Name: differentiation of monocytes into phenotypically distinct macrophages after treatment with human cord blood stem cell (cb-sc)-derived exosomes
Uploaded: 2020-11-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell CB-SC-Derived Exosomes at JoVE.com

Vi er takknemlige til Mr. Poddar og Mr. Ludwig for sjenerøs finansiering støtte via Hackensack UMC Foundation. Vi setter pris på Laura Zhao for engelsk redigering.

Protokollen følger retningslinjene til institusjonell human research ethics committee ved Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health. Menneskelige buffy coat blodenheter ble kjøpt fra New York Blood Center (New York, NY). Blodenheter i navlestrengen ble samlet inn fra friske donorer og kjøpt fra Cryo-Cell International blodbank (Oldsmar, FL). Både New York Blood Center og Cryo-Cell har mottatt alle akkrediteringer for blodsamlinger og distribusjoner, med IRB-godkjenning og signerte samtykkeskjema...

<ol>
	<li>Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+educator+therapy+and+induction+of+immune+balance.">Stem cell educator therapy and induction of immune balance.</a> Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+type+1+diabetes+via+islet+beta+cell+regeneration+following+immune+modulation+by+cord+blood-derived+multipotent+stem+cells.">Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells.</a> BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+insulin+resistance+in+type+2+diabetes+via+immune+modulation+of+cord+blood-derived+multipotent+stem+cells+(CB-SCs)+in+stem+cell+educator+therapy:+phase+I/II+clinical+trial.">Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial.</a> BMC Medicine. 11, 160 (2013).</li><li>Delgado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+autoimmune+T-cell+memory+by+stem+cell+educator+therapy:+phase+1/2+clinical+trial.">Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial.</a> EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+regrowth+in+alopecia+areata+patients+following+Stem+Cell+Educator+therapy+BMC.">Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC.</a> Medicine. 13 (1), 87 (2015).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer:+small+vesicular+transporters+for+cancer+progression+and+metastasis,+biomarkers+in+cancer+therapeutics.">Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics.</a> PeerJ. 6, 4763 (2018).</li><li>Adamiak, M., Sahoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+myocardial+repair:+advances+and+challenges+in+the+development+of+next-generation+therapeutics.">Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics.</a> Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).</li><li>Akyurekli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+preclinical+studies+on+the+therapeutic+potential+of+mesenchymal+stromal+cell-derived+microvesicles.">A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles.</a> Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).</li><li>Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Released+exosomes+contribute+to+the+immune+modulation+of+cord+blood-derived+stem+cells+(CB-SC).">Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC).</a> Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).</li><li>Jacobson, G., K&#229;rsn&#228;s, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+parameters+in+semi-dry+electrophoretic+transfer.">Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer.</a> Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).</li><li>Dykstra, M. J., Reuss, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , (2011).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+vesicles:+general+methodologies+and+latest+trends.">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization:+different+gene+signatures+in+M1(LPS+)+vs.+classically+and+M2(LPS-)+vs.+alternatively+activated+macrophages.">Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).</li></ol>

Anvendelse av eksosomer er et fremvoksende felt for klinisk diagnose, legemiddelutvikling og regenerativ medisin. Her presenterer vi en detaljert protokoll om utarbeidelse av CB-SC-avledede eksosomer og funksjonell studie av eksosomer om differensiering av menneskelige monocytter. Den nåværende protokollen viste at funksjonelle CB-SC-avledede eksosomer er isolert av sekvensiell sentrifugering og ultracentrifugation med høy renhet og viser immunmodulasjon på monocytter.
Sammenlignet med and...

Cord blod stamceller (CB-SC) er unik type stamceller identifisert fra menneskelig ledning blod og skiller seg fra andre kjente typer stamceller som mesenchymal stamceller (MSC) og hematopoetiske stamceller (HSC)1. Basert på deres unike egenskaper for immunmodulering og deres evne til å holde seg tett til overflaten av Petri-retter, utviklet vi en ny teknologi utpekt som stamcellepedagog (SCE) terapi i kliniskestudier 2,3. Under SCE-behandling samles en pasients perifere mononukleære blodceller (PBMC) og sirkuleres gjennom en celleseparator og co-kultivert med tilhenger CB-SC in vitro. Disse "utdannede" cellene (CB-SC-behandlet PBMC) returneres deretter til pasientens sirkulasjon i et lukket sløyfesystem. Kliniske studier har allerede vist klinisk sikkerhet og effekt av SCE-behandling for behandling av autoimmune sykdommer, inkludert type 1 diabetes (T1D)2,4 og alopecia areata (AA)5.
Eksosomer er en familie av nanopartikler med diameter som spenner 30 \\ u2012150 nm og finnes i alle biofluid og celle kultur media6. Eksosomer er beriket med mange bioaktive molekyler, inkludert lipider, mRNAer, proteiner og microRNAs (miRNA), og spiller en viktig rolle i celle-til-celle-kommunikasjon. I det siste har eksosomer blitt mer attraktive for forskere og farmasøytiske selskaper på grunn av deres terapeutiske potensialer iklinikker 7,8,9. Nylig viste våre mekanistiske studier at CB-SC-utgitte eksosomer bidrar til immunmodulering av SCE-terapi10.
Her beskriver vi protokollen for å utforske mekanismen for SCE-terapi rettet mot monocytter av CB-SC-utgitte eksosomer. Først ble CB-SC-utgitte eksosomer isolert fra CB-SC-avledede besamlede besamlede besamlede medier ved hjelp av ultracentrifugation metoder og validert av strømningscytometri, vestlig flekk (WB) og dynamisk lyssprying (DLS). For det andre ble CB-SC-avledede eksosomer merket med et grønt fluorescerende lipofilt fargestoff: Dio. For det tredje ble de co-kultivert med PBMC for å undersøke de positive prosentandelene av Dio-merkede CB-SC-avledede eksosomer ved de forskjellige underpopulasjonene av PBMC ved flytcytometri. Denne protokollen gir veiledning for å studere virkningen av eksosomer som ligger til grunn for immunmodulering av stamceller.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>Non-tissue culture 
			plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio)</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>D4292-20MG</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 Mesh Grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td>Tissue culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td>Tissue culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Alix</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>634501</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2268110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Calnexin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>699401</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2728519</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561356</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_10611859</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B36294</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2728099</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD163 antibody, PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>556018</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_396296</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD19 antibody, PC5</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2643U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_131160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD206 antibody, FITC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>551135</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_394065</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>564127</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2738610</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD270 antibody, PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>318806</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2203703</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300431</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_1595437</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD34 antibody, APC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2427U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD4 antibody, APC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555349</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_398593</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM3548U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_1575969</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD56 antibody, PE</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2073U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_131195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD63 antibody,PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561925</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_10896821</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94686</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD80 antibody, APC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30642</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD81 antibody, FITC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561956</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_394049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30646</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD9 antibody, FITC</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>MA5-16860</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2538339</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>348919</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2716134</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>50-5841-82</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_11218882</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>53-9811-82</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2574479</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A1933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffy coat</td>
			<td>New York Blood Center</td>
			<td></td>
			<td>40-60 ml/unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable semi-micro cuvette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97000590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>131510014</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Chanber cell counting slides</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Human CD63 Detection reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10606D</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS density grandient media</td>
			<td>GE Health</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor(25&#176;)</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75003698</td>
			<td>Maxium 24,700 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>3 lasers 
			10 Color Max</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cord blood</td>
			<td>Cryo-Cell International</td>
			<td></td>
			<td>40-100 ml/unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fc Block</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>564220</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentriguge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker MP4</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>S-3500-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>56-66211E</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti2 microscope</td>
			<td>Nikon instruments Inc</td>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>NIS-Elements software version 5.11.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hochest 33342</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>62249</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revert microsopy</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12563518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor 41 Ti</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td>Maxium 41,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75003655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-20 cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-2100 PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X&#39;VIVO 15 Serum-free medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BEBP04-744Q</td>
			<td>1000 ml Culture medium, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of monocytes into phenotypically distinct macrophages after treatment with human cord blood stem cell (cb-sc)-derived exosomes

Stamcellepedagog (SCE) terapi er en ny klinisk tilnærming for behandling av type 1 diabetes og andre autoimmune sykdommer. SCE terapi sirkulerer den isolerte pasientens blod mononukleære celler (f.eks, lymfocytter og monocytter) gjennom en apheresis maskin, co-kulturer pasientens blod mononukleære celler med tilhenger ledningen blod-avledede stamceller (CB-SC) i SCE enheten, og deretter returnerer disse "utdannet" immunceller til pasientens blod. Eksosomer er nano-størrelse ekstracellulære vesikler mellom 30 \\ u2012150 nm eksisterende i alle biofluid og celle kultur medier. For ytterligere å utforske molekylære mekanismer underliggende SCE terapi og bestemme handlingene til eksosomer utgitt fra CB-SC, undersøker vi hvilke celler fagocytize disse eksosomer under behandlingen med CB-SC. Ved å co-culturing Dio-merket CB-SC-avledede eksosomer med humant perifert blod mononukleære celler (PBMC), fant vi at CB-SC-avledede eksosomer hovedsakelig ble tatt opp av menneskelige CD14-positive monocytter, noe som førte til differensiering av monocytter i type 2 makrofager (M2), med spindellignende morfologi og uttrykk for M2-tilhørende overflatemolekylære markører. Her presenterer vi en protokoll for isolasjon og karakterisering av CB-SC-avledede eksosomer og protokollen for co-kulturen til CB-SC-avledede eksosomer med menneskelige monocytter og overvåking av M2 differensiering.

I utgangspunktet ble fenotypen og renheten til CB-SC undersøkt ved flytcytometri med CB-SC-tilknyttede markører som leukocytt vanlige antigen CD45, ES cellespesifikke transkripsjonsfaktorer OCT3/4 og SOX2. CB-SC viser høye nivåer av CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 og galectin 9 uttrykk, men ingen uttrykk for CD34 (Figur 1A). Flow cytometri analyse bekreftet uttrykket av eksosom-spesifikke markører inkludert CD9, CD81, og CD63 var på CB-SC-avledede eksosomer (Figur 1B</st...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell CB-SC-Derived Exosomes at JoVE.com

Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell CB-SC-Derived Exosomes

Eksosomapplikasjon er et nytt verktøy for legemiddelutvikling og regenerativ medisin. Vi etablerer en eksosom isolasjonsprotokoll med høy renhet for å isolere eksosomer fra nye identifiserte stamceller kalt CB-SC for mekanistiske studier. Vi har også coculture CB-SC-avledede eksosomer med menneskelige monocytter, noe som fører til deres differensiering i fenotypisk distinkte makrofager.

Differensiering av monocytter i fenotypisk distinkte makrofager etter behandling med human cord blod stamcelle (CB-SC)-avledede exosomer

Stem Cell Educator (SCE) therapy is a novel clinical approach for the treatment of type 1 diabetes and other autoimmune diseases. SCE therapy circulates ...

Stamcellepedagogbehandlingen ble utviklet for å behandle type I diabetes og den andre autoimmune sykdommen. Denne metoden ble utviklet for å utforske molekylmekanismen underliggende immunmoderasjon av stamcellepedagogbehandling gjennom CB-SC utgitte eksosomer. Denne protokollen gir veiledning om hvordan å rense eksosomer fra en menneskelig ledning blod stamceller kulturer og bestemme deres immunmodulasjon av monocytter.Å demonstrere prosedyren vil være Wei Hu, en ph.d.-student, fra laboratoriet mitt. Til å begynne med, sentrifugere CB-SC-avledet betinget medium tre ganger som beskrevet i tekstmanuskriptet, samle supernatanten i et nytt 50 milliliter konisk rør etter hver sentrifugering. Etter den tredje sentrifugeringen filtrerer du det oppnådde supernatantet med et 0,22 mikroliterfilter og overfører 15 milliliter medier til hver 10 kilodalton sentrifugalfilterenhet.Sentrifuger ved 4000 x g i 30 minutter for å isolere konsentrert eksosom. Overfør de konsentrerte eksosomer til en ultracentrifuge tube. Deretter pellet eksosomer på 100, 000 x g i 80 minutter ved fire grader Celsius.Kast deretter de overnaturante og gjenoppusser de pelleted eksosomer i 10 milliliter PBS. Utfør en endelig ultracentrifugation for å samle eksompelleten og gjenbruke den i 200 mikroliter pbs. Tilsett 30 millioner menneskelige PBMCer til et 15 milliliter rør og sentrifuge ved 300 x g i 10 minutter ved fire grader Celsius.Resuspend cellene i 300 mikroliter kalde PBS og tilsett 60 mikroliter CD14 mikroperler. Bland godt og inkuber cellene på is i 15 minutter. Tilsett seks flere milliliter kald PBS og sentrifuge på 300 x g i 10 minutter ved fire grader Celsius.Deretter gjenbruker pelleted cellene i 500 mikroliter med kald kjører buffer. Plasser separasjonskolonnen i magnetseparatoren og vask den tre ganger med to milliliter kaldløpsbuffer. Overfør de gjenbrukte cellene til separasjonskolonnen og la dem passere.Igjen, vask kolonnen tre ganger med to milliliter med løpebuffer per vask. Løft deretter kolonnen fra magnetseparatoren og legg den over et 15 milliliter sentrifugerør på is. Elute CD14 positive celler med to milliliter kald kjører buffer og sentrifugert på 300 x g i 10 minutter ved fire grader Celsius å pellet cellene.Resuspend pellet i to milliliter av kaldt kjemisk definert serum medium og overføre 50 mikroliter av det til en 1,5 milliliter rør. Flekk de oppnådde cellene med 10 mikroliter krome oransjekonjugert anti-menneskelige CD14 monoklonale antistoffer i 20 minutter. Tilsett en milliliter PBS og sentrifuge på 300 x g i 10 minutter for å pellet cellene.Resuspend cellepellet i 200 mikroliter PBS og overføre den til en fem milliliter tube. Bestem renheten til CD14+monocytter ved flytcytometri. Seed en million av de oppnådde rensede monocytter i en vevskultur behandlet seks-brønns plate og inkubere i to timer ved 37 grader Celsius under 5% karbondioksid.Etter inkubasjon kast overnatant og legg forsiktig til to milliliter med 37 graders forhåndsoppvarmet kjemisk definert serumfri kulturmedium, og tilsett deretter 80 mikrogram cb-SC-avledede eksosomer til monocyttkulturen i seksbrønnsplaten med et totalt volum på to milliliter. Inkuber platen ved 37 grader Celsius under 5% karbondioksid i tre til fire dager. Deretter bilde celle morfologi ved hjelp av en invertert mikroskop på 200X forstørrelse.Legg til en milliliter PBS-basert celledissosiasjonsbuffer for å løsne cellene ved å pipettere opp og ned og høste de gjenværende cellene med en celleskraper. Samle cellene ved sentrifugering på 1, 690 x g i fem minutter og gjenbruke dem i 200 mikroliter pbs. Legg til fem mikroliter av FC-blokkering for å blokkere den ikke-spesifikke bindingen, og legg deretter til antistoffene.Inkuber cellene ved romtemperatur i 30 minutter. Tilsett en milliliter PBS til inkuberte celler og sentrifuge dem på 300 x g i 10 minutter. Resuspend pellet i 200 mikroliter pbs og tilsett fem mikroliter propidiumjodid per prøve.Overfør cellene til et nytt fem milliliter strømningsrør og utfør strømningscytometri for å evaluere nivåene av CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 og CD209-uttrykk. Fenotypen og renheten til CB-SCs ble undersøkt av flytcytometri med CB-SC-tilknyttede markører. Analysen viste høye nivåer av CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 og galectin 9 uttrykk, men ingen uttrykk for CD34 ble observert.Flow cytometri analyse bekrefter også uttrykket av exome spesifikke markører, CD9, CD 81, og CD63 på CB-SC-avledede eksosomer. Størrelsen morfologi av eksosomer var preget av TEM og størrelsesfordelingen ble bestemt av DLS. Vestlig flekk beviser videre uttrykket av eksome assosiert markør Alix uten uttrykk for ER-assosiert markør, calnexin.Den direkte interaksjonen mellom Dio-merket CB-SC-Exo med PBMC ble observert ved hjelp av fluorescensmikroskopi. For bedre å definere hvilken cellepopulasjon som samhandlet med den numeriske merket CB-SC-Exo, ble forskjellige cellerom inngjerdet med cellespesifikke markører, for eksempel CD3 for T-celler, CD11C for myeloid dendrittiske celler, CD14 for monocytter, CD19 for B-celler og CD56 for NK-celler. Monocytter ble primært målrettet av CB-SC-avledede eksosomer da de viste høyere median fluorescensintensiteter enn for andre immunceller.Eksosombehandlede monocytter ble vellykket differensiert til spindellignende morfologier. Det var en oppregulering i nivået av M2 tilknyttede markører, som CD163, CD206 og CD209 etter behandling med CB-SC-avledede eksosomer. Fenotypisk sammenligning mellom konvensjonelle M2 makrofager og CB-SC eksome-indusert M2 makrofager viste ingen signifikante forskjeller.Hovedtrinnet i denne protokollen er å legge CB-SC-avledede eksosomer til kulturens monocytt i seksbrønnsplaten og inkubere den i tre til fire dager, noe som var nødvendig for cellens differensiering til andre type 2 makrofager med spindellignende morfologi. Deretter skal vi utforske molekylkomponentene inne i CB-SC-avledede eksosomer som bidro til induksjon av differensiering av monocytt i type 2 makrofager.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Derived Exosomes

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Klinisk anvendelse av<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; Og kunstig antigenpresenterende celler å genmodifisere T celler fra perifert og navlestrengsblod

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolering av forløper B-celle undergrupper fra navlestrengsblod

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Isolering av humane monocytter ved å dobbelt gradientsentrifugering og deres differensiering til Makrofager i teflonbelagt cellekultur Vesker

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Kultur av makrofag-kolonistimulerende faktor Differensiert Humant Monocyte makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dekstran forbedrer Lentiviral signaltransduksjon effektiviteten av Murine og menneskelig primære NK celler

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse av lymfocytt-ekstravasasjon ved hjelp av en<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det menneskelige blod-hjernebarrieren

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte differensiering og blodplater formasjon fra menneske ledningen blod-avledet CD34+ celler

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

Indusert differensiering av M Cell-lignende celler i Human Stem Cell-avledet ileal Enteroid Monolagere

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Isolasjon, Transfeksjoner, og kultur for Primary Human monocytter

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...