Name: differentiation of monocytes into phenotypically distinct macrophages after treatment with human cord blood stem cell (cb-sc)-derived exosomes
Uploaded: 2020-11-12T13:00:00
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私たちは、ハッケンサックUMC財団を通じて寛大な資金援助をしてくれたポダー氏とルートヴィヒ氏に感謝しています。私たちは、英語の編集のためにローラ・ジャオに感謝します。

このプロトコルは、ハッッケンサック・メリディアン・ヘルスの発見・イノベーションセンターの制度的人間研究倫理委員会のガイドラインに従っています。ヒトバフィーコート血液ユニットは、ニューヨーク血液センター(ニューヨーク、ニューヨーク)から購入されました。ヒト臍帯血ユニットは健康なドナーから採取され、クライオセル・インターナショナル血液銀行(フロリダ州オール?...

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	<li>Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+educator+therapy+and+induction+of+immune+balance.">Stem cell educator therapy and induction of immune balance.</a> Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+type+1+diabetes+via+islet+beta+cell+regeneration+following+immune+modulation+by+cord+blood-derived+multipotent+stem+cells.">Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells.</a> BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+insulin+resistance+in+type+2+diabetes+via+immune+modulation+of+cord+blood-derived+multipotent+stem+cells+(CB-SCs)+in+stem+cell+educator+therapy:+phase+I/II+clinical+trial.">Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial.</a> BMC Medicine. 11, 160 (2013).</li><li>Delgado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+autoimmune+T-cell+memory+by+stem+cell+educator+therapy:+phase+1/2+clinical+trial.">Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial.</a> EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+regrowth+in+alopecia+areata+patients+following+Stem+Cell+Educator+therapy+BMC.">Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC.</a> Medicine. 13 (1), 87 (2015).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer:+small+vesicular+transporters+for+cancer+progression+and+metastasis,+biomarkers+in+cancer+therapeutics.">Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics.</a> PeerJ. 6, 4763 (2018).</li><li>Adamiak, M., Sahoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+myocardial+repair:+advances+and+challenges+in+the+development+of+next-generation+therapeutics.">Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics.</a> Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).</li><li>Akyurekli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+preclinical+studies+on+the+therapeutic+potential+of+mesenchymal+stromal+cell-derived+microvesicles.">A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles.</a> Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).</li><li>Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Released+exosomes+contribute+to+the+immune+modulation+of+cord+blood-derived+stem+cells+(CB-SC).">Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC).</a> Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).</li><li>Jacobson, G., K&#229;rsn&#228;s, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+parameters+in+semi-dry+electrophoretic+transfer.">Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer.</a> Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).</li><li>Dykstra, M. J., Reuss, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , (2011).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+vesicles:+general+methodologies+and+latest+trends.">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization:+different+gene+signatures+in+M1(LPS+)+vs.+classically+and+M2(LPS-)+vs.+alternatively+activated+macrophages.">Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).</li></ol>

エキソソームの応用は、臨床診断、医薬品開発、再生医療の新たな分野です。ここでは、CB-SC由来エキソソームの調製とヒト単球の分化に関するエキソソームの機能研究に関する詳細なプロトコルを提示する。現在のプロトコルは、機能的CB-SC由来エキソソームが高純度で逐次遠心分離と超遠心分離によって単球に免疫変調を示すことによって単一体化されることを実証した。
<p class="jove_c...

臍帯血幹細胞(CB-SC)は、ヒト臍帯血から同定された独自のタイプの幹細胞であり、間葉系幹細胞(MSC)および造血幹細胞(HSC)1などの他の既知のタイプの幹細胞と区別される。免疫変調の特性とペトリ皿の表面にしっかりと付着する能力に基づいて、我々は臨床試験2、3で幹細胞教育者(SCE)療法として指定された新しい技術を開発しました。SCE療法の間に、患者の末梢血単核細胞(PBMC)は細胞分離器を介して集め、循環し、インビトロの付着CB-SCと共培養される。これらの「教育された」細胞(CB-SC処理PBMC)は、閉ループシステムで患者の循環に戻されます。臨床試験は、1型糖尿病(T1D)2、4および脱毛症(AA)5を含む自己免疫疾患の治療に対するSCE療法の臨床的安全性および有効性を既に実証している。
エキソソームは、直径30\u2012150 nmのナノ粒子ファミリーであり、すべての生体流体および細胞培養培地6に存在する。エキソソームは、脂質、mRNA、タンパク質、マイクロRNA(miRNA)を含む多くの生理活性分子で富化され、細胞間通信において重要な役割を果たします。最近では、エキソソームは、診療所7、8、9の治療の可能性のために、研究者や製薬会社にとってより魅力的になっています。最近、我々の機械学的研究はCB-SC放出エキソソームがSCE療法10の免疫調節に寄与することを実証した。
ここでは、CB-SC放出エキソソームによる単球を標的とするSCE療法のメカニズムを探るプロトコルについて述べる。まず、CB-SC放出エキソソームを超遠心分離法を用いてCB-SC由来のコンディション培地から分離し、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット(WB)および動的光散乱(DLS)によって検証した。第2に、CB-SC由来エキソソームは、緑色蛍光性親油性色素であるディオで標識した。第三に、彼らは、フローサイトメトリーによるPBMCの異なる亜集団におけるディオ標識CB-SC由来エキソソームの正の割合を調べるためにPBMCと共培養した。このプロトコルは、幹細胞の免疫調節の基礎となるエキソソームの作用を研究するためのガイダンスを提供する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>Non-tissue culture 
			plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio)</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>D4292-20MG</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 Mesh Grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td>Tissue culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td>Tissue culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Alix</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>634501</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2268110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Calnexin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>699401</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2728519</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561356</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_10611859</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B36294</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2728099</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD163 antibody, PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>556018</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_396296</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD19 antibody, PC5</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2643U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_131160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD206 antibody, FITC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>551135</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_394065</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>564127</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2738610</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD270 antibody, PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>318806</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2203703</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300431</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_1595437</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD34 antibody, APC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2427U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD4 antibody, APC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555349</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_398593</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM3548U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_1575969</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD56 antibody, PE</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2073U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_131195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD63 antibody,PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561925</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_10896821</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94686</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD80 antibody, APC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30642</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD81 antibody, FITC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561956</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_394049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30646</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD9 antibody, FITC</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>MA5-16860</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2538339</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>348919</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2716134</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>50-5841-82</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_11218882</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>53-9811-82</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2574479</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A1933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffy coat</td>
			<td>New York Blood Center</td>
			<td></td>
			<td>40-60 ml/unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable semi-micro cuvette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97000590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>131510014</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Chanber cell counting slides</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Human CD63 Detection reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10606D</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS density grandient media</td>
			<td>GE Health</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor(25&#176;)</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75003698</td>
			<td>Maxium 24,700 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>3 lasers 
			10 Color Max</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cord blood</td>
			<td>Cryo-Cell International</td>
			<td></td>
			<td>40-100 ml/unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fc Block</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>564220</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentriguge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker MP4</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>S-3500-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>56-66211E</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti2 microscope</td>
			<td>Nikon instruments Inc</td>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>NIS-Elements software version 5.11.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hochest 33342</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>62249</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revert microsopy</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12563518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor 41 Ti</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td>Maxium 41,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75003655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-20 cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-2100 PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X&#39;VIVO 15 Serum-free medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BEBP04-744Q</td>
			<td>1000 ml Culture medium, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of monocytes into phenotypically distinct macrophages after treatment with human cord blood stem cell (cb-sc)-derived exosomes

幹細胞教育者(SCE)療法は、1型糖尿病および他の自己免疫疾患の治療のための新しい臨床アプローチである。SCE療法は、単離された患者の血液単核細胞(例えば、リンパ球および単球)をアフェレシス機を介して循環し、SCE装置中の接着性臍帯血由来幹細胞(CB-SC)を有する患者の血液単核細胞を共培養し、これらの「教育された」免疫細胞を患者の血液に戻す。エキソソームは、すべての生体流体および細胞培養媒体に存在する30\u2012150 nmの間のナノサイズの細胞外小胞である。SCE療法の基礎となる分子メカニズムをさらに探求し、CB-SCから放出されるエキソソームの作用を調べるため、CB-SCによる治療中にこれらのエキソソームを食作用させる細胞を調べる。ヒト末梢血単核細胞(PBMC)と共に標識されたCB-SC由来エキソソームを共培養することにより、CB-SC由来エキソソームはヒトCD14陽性単球によって主に取り込まれ、スピンドル様形態とM2関連表面マーカーの発現を伴う単球の分化(M2)につながることがわかった。ここでは、CB-SC由来エキソソームの分離と特徴付けのためのプロトコルと、ヒト単球とCB-SC由来エキソソームの共培養とM2分化のモニタリングのためのプロトコルを提示する。

当初、CB-SCの表現型と純度を、白血球共通抗原CD45、ES細胞特異的転写因子OCT3/4、およびSOX2などのCB-SC関連マーカーを用いてフローサイトメトリーにより調べた。CB-SCはCD45、OCT3/4、SOX2、CD270、およびガレクチン9の発現を高レベルで表示するが、CD34の発現は一切ない(図1A)。フローサイトメトリー解析では、CD9、CD81、およびCD63を含むエキソソーム特異的マーカーの発現がCB-...

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Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell CB-SC-Derived Exosomes

エキソソームアプリケーションは、医薬品開発と再生医療のための新たなツールです。我々は、高純度のエキソソーム分離プロトコルを確立し、機械学的研究のためにCB-SCと呼ばれる新しい同定された幹細胞からエキソソームを分離する。また、CB-SC由来エキソソームをヒト単球と共培養し、その分化を、定型的に区別するマクロファージに導いた。

ヒト臍帯血幹細胞(CB-SC)由来エキソソームによる治療後の単球の異定異性マクロファージへの分化

Stem Cell Educator (SCE) therapy is a novel clinical approach for the treatment of type 1 diabetes and other autoimmune diseases. SCE therapy circulates ...

幹細胞教育者療法は、I型糖尿病および他の自己免疫疾患を治療するために開発されました。この方法は、CB-SC放出エキソソームを通じて幹細胞教育療法の免疫モデレーションの基礎となる分子メカニズムを探求するために開発された。このプロトコルは、ヒト臍帯血幹細胞培養物からエキソソームを精製し、単球の免疫調節を決定する方法についてのガイダンスを提供する。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程の学生であるWei Huです。まず、CB-SC由来のコンディション培地をテキスト原稿に記載した3回遠心分離し、各遠心分離後に上清を新しい50ミリリットル円錐形管に集める。第3遠心分離後、得られた上清を0.22マイクロリットルのフィルターで濾過し、15ミリリットルの培地を各10キロダルトン遠心フィルター装置に移します。遠心分離機は4,000xgで30分間、濃縮エキソソーム培地を分離する。濃縮エキソソームを超遠心チューブに移します。その後、エキソソームを摂氏4度で80分間100,000xgでペレット化する。その後、上清を捨て、PBSの10ミリリットルでペレット化エキソソームを再懸濁します。最終的な超遠心分離を行い、エキソメペレットを回収し、PBSの200マイクロリットルで再懸濁します。摂氏4度で10分間、300xgの15ミリリットルチューブと遠心分離機に3,000万個のヒトPBMCを加えます。冷たいPBSの300マイクロリットルで細胞を再懸濁し、CD14マイクロビーズの60マイクロリットルを追加します。よく混ぜて、15分間氷の上の細胞をインキュベートします。冷たいPBSと遠心分離機を摂氏4度で10分間300xgでさらに6ミリリットル加えます。次に、ペレット化された細胞を500マイクロリットルのコールドランニングバッファーに再懸濁します。分離カラムをマグネットセパレータに入れ、2ミリリットルのコールドランニングバッファで3回洗います。再中断した細胞を分離列に移し、通過させます。繰り返しますが、1回の洗浄ごとに2ミリリットルのランニングバッファでカラムを3回洗います。次に、マグネットセパレータから柱を持ち上げ、氷の上に15ミリリットルの遠心管の上に置きます。2ミリリットルのコールドランニングバッファーを持つCD14陽性細胞をエルテし、300 x gで摂氏4度で10分間遠心して細胞をペレット化する。ペレットを2ミリリットルの冷たい化学定義血清培地で再懸濁し、50マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに移します。得られた細胞を、10マイクロリットルのクロームオレンジ共役抗ヒトCD14モノクローナル抗体を20分間染色する。細胞をペレットにするために300 x gでPBSと遠心分離機を1ミリリットル加えます。細胞ペレットをPBSの200マイクロリットルに再懸濁し、5ミリリットルのチューブに移します。フローサイトメトリーによりCD14+単球の純度を測定します。得られた精製単球の種子100万は、6ウェルプレートを処理し、5%の二酸化炭素の下で摂氏37度で2時間インキュベートする。インキュベートを廃棄し、37度の事前温められた化学物質定義された血清不全培養培地の2ミリリットルを穏やかに加え、その後、CB-SC由来エキソソームの80マイクログラムを6ウェルプレートの単球培養物に加え、総容量は2ミリリットルである。5%の二酸化炭素の下で37°Cでプレートを3〜4日間インキュベートします。次に、200倍の倍率で反転顕微鏡を使用して細胞形態を画像化します。PBSベースの細胞解離バッファーを1ミリリットル加え、上下にピペット処理して細胞を取り外し、残りの細胞を細胞スクレーパーで収穫します。1,690 x gで5分間遠心分離して細胞を回収し、200マイクロリットルのPBSで再懸濁します。FCブロッカーを5マイクロリットル加え、非特異的結合をブロックし、抗体を追加します。室温で30分間培養します。インキュベートされた細胞にPBSを1ミリリットル加え、300 x gで10分間遠心分離します。PBSの200マイクロリットルでペレットを再懸濁し、サンプルあたり5マイクロリットルのヨウ化プロピジウムを添加する。細胞を新しい5ミリリットルのフローチューブに移し、フローサイトメトリーを行い、CD14、CD80、CD86、CD163、CD206、およびCD209発現のレベルを評価します。CB-SCの表現型および純度を、CB-SC関連マーカーを用いたフローサイトメトリーによって調べた。この分析では、CD45、OCT3/4、SOX2、CD270およびガレクチン9の発現は高レベルであったが、CD34の発現は認められなかった。フローサイトメトリー解析では、CB-SC由来エキソソーム上のエキソーム特異的マーカー、CD9、CD81、およびCD63の発現も確認できます。エキソソームのサイズ形態はTEMによって特徴付け、サイズ分布はDLSによって決定された。ウェスタンブロットは、ER関連マーカー、カルネキシンの発現を伴わないエキソメ関連マーカーアリックスの発現をさらに証明する。ジオ標識CB-SC-ExoとPBMCの直接相互作用は、蛍光顕微鏡を用いて観察された。CB-SC-Exoとラベル付けされたダイヤルと相互作用する細胞集団をより良く定義するために、異なる細胞コンパートメントは、T細胞用CD3、骨髄樹状細胞用CD11C、単球用CD14、B細胞用CD19、NK細胞用CD56などの細胞特異的マーカーでゲート付けされた。単球は、他の免疫細胞よりも高い中央値蛍光強度を示したため、主にCB-SC由来のエキソソームによって標的とされた。エキソソームは単球をスピンドル様形態に分化し、正常に分化した。CB-SC由来エキソソームによる治療後、CD163、CD206、CD209などのM2関連マーカーのレベルに上位調節があった。従来のM2マクロファージとCB-SC外発性M2マクロファージとの間のフェノミカル比較は有意差を示さなかった。このプロトコルの重要なステップは、CB-SC由来エキソソームを6ウェルプレートの培養物に追加し、3〜4日間インキュベートすることです。次に、2型マクロファージへの単球の分化誘導に寄与したCB-SC由来エキソソーム内部の分子成分を探る。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Derived Exosomes

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

臍帯血から細胞傷害性Tリンパ球の拡大をそのターゲットサイトメガロウイルス、エプスタイン - バーウイルス、およびアデノウイルス

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

の臨床応用<em&gt;眠れる森の美女</em遺伝的に末梢及び臍帯血由来のT細胞を変更する&gt;と人工抗原提示細胞

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

臍帯血から前駆B細胞サブセットの分離

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

ダブル勾配遠心、テフロンコーティングされた細胞培養バッグ中のマクロファージへの分化によるヒト単球の単離

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

マクロファージコロニー刺激因子分化したヒト単球由来マクロファージの文化

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

デキストランは、マウスとヒト NK 細胞のレンチ ウイルスの伝達効率を向上します。

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

使用してリンパ球血管外漏出の分析<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト血液脳関門のモデル

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

巨核球分化および人間の血小板形成臍帯血由来 cd34 陽性細胞の+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

ヒト幹細胞由来腸腸単層におけるM細胞様細胞の誘導分化

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

原発性ヒト単球の単離、トランスフェクション、培養

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...