Name: differentiation of monocytes into phenotypically distinct macrophages after treatment with human cord blood stem cell (cb-sc)-derived exosomes
Uploaded: 2020-11-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell CB-SC-Derived Exosomes at JoVE.com

우리는 해켄색 UMC 재단을 통해 관대 한 자금 지원을 포드 다르 씨와 루드비히 씨에게 감사드립니다. 우리는 영어 편집에 대한 로라 자오 감사합니다.

이 프로토콜은 발견 및 혁신 센터, Hackensack 자오선 건강 센터의 기관 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 인간의 버피 코트 혈액 단위는 뉴욕 혈액 센터에서 구입 (뉴욕, 뉴욕). 인간 탯줄 혈액 단위는 건강한 기증자에게서 집합되고 Cryo 세포 국제 혈액 은행 (올즈마르, 플로리다)에서 구입했습니다. 뉴욕 혈액 센터와 Cryo-Cell은 IRB 승인및 기증자로부터 동의 서를 서명하여 혈액 수집 및 분포?...

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	<li>Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+educator+therapy+and+induction+of+immune+balance.">Stem cell educator therapy and induction of immune balance.</a> Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+type+1+diabetes+via+islet+beta+cell+regeneration+following+immune+modulation+by+cord+blood-derived+multipotent+stem+cells.">Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells.</a> BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+insulin+resistance+in+type+2+diabetes+via+immune+modulation+of+cord+blood-derived+multipotent+stem+cells+(CB-SCs)+in+stem+cell+educator+therapy:+phase+I/II+clinical+trial.">Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial.</a> BMC Medicine. 11, 160 (2013).</li><li>Delgado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+autoimmune+T-cell+memory+by+stem+cell+educator+therapy:+phase+1/2+clinical+trial.">Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial.</a> EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+regrowth+in+alopecia+areata+patients+following+Stem+Cell+Educator+therapy+BMC.">Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC.</a> Medicine. 13 (1), 87 (2015).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer:+small+vesicular+transporters+for+cancer+progression+and+metastasis,+biomarkers+in+cancer+therapeutics.">Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics.</a> PeerJ. 6, 4763 (2018).</li><li>Adamiak, M., Sahoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+myocardial+repair:+advances+and+challenges+in+the+development+of+next-generation+therapeutics.">Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics.</a> Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).</li><li>Akyurekli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+preclinical+studies+on+the+therapeutic+potential+of+mesenchymal+stromal+cell-derived+microvesicles.">A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles.</a> Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).</li><li>Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Released+exosomes+contribute+to+the+immune+modulation+of+cord+blood-derived+stem+cells+(CB-SC).">Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC).</a> Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).</li><li>Jacobson, G., K&#229;rsn&#228;s, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+parameters+in+semi-dry+electrophoretic+transfer.">Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer.</a> Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).</li><li>Dykstra, M. J., Reuss, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , (2011).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+vesicles:+general+methodologies+and+latest+trends.">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization:+different+gene+signatures+in+M1(LPS+)+vs.+classically+and+M2(LPS-)+vs.+alternatively+activated+macrophages.">Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).</li></ol>

엑소좀의 응용 은 임상 진단, 약물 개발 및 재생 의학을위한 신흥 분야입니다. 여기서는 CB-SC 유래 엑소좀의 제조와 인간 단핵구의 분화에 대한 엑소좀의 기능적 연구에 관한 상세한 프로토콜을 제시한다. 현재 프로토콜은 기능성 CB-SC 유래 엑소좀이 순도가 높은 순도및 모노사이클에 면역 변조를 나타내는 순차적 원심분리 및 초원심분리에 의해 격리된다는 것을 입증하였다.
...

적혈구(CB-SC)는 인간 적인 코드 혈액으로부터 확인된 줄기 세포의 독특한 유형이며, 중간엽 줄기 세포(MSC) 및 조혈줄기 세포(HSC)1과같은 다른 알려진 유형의 줄기 세포와 구별된다. 면역 변조의 독특한 특성과 페트리 접시의 표면에 단단히 부착 할 수있는 능력에 기초하여, 우리는 임상 시험2,3에서줄기 세포 교육자 (SCE) 치료로 지정된 새로운 기술을 개발했다. SCE 치료 중 환자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 세포 분리기를 통해 수집 및 순환되고 체외에서 부착된 CB-SC와 공동 배양됩니다. 이러한 "교육된" 세포(CB-SC 처리 PBMC)는 닫힌 루프 시스템에서 환자의 순환으로 반환됩니다. 임상시험은 이미 제1형 당뇨병(T1D)2,4 및탈모증 아레아타(AA)5를포함한 자가면역 질환의 치료를 위한 SCE 치료의 임상 안전성 및 효능을 입증하였다.
엑소좀은 직경 이 30\u2012150 nm에 이르는 나노입자의 가족이며 모든 생물유체 및 세포 배양 배지6에존재한다. 엑소좀은 지질, mRNA, 단백질 및 microRNA(miRNA)를 포함한 많은 생리활성 분자로 풍부하며 세포 간 통신에서 중요한 역할을 합니다. 늦게, 엑소좀은클리닉7,8,9에서그들의 치료 잠재력 때문에 연구원과 제약 회사에 대한 더 매력적되고있다. 최근, 우리의 기계론 연구는 CB-SC 방출 엑소좀SCE 치료의 면역 변조에 기여한다는 것을입증10.
여기서, 우리는 CB-SC 방출 엑소좀에 의하여 단핵구를 표적으로 하는 SCE 치료의 기계장치를 탐구하기 위하여 프로토콜을 기술합니다. 첫째, CB-SC 방출 엑소솜은 초원심분리 방법을 사용하여 CB-SC 유래 컨디셔닝 된 미디어로부터 격리되고 유동 세포측정법, 서부 블롯 (WB) 및 동적 광 산란 (DLS)에 의해 검증되었습니다. 둘째, CB-SC 유래 엑소좀은 녹색 형광성 리포필리오닉 염료인 디오로 표지되었다. 셋째, PBMC와 공동 배양하여 유동 세포측정에 의한 PBMC의 다양한 하위 집단에서 디오 라벨 CB-SC 유래 엑소좀의 양수를 검사했습니다. 이 프로토콜은 줄기 세포의 면역 변조의 기초가 되는 엑소좀의 작용을 연구하기 위한 지침을 제공합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>Non-tissue culture 
			plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio)</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>D4292-20MG</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 Mesh Grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td>Tissue culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td>Tissue culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Alix</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>634501</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2268110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Calnexin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>699401</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2728519</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561356</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_10611859</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B36294</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2728099</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD163 antibody, PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>556018</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_396296</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD19 antibody, PC5</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2643U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_131160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD206 antibody, FITC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>551135</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_394065</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>564127</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2738610</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD270 antibody, PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>318806</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2203703</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300431</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_1595437</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD34 antibody, APC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2427U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD4 antibody, APC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555349</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_398593</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM3548U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_1575969</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD56 antibody, PE</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2073U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_131195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD63 antibody,PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561925</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_10896821</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94686</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD80 antibody, APC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30642</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD81 antibody, FITC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561956</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_394049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30646</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD9 antibody, FITC</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>MA5-16860</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2538339</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>348919</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2716134</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>50-5841-82</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_11218882</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>53-9811-82</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2574479</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A1933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffy coat</td>
			<td>New York Blood Center</td>
			<td></td>
			<td>40-60 ml/unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable semi-micro cuvette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97000590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>131510014</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Chanber cell counting slides</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Human CD63 Detection reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10606D</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS density grandient media</td>
			<td>GE Health</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor(25&#176;)</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75003698</td>
			<td>Maxium 24,700 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>3 lasers 
			10 Color Max</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cord blood</td>
			<td>Cryo-Cell International</td>
			<td></td>
			<td>40-100 ml/unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fc Block</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>564220</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentriguge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker MP4</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>S-3500-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>56-66211E</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti2 microscope</td>
			<td>Nikon instruments Inc</td>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>NIS-Elements software version 5.11.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hochest 33342</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>62249</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revert microsopy</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12563518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor 41 Ti</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td>Maxium 41,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75003655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-20 cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-2100 PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X&#39;VIVO 15 Serum-free medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BEBP04-744Q</td>
			<td>1000 ml Culture medium, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of monocytes into phenotypically distinct macrophages after treatment with human cord blood stem cell (cb-sc)-derived exosomes

줄기세포 교육자(SCE) 치료는 제1형 당뇨병 및 기타 자가면역 질환의 치료를 위한 새로운 임상 접근법이다. SCE 요법은 격리된 환자의 혈액 단핵세포(예를 들어, 림프구 및 단핵구)를 체온기계를 통해 순환시키고, 환자의 혈액 단핵세포를 SCE 장치에서 부착된 코드 혈액 유래 줄기세포(CB-SC)와 공동 배양한 다음, 이러한 "교육받은" 면역 세포를 환자의 혈액에 반환합니다. 엑소좀은 모든 생물유체 및 세포 배양 매체에 존재하는 30\u2012150 nm 사이의 나노 크기의 세포외 소포이다. SCE 치료의 근본적인 분자 메커니즘을 더 탐구하고 CB-SC에서 풀어 놓인 엑소좀의 행동을 결정하기 위하여, 우리는 CB-SC를 가진 처리 도중 이 엑소좀을 phagocytize 하는 세포를 조사합니다. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 디오 라벨CB-SC 유래 엑소좀을 공동 배양함으로써, CB-SC 유래 엑소좀이 주로 인간 CD14 양성 단세포에 의해 채택되어, 단일세포의 분화로 이어지는 것을 발견하여, 스핀들-유사 모폴로지및 M2 의 분자 표면의 발현과 함께 단일세포의 분화로 이어진다. 여기서, 우리는 CB-SC 유래 엑소좀의 격리 및 특성화와 인간의 단핵구와 CB-SC 유래 엑소좀의 공동 배양을 위한 프로토콜및 M2 분화의 모니터링을 위한 프로토콜을 제시한다.

처음에 CB-SC의 표현형 및 순도는 백혈구 공통 항원 CD45, ES 세포 특이적 전사 인자 OCT3/4 및 SOX2와 같은 CB-SC 관련 마커를 사용하여 혈중 세포측정에 의해 검사되었다. CB-SC는 CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 및 galectin 9 발현의 높은 수준을 표시하지만 CD34의 발현은없습니다(도 1A). 유동 세포측정 분석은 CD9, CD81 및 CD63을 포함한 엑소좀 특이적 마커의 발현을 CB-SC 유래 엑소좀(도<strong class="xfig"...

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Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell CB-SC-Derived Exosomes

엑소솜 응용 프로그램은 신약 개발 및 재생 의학을위한 새로운 도구입니다. 우리는 기계학 연구를 위해 CB-SC에게 불린 새로운 확인된 줄기 세포에서 엑소좀을 격리하기 위하여 고순도와 엑소솜 격리 프로토콜을 설치합니다. 우리는 또한 인간의 단핵구와 CB-SC 유래 엑소좀을 결합하여 표현성 고유 의 대식세포로 분화합니다.

인간 코드 혈액 줄기 세포 (CB-SC)-유래 엑소좀으로 치료 후 페노전성 뚜렷한 대식세포로 단핵구를 분화

Stem Cell Educator (SCE) therapy is a novel clinical approach for the treatment of type 1 diabetes and other autoimmune diseases. SCE therapy circulates ...

줄기 세포 교육자 치료는 타입 I 당뇨병 및 그밖 자기 면역 질병을 취급하기 위하여 개발되었습니다. 이 방법은 CB-SC 방출 엑소좀을 통해 줄기 세포 교육자 치료의 근본적인 면역 적당성 분자 메커니즘을 탐구하기 위하여 개발되었습니다. 이 프로토콜은 인간 코드 혈액 줄기 세포 배양에서 엑소좀을 정화하고 단핵구의 면역 변조를 결정하는 방법에 대한 지침을 제공합니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 과정 학생 인 웨이 후 (Wei Hu)가 될 것입니다. 먼저, 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 CB-SC 유래 조건배지를 3회 원심분리하여 각 원심 분리 후 새로운 50밀리리터 원추형 튜브로 상류관을 수집한다. 세 번째 원심 분리 후, 얻은 상체를 0.22 마이크로리터 필터로 필터링하고 각 10킬로달톤 원심 필터 장치에 15 밀리리터의 미디어를 전송한다.집중된 외성 매체를 분리하기 위해 30분 동안 4, 000 x g의 원심분리기. 농축 된 엑소좀을 초원심분리기 튜브로 옮기다. 그런 다음 4섭씨에서 80분 동안 100, 000 x g의 외식을 펠렛합니다.그런 다음 상체를 버리고 PBS의 10 밀리리터에서 펠렛 엑소좀을 다시 중단합니다. 최종 초원심 분리를 수행하여 엑섬 펠릿을 수집하고 PBS의 200 마이크로리터에서 재중단합니다. 3,000만 대의 인간 PBMC를 15밀리리터 튜브에 넣고 원심분리기를 섭씨 4도에서 10분 동안 300xg에 추가합니다.감기 PBS의 300 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하고 CD14 마이크로 비드의 60 마이크로 리터를 추가합니다. 잘 섞어서 얼음에 세포를 15분간 배양합니다. 차가운 PBS와 원심분리기 6밀리리터를 섭씨 4도에서 10분간 300xg에 추가합니다.그런 다음 차가운 실행 버퍼의 500 마이크로 리터에서 펠렛 세포를 다시 중단합니다. 분리 컬럼을 자석 분리기위에 놓고 냉간 실행 버퍼 2밀리리터로 세 번 세척합니다. 다시 중단된 셀을 분리 열로 옮기고 전달합니다.다시 말하지만, 세척당 두 밀리리터의 러닝 버퍼로 컬럼을 세 번 씻으십시오. 그런 다음 자석 분리기에서 열을 들어 올려 얼음 위에 15 밀리리터 원심 분리 튜브 위에 놓습니다. 감기 실행 버퍼의 두 밀리리터와 원심 분리된 CD14 양성 세포를 Elute 는 세포를 펠릿하는 섭씨 4도에서 10 분 동안 300 x g로 원심분리합니다.차가운 화학 적 정의 혈청 매체의 두 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 1.5 밀리리터 튜브로 50 마이크로 리터를 전송합니다. Krome 오렌지-컨쥬게이드 항인간 CD14 단클론 항체의 10 마이크로리터를 20분 동안 스테인하였다. PBS와 원심분리기 1밀리리터를 300 x g에 넣고 10분간 첨가하여 세포를 펠릿합니다.PBS의 200 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 5 밀리리터 튜브로 전송합니다. 유동 세포측정에 의한 CD14+단핵구의 순도를 결정합니다. 조직 배양에서 정제된 단핵구 의 100만 개를 6웰 플레이트로 처리하고 이산화탄소 5% 미만의 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양하였다.인큐베이션 후 상체를 폐기하고 37도 의 2 밀리리터를 부드럽게 첨가한 다음 CB-SC 유래 엑소좀 80마이크로그램을 6웰 플레이트의 모노사이클 배양에 추가하여 총 2밀리리터를 첨가한다. 3~4일 동안 이산화탄소 5% 미만의 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 200X 배율에서 반전된 현미경을 사용하여 세포 형태학을 이미지화합니다.PBS 기반 세포 해리 버퍼 1밀리리터를 추가하여 세포를 위아래로 피펫하여 세포를 분리하고 셀 스크레이퍼로 나머지 셀을 수확합니다. 5 분 동안 1, 690 x g에서 원심 분리하여 세포를 수집하고 PBS의 200 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다. FC 차단제 5마이크로리터를 추가하여 비특이적 결합을 차단한 다음 항체를 추가합니다.실온에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 인큐베이션된 세포에 PBS 1밀리리터를 넣고 원심분리기를 300 x g에서 10분 동안 추가합니다. PBS의 200 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하고 샘플 당 프로피듐 요오드의 5 마이크로 리터를 추가합니다.새로운 5밀리리터 유동 튜브로 세포를 전송하고 CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 및 CD209 발현의 수준을 평가하기 위해 유동 세포측정을 수행한다. CB-SC의 표현형 및 순도는 CB-SC 관련 마커를 사용하여 혈류 세포측정에 의해 검사되었다. 분석은 CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 및 galectin 9 발현의 높은 수준을 보여주었지만 CD34의 발현은 관찰되지 않았다.유동 세포측정 분석은 또한 CB-SC 유래 엑소좀에 대한 외메 특이적 마커, CD9, CD 81 및 CD63의 발현을 확인한다. 엑소좀의 크기 형태는 TEM을 특징으로하고 크기 분포는 DLS에 의해 결정되었다. 웨스턴 블롯은 ER 관련 마커, 칼넥신의 발현 없이 엑메 관련 마커 알릭스의 발현을 더욱 증명한다.PBMC와 디오 라벨 CB-SC-엑소의 직접적인 상호 작용은 형광 현미경 검사를 사용하여 관찰되었다. 다이얼 표지된 CB-SC-엑소와 상호 작용하는 세포 집단을 더 잘 정의하기 위해, 다른 세포 구획은 T 세포를 위한 CD3, 골수성 수지상 세포를 위한 CD11C, 단화세포를 위한 CD14, B 세포를 위한 CD19 및 NK 세포를 위한 CD56와 같은 세포 특정 마커로 게이트되었습니다. 단핵구는 그밖 면역 세포의 그보다는 더 높은 중앙위형 광소를 전시하기 때문에 CB-SC 유래 엑소좀에 의해 주로 표적으로 했습니다.엑소솜 처리 단핵구는 스핀들 모양의 형태로 성공적으로 분화되었다. CB-SC 유래 엑소좀을 치료한 후 CD163, CD206 및 CD209와 같은 M2 관련 마커의 수준에서 강화 조절이 있었다. 종래의 M2 대식세포와 CB-SC 엑소메 유도 M2 대식세포 간의 Phenotypic 비교는 유의한 차이를 보이지 않았다.이 프로토콜의 핵심 단계는 6웰 플레이트에서 배양단에 CB-SC 유래 엑소좀을 추가하고 3~4일 동안 배양하는 것이며, 이는 스핀들 모양의 형태를 가진 다른 유형 2 대식세포에 세포의 분화에 필요한 것이다. 다음으로, 우리는 타입-2 대식세포로 단핵구의 분화의 유도에 기여한 CB-SC 유래 엑소좀의 안쪽에 분자 분대를 탐구할 것입니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Derived Exosomes

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

탯줄 혈액에서 세포 독성 T 림프구 확장이 대상 사이토 메갈로 바이러스, 엡스타인 - 바 바이러스, 그리고 아데노 바이러스

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

연구

면역학 및 감염병학

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

임상 신청<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em유전자 주변과 배꼽 탯줄 혈액에서 T 세포를 수정하는 셀을 제시&gt;과 인공 항원

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

탯줄 혈액에서 전구체 B-세포 하위 집합의 절연

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran Murine 및 인간의 기본 NK 세포의 Lentiviral 변환 효율 향상

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte 차별화와 인간에서 혈소판 형성 코드 혈액 파생 CD34+ 세포

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

인간 줄기 세포 유래 Ileal 장용 단층에서 M 세포 유사 세포의 분화 유도

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

1차 인간 단핵구의 고립, 형질전환 및 문화

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...