אקסוזומים

Stem Cell Educator (SCE) therapy is a novel clinical approach for the treatment of type 1 diabetes and other autoimmune diseases. SCE therapy circulates ...

הטיפול למחנך תאי גזע פותח לטיפול בסוכרת מסוג I ובטיפול במחלה האוטואימונית האחרת. שיטה זו פותחה כדי לחקור את מנגנון המולקולה שבבסיס המתינה החיסונית של טיפול מחנך תאי גזע באמצעות exosomes שוחרר CB-SC. פרוטוקול זה מספק הדרכה כיצד לטהר אקסוזומים מתרבות תאי גזע של תאי גזע של דם אנושי ולקבוע את אפנון החיסון שלהם של מונוציטים.הדגמת ההליך תהיה וואי הו, דוקטורנטית, מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, צנטריפוגה CB-SC נגזר בינוני מותנה שלוש פעמים כמתואר בכתב היד טקסט, איסוף supernatant לתוך צינור חרוט חדש 50 מיליליטר לאחר כל צנטריפוגה. לאחר הצנטריפוגה השלישית, סנן את העל-טבעי המתקבל באמצעות מסנן מיקרוליטר של 0.22 והעבר 15 מיליליטר מדיה לכל יחידת סינון צנטריפוגלית של 10 קילודלטון.צנטריפוגות ב 4, 000 x g במשך 30 דקות כדי לבודד את התקשורת exosome מרוכז. מעבירים את האקסוזומים המרוכזים לצינור אולטרה-מרכזי. ואז גלולה exosomes ב 100, 000 x גרם במשך 80 דקות בארבע מעלות צלזיוס.ואז להשליך את supernatant ולתלות מחדש את exosomes גלולה ב 10 מיליליטר של PBS. בצע אולטרה-מרכז סופי כדי לאסוף את גלולת האקסום ולתלות אותה מחדש ב-200 מיקרוליטרים של PBS. הוסף 30 מיליון PBMCs אנושיים לצינור 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.תוסיפו את התאים ל-300 מיקרוליטרים של PBS קר ותוסיפו 60 מיקרוליטרים של חיידקים CD14. מערבבים היטב ו דגירה התאים על הקרח במשך 15 דקות. מוסיפים עוד שישה מיליליטר של PBS קר וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן בצע שימוש חוזר בתאים גלולה ב 500 microliters של מאגר ריצה קר. מניחים את עמוד ההפרדה במפריד המגנט ושוטפים אותו שלוש פעמים עם שני מיליליטר של חיץ ריצה קר. העבר את התאים המתווסתים לעמודת ההפרדה ושחרר אותם.שוב, לשטוף את העמוד שלוש פעמים עם שני מיליליטר של חיץ פועל לכל לשטוף. ואז להרים את העמוד ממפריד מגנט ולמקם אותו מעל צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר על קרח. אלוט CD14 תאים חיוביים עם שני מיליליטר של חיץ ריצה קר צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי גלולה את התאים.תעביר את גלולה בשני מיליליטר של מדיום סרום מוגדר כימי קר ולהעביר 50 microliters של אותו לתוך צינור 1.5 מיליליטר. הכתם את התאים המתקבלים עם 10 מיקרוליטרים של נוגדנים אנטי-אנושיים CD14 אנטי-אנושיים של Krome Orange במשך 20 דקות. הוסף מיליליטר אחד של PBS וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות כדי גלולה את התאים.תן שימוש חוזר לכדור התא ב-200 מיקרוליטרים של PBS ותעביר אותו לצינור של חמישה מיליליטר. קבע את הטוהר של CD14+מונוציטים לפי ציטומטריית זרימה. זרע מיליון מונוציטים מטוהרים המתקבלים בתרבות רקמות טיפלו צלחת שש באר דגירה במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני.לאחר הדגירה להשליך את supernatant בעדינות להוסיף שני מיליליטר של 37 מעלות מראש מחומם כימי מוגדר סרום תרבות בינונית, ולאחר מכן להוסיף 80 מיקרוגרם של exosomes CB-SC נגזר לתרבות מונוציטים בצלחת שש באר עם נפח כולל של שני מיליליטר. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני במשך שלושה עד ארבעה ימים. לאחר מכן תדמיין את מורפולוגיה התא באמצעות מיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 200.הוסף מיליליטר אחד של מאגר ניתוק תאים מבוסס PBS כדי לנתק את התאים על-ידי צינור למעלה ולמטה וקצר את התאים הנותרים באמצעות מגרד תאים. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 1, 690 x גרם במשך חמש דקות ו resuspend אותם 200 microliters של PBS. הוסף חמישה microliters של חוסם FC כדי לחסום את הכריכה הלא ספציפית, ולאחר מכן להוסיף את הנוגדנים.דגירה התאים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. הוסף מיליליטר אחד של PBS לתאים דגירה צנטריפוגה אותם ב 300 x גרם במשך 10 דקות. תוסיפו את גלולת ה-200 מיקרוליטר של PBS ותוסיפו חמישה מיקרוליטרים של פרופידיום יודיד לדגימה.העבר את התאים לצינור זרימה חדש של חמישה מיליליטר ובצע ציטומטריית זרימה כדי להעריך את רמות הביטויים CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 ו- CD209. הפנוטיפ והטוהר של CB-SCs נבדקו על ידי ציטומטריית זרימה עם סמנים הקשורים CB-SC. הניתוח הראה רמות גבוהות של CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 ו galectin 9 ביטוי אבל שום ביטוי של CD34 נצפתה.ניתוח ציטומטריית זרימה גם לאשר את הביטוי של סמנים ספציפיים exome, CD9, CD 81, ו CD63 על exosomes נגזר CB-SC. מורפולוגיה בגודל של אקסוזומים התאפיינה ב- TEM והתפלגות הגודל נקבעה על ידי DLS. כתם מערבי עוד יותר להוכיח את הביטוי של הסמן הקשורים Exome אליקס ללא ביטוי של הסמן הקשורים ER, calnexin.האינטראקציה הישירה של Dio שכותרתו CB-SC-Exo עם PBMC נצפתה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטי. כדי להגדיר טוב יותר איזו אוכלוסיית תאים קיימה אינטראקציה עם החיוג שכותרתו CB-SC-Exo, תאי תאים שונים היו מגודרים עם סמנים ספציפיים לתאים, כגון CD3 לתאי T, CD11C עבור תאים דנדריטיים מיאלואידיים, CD14 עבור מונוציטים, CD19 עבור תאי B ו- CD56 עבור תאי NK. מונוציטים היו ממוקדים בעיקר על ידי אקסוזומים שמקורם ב- CB-SC מכיוון שהם הציגו רמות פלואורסצנטיות חציוניות גבוהות יותר מאלה של תאים חיסוניים אחרים.המונוציטים המטופלים האקסוסום הבדילו בהצלחה למורפולוגיות דמויי ציר. הייתה עלייה ברמת סמנים הקשורים M2, כגון CD163, CD206, ו CD209 לאחר הטיפול עם אקסוזומים שמקורם CB-SC. השוואה פנוטיפית בין מקרופאגים M2 קונבנציונליים לבין מקרופאגים M2 הנגרמים על ידי CB-SC לא הראו הבדלים משמעותיים.הצעד העיקרי בפרוטוקול זה הוא הוספת אקסוזומים שמקורם ב- CB-SC למונוציטים של תרבות בצלחת של שש בארות והדגירה במשך שלושה עד ארבעה ימים, אשר היה צריך את ההתברות של התא למאקרופאגים מסוג 2 אחרים עם מורפולוגיה דמוית ציר. לאחר מכן, אנו הולכים לחקור את רכיבי המולקולה בתוך אקסוזומים שמקורם ב- CB-SC שתרמו להפקת בידול של מונוציטים למאקרופאגים מסוג 2.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Derived Exosomes

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

הרחבת לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיים מדם טבורים שציטומגלווירוס יעד, וירוס אפשטיין באר, וadenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

יישום קליני של<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; ומלאכותי תאי מציגי אנטיגן גנטי לשינוי תאי T מדם טבורים היקפי וטבורים

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

בידוד של קבוצות משנה מבשר B-cell מדם טבורים

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

בידוד של אדם מונוציטים ידי זוגי Gradient צנטריפוגה והבידול שלהם להמקרופאגים בתיקי תרבית תאים מצופים טפלון

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

תרבות של Macrophage מושבה מגרה פקטור בדיל אדם המקרופאגים מונוציטים הנגזר

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

לתוספי משפר את היעילות התמרה חושית Lentiviral של תאי NK העיקרי מאתר ואנושי

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

מגקריוציט בידול ויצירת טסית דם מן האדם כבל CD34 נגזר דם תאים+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

המושרה בידול של תאים כמו תא בתאי גזע האדם-הנגזר הנגזרת מונאואיד Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

בידוד, העברה ותרבות של האדם הראשי המונולוציטים

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...