Name: differentiation of monocytes into phenotypically distinct macrophages after treatment with human cord blood stem cell (cb-sc)-derived exosomes
Uploaded: 2020-11-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell CB-SC-Derived Exosomes at JoVE.com

Agradecemos al Sr. Poddar y al Sr. Ludwig por el generoso apoyo de fondos a través de la Fundación Hackensack UMC. Agradecemos a Laura Zhao por la edición en inglés.

El protocolo sigue las directrices del comité institucional de ética de la investigación humana en center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health. Las unidades de sangre de capa de buffy humana fueron compradas en el New York Blood Center (Nueva York, NY). Las unidades de sangre de cordón umbilical humano fueron recolectadas de donantes sanos y compradas en el banco de sangre Cryo-Cell International (Oldsmar, FL). Tanto el Centro de Sangre de Nueva York como Cryo-Cell han recibido todas las acreditac...

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	<li>Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+educator+therapy+and+induction+of+immune+balance.">Stem cell educator therapy and induction of immune balance.</a> Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+type+1+diabetes+via+islet+beta+cell+regeneration+following+immune+modulation+by+cord+blood-derived+multipotent+stem+cells.">Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells.</a> BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+insulin+resistance+in+type+2+diabetes+via+immune+modulation+of+cord+blood-derived+multipotent+stem+cells+(CB-SCs)+in+stem+cell+educator+therapy:+phase+I/II+clinical+trial.">Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial.</a> BMC Medicine. 11, 160 (2013).</li><li>Delgado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+autoimmune+T-cell+memory+by+stem+cell+educator+therapy:+phase+1/2+clinical+trial.">Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial.</a> EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+regrowth+in+alopecia+areata+patients+following+Stem+Cell+Educator+therapy+BMC.">Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC.</a> Medicine. 13 (1), 87 (2015).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer:+small+vesicular+transporters+for+cancer+progression+and+metastasis,+biomarkers+in+cancer+therapeutics.">Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics.</a> PeerJ. 6, 4763 (2018).</li><li>Adamiak, M., Sahoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+myocardial+repair:+advances+and+challenges+in+the+development+of+next-generation+therapeutics.">Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics.</a> Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).</li><li>Akyurekli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+preclinical+studies+on+the+therapeutic+potential+of+mesenchymal+stromal+cell-derived+microvesicles.">A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles.</a> Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).</li><li>Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Released+exosomes+contribute+to+the+immune+modulation+of+cord+blood-derived+stem+cells+(CB-SC).">Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC).</a> Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).</li><li>Jacobson, G., K&#229;rsn&#228;s, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+parameters+in+semi-dry+electrophoretic+transfer.">Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer.</a> Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).</li><li>Dykstra, M. J., Reuss, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , (2011).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+vesicles:+general+methodologies+and+latest+trends.">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization:+different+gene+signatures+in+M1(LPS+)+vs.+classically+and+M2(LPS-)+vs.+alternatively+activated+macrophages.">Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).</li></ol>

La aplicación de exosomas es un campo emergente para el diagnóstico clínico, el desarrollo de fármacos y la medicina regenerativa. Aquí, presentamos un protocolo detallado sobre la preparación de exosomas derivados de CB-SC y el estudio funcional de exosomas sobre la diferenciación de monocitos humanos. El protocolo actual demostró que los exosomas funcionales derivados de CB-SC están aislados por centrifugación secuencial y ultracentrifugación con alta pureza y que exhiben la modulación inmune en monocitos.<...

Las células madre de la sangre del cordón umbilical (CB-SC) son un tipo único de células madre identificadas a partir de la sangre del cordón umbilical humano y se distinguen de otros tipos conocidos de células madre como las células madre mesenquimales (MSC) y las células madre hematopoyéticas (HSC)1. Basándonos en sus propiedades únicas de modulación inmune y su capacidad para adherirnos firmemente a la superficie de los platos petri, desarrollamos una nueva tecnología designada como terapia de educador de células madre (SCE) en ensayos clínicos2,3. Durante el tratamiento con SCE, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un paciente se recogen y distribuyen a través de un separador celular y se co-cultivan con CB-SC adherente in vitro. Estas células "educadas" (PBMC tratada con CB-SC) se devuelven a la circulación del paciente en un sistema de bucle cerrado. Los ensayos clínicos ya han demostrado la seguridad clínica y eficacia del tratamiento SCE para el tratamiento de enfermedades autoinmunes como la diabetes tipo 1 (T1D)2,4 y la alopecia areata (AA)5.
Los exosomas son una familia de nanopartículas con diámetros que oscilan entre los 30o u2012150 nm y existen en todos los medios de cultivo de biofluidos y células6. Los exosomas están enriquecidos con muchas moléculas bioactivas, incluyendo lípidos, ARNm, proteínas y microRNAs (miRNA), y desempeñan un papel importante en las comunicaciones de célula a célula. En los últimos tiempos, los exosomas se han vuelto más atractivos para los investigadores y las compañías farmacéuticas debido a su potencial terapéutico en las clínicas7,8,9. Recientemente, nuestros estudios mecánicos demostraron que los exosomas liberados por CB-SC contribuyen a la modulación inmune de la terapia SCE10.
Aquí, describimos el protocolo para explorar el mecanismo de la terapia SCE dirigida a monocitos por exosomas liberados por CB-SC. En primer lugar, los exosomas liberados por CB-SC se aislaron de los medios condicionados derivados de CB-SC utilizando métodos de ultracentrifugación y se validaron mediante citometría de flujo, mancha occidental (WB) y dispersión dinámica de luz (DLS). En segundo lugar, los exosomas derivados de CB-SC fueron etiquetados con un tinte lipofílico fluorescente verde: Dio. En tercer lugar, se co-cultivaron con PBMC para examinar los porcentajes positivos de exosomas derivados de CB-SC con etiqueta dioda en las diferentes subpoblaciones de PBMC por citometría de flujo. Este protocolo proporciona orientación para estudiar la acción de los exosomas subyacentes a la modulación inmune de las células madre.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>Non-tissue culture 
			plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio)</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>D4292-20MG</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 Mesh Grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td>Tissue culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td>Tissue culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Alix</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>634501</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2268110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Calnexin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>699401</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2728519</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561356</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_10611859</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B36294</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2728099</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD163 antibody, PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>556018</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_396296</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD19 antibody, PC5</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2643U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_131160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD206 antibody, FITC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>551135</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_394065</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>564127</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2738610</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD270 antibody, PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>318806</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2203703</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300431</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_1595437</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD34 antibody, APC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2427U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD4 antibody, APC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555349</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_398593</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM3548U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_1575969</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD56 antibody, PE</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2073U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_131195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD63 antibody,PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561925</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_10896821</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94686</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD80 antibody, APC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30642</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD81 antibody, FITC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561956</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_394049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30646</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD9 antibody, FITC</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>MA5-16860</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2538339</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>348919</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2716134</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>50-5841-82</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_11218882</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>53-9811-82</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2574479</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A1933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffy coat</td>
			<td>New York Blood Center</td>
			<td></td>
			<td>40-60 ml/unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable semi-micro cuvette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97000590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>131510014</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Chanber cell counting slides</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Human CD63 Detection reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10606D</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS density grandient media</td>
			<td>GE Health</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor(25&#176;)</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75003698</td>
			<td>Maxium 24,700 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>3 lasers 
			10 Color Max</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cord blood</td>
			<td>Cryo-Cell International</td>
			<td></td>
			<td>40-100 ml/unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fc Block</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>564220</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentriguge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker MP4</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>S-3500-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>56-66211E</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti2 microscope</td>
			<td>Nikon instruments Inc</td>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>NIS-Elements software version 5.11.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hochest 33342</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>62249</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revert microsopy</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12563518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor 41 Ti</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td>Maxium 41,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75003655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-20 cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-2100 PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X&#39;VIVO 15 Serum-free medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BEBP04-744Q</td>
			<td>1000 ml Culture medium, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of monocytes into phenotypically distinct macrophages after treatment with human cord blood stem cell (cb-sc)-derived exosomes

La terapia de educador de células madre (SCE) es un nuevo enfoque clínico para el tratamiento de la diabetes tipo 1 y otras enfermedades autoinmunes. La terapia SCE circula las células mononucleares de la sangre del paciente aislado (por ejemplo, linfocitos y monocitos) a través de una máquina de aféresis, co-cultiva las células mononucleares de sangre del paciente con células madre derivadas de la sangre del cordón umbilical (CB-SC) en el dispositivo SCE, y luego devuelve estas células inmunitarias "educadas" a la sangre del paciente. Los exosomas son vesículas extracelulares de tamaño nanonúlgubre entre 30o u2012150 nm existentes en todos los medios de cultivo de biofluidos y células. Para explorar más a fondo los mecanismos moleculares subyacentes a la terapia SCE y determinar las acciones de los exosomas liberados de CB-SC, investigamos qué células fagocitan estos exosomas durante el tratamiento con CB-SC. Al co-cultivar exosomas derivados de CB-SC con células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC), descubrimos que los exosomas derivados de CB-SC eran tomados predominantemente por monocitos humanos CD14 positivos, lo que llevó a la diferenciación de los monocitos en macrófagos tipo 2 (M2), con morfología similar a un husillo y la expresión de marcadores de superficie moleculares asociados a M2. Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento y caracterización de exosomas derivados de CB-SC y el protocolo para la cocultura de exosomas derivados de CB-SC con monocitos humanos y el monitoreo de la diferenciación M2.

Inicialmente, el fenotipo y la pureza de CB-SC se examinaron mediante citometría de flujo con marcadores asociados a CB-SC como el antígeno común de leucocitos CD45, los factores de transcripción específicos de la célula ES OCT3/4 y SOX2. CB-SC muestra altos niveles de expresión CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 y galectina 9, pero ninguna expresión de CD34 (Figura 1A). El análisis de citometría de flujo confirmó la expresión de marcadores específicos de exosomas, incluidos CD9, CD81 y ...

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Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell CB-SC-Derived Exosomes

La aplicación de exosoma es una herramienta emergente para el desarrollo de fármacos y la medicina regenerativa. Establecemos un protocolo de aislamiento exosoma con alta pureza para aislar exosomas de nuevas células madre identificadas llamadas CB-SC para estudios mecánicos. También coculuramos exosomas derivados de CB-SC con monocitos humanos, lo que lleva a su diferenciación en macrófagos fenotípicamente distintos.

Diferenciación de monocitos en macrófagos fenotípicamente distintos después del tratamiento con células madre de sangre de cordón humano (CB-SC)-Exosomas derivados

Stem Cell Educator (SCE) therapy is a novel clinical approach for the treatment of type 1 diabetes and other autoimmune diseases. SCE therapy circulates ...

La terapia de educador de células madre fue desarrollada para tratar la diabetes tipo I y la otra enfermedad autoinmune. Este método fue desarrollado para explorar el mecanismo de molécula subyacente a la moderación inmune de la terapia de educador de células madre a través de EXOsomas liberados CB-SC. Este protocolo proporciona orientación sobre cómo purificar exosomas de cultivos de células madre de sangre de cordón umbilical humano y determinar su modulación inmune de monocitos.Demostrando el procedimiento estará Wei Hu, un estudiante de doctorado, de mi laboratorio. Para empezar, centrifugar el medio condicionado derivado de CB-SC tres veces como se describe en el manuscrito de texto, recogiendo el sobrenadante en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros después de cada centrifugación. Después de la tercera centrifugación, filtre el sobrenadante obtenido con un filtro de microlitro de 0,22 microlitros y transfiera 15 mililitros de medios a cada unidad de filtro centrífugo de 10 kilodalton.Centrífugas a 4.000 x g durante 30 minutos para aislar los medios exosoma concentrados. Transfiera los exosomas concentrados a un tubo de ultracentrífuga. Luego pele los exosomas a 100.000 x g durante 80 minutos a cuatro grados centígrados.A continuación, deseche el sobrenadante y resusppend los exosomas peletados en 10 mililitros de PBS. Realizar una ultracentrifugación final para recoger el pellet de exomo y resuspend en 200 microlitros de PBS. Añadir 30 millones de PBMC humanos a un tubo de 15 mililitros y centrífuga a 300 x g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.Resuspender las células en 300 microlitros de PBS frío y añadir 60 microlitros de microperlas CD14. Mezclar bien e incubar las células sobre hielo durante 15 minutos. Añadir seis mililitros más de PBS frío y centrífuga a 300 x g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.A continuación, resuspender las células peletizadoras en 500 microlitros de búfer de funcionamiento en frío. Coloque la columna de separación en el separador de imán y lávela tres veces con dos mililitros de búfer de funcionamiento en frío. Transfiera las celdas resuspendidas a la columna de separación y déjelas pasar.Una vez más, lave la columna tres veces con dos mililitros de tampón de funcionamiento por lavado. A continuación, levante la columna del separador de imán y colóquela sobre un tubo centrífuga de 15 mililitros sobre hielo. Eluda las células positivas CD14 con dos mililitros de tampón de funcionamiento en frío y centrifugado a 300 x g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius para peletizar las células.Resuspender el pellet en dos mililitros de medio sérico definido por productos químicos fríos y transferir 50 microlitros de él en un tubo de 1,5 mililitros. Mancha las células obtenidas con 10 microlitros de anticuerpos monoclonales CD14 conjugados con naranja Krome durante 20 minutos. Añadir un mililitro de PBS y centrífuga a 300 x g durante 10 minutos para peletizar las células.Resuspender el pellet celular en 200 microlitros de PBS y transferirlo a un tubo de cinco mililitros. Determinar la pureza de los monocitos CD14+ por citometría de flujo. Semilla de un millón de los monocitos purificados obtenidos en un cultivo de tejido tratado placa de seis pozos e incubar durante dos horas a 37 grados Celsius bajo 5% dióxido de carbono.Después de la incubación desechar el sobrenadante y añadir suavemente dos mililitros de medio de cultivo libre de suero precalentado de 37 grados, luego añadir 80 microgramos de los exosomas derivados de CB-SC al cultivo de monocitos en la placa de seis pocillos con un volumen total de dos mililitros. Incubar la placa a 37 grados centígrados bajo un 5% de dióxido de carbono durante tres a cuatro días. A continuación, imagine la morfología celular usando un microscopio invertido con aumento de 200X.Agregue un mililitro de búfer de disociación celular basado en PBS para separar las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo y cosechar las células restantes con un rascador de celdas. Recoger las células centrifugando a 1, 690 x g durante cinco minutos y resuspend sus alrededores en 200 microlitros de PBS. Agregue cinco microlitros de bloqueador FC para bloquear la unión no específica y, a continuación, agregue los anticuerpos.Incubar las células a temperatura ambiente durante 30 minutos. Añadir un mililitro de PBS a las células incubadas y centrifugarlas a 300 x g durante 10 minutos. Resuspender el pellet en 200 microlitros de PBS y añadir cinco microlitros de yoduro propdium por muestra.Transfiera las células a un nuevo tubo de flujo de cinco mililitros y realice la citometría de flujo para evaluar los niveles de expresión CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 y CD209. El fenotipo y la pureza de los CB-SC fueron examinados por citometría de flujo con marcadores asociados a CB-SC. El análisis mostró altos niveles de expresión CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 y galectina 9, pero no se observó ninguna expresión de CD34.El análisis de citometría de flujo también confirma la expresión de marcadores específicos de exomas, CD9, CD 81 y CD63 en exosomas derivados de CB-SC. La morfología del tamaño de los exosomas se caracterizó por TEM y la distribución del tamaño fue determinada por DLS. La mancha occidental prueba además la expresión del marcador asociado al exoma Alix sin expresión del marcador asociado a ER, calnexina.Se observó la interacción directa de CB-SC-Exo con PBMC con diofilo mediante microscopía de fluorescencia. Para definir mejor qué población de células interactuó con el dial con la etiqueta CB-SC-Exo, se ensuñaron diferentes compartimentos celulares con marcadores específicos de la célula, como CD3 para células T, CD11C para células dendríticas mieloides, CD14 para monocitos, CD19 para células B y CD56 para células NK. Los monocitos fueron blanco principalmente de los exosomas derivados de CB-SC, ya que mostraban intensidades de fluorescencia media más altas que las de otras células inmunitarias.Los monocitos tratados con exosomas se diferencian con éxito en morfologías similares a los de un husillo. Hubo una regulación ascendente en el nivel de los marcadores asociados a M2, como CD163, CD206 y CD209 después del tratamiento con exosomas derivados de CB-SC. La comparación fenotípica entre los macrófagos M2 convencionales y los macrófagos M2 inducidos por exomas CB-SC no mostró diferencias significativas.El paso clave en este protocolo es agregar exosomas derivados de CB-SC al monocitos del cultivo en placa de seis pozos e incubarlo durante tres a cuatro días, lo que se necesitó para la diferenciación de la célula a otros macrófagos de tipo 2 con morfología similar a un husillo. A continuación, vamos a explorar los componentes de moléculas dentro de los exosomas derivados de CB-SC que contribuyeron a la inducción de la diferenciación de monocitos en macrófagos tipo 2.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Derived Exosomes

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

La expansión de los linfocitos T citotóxicos sangre del cordón umbilical que Citomegalovirus Target, Virus de Epstein-Barr, adenovirus y

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Investigación

Inmunología e Infección

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Aplicación clínica de<em&gt; La Bella Durmiente</em&gt; Artificial y células presentadoras de antígenos para modificar genéticamente las células T de la sangre del cordón umbilical y periférica

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Aislamiento de los precursores de células B subconjuntos de Sangre del Cordón Umbilical

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Aislamiento de monocitos humanos por doble centrifugación en gradiente y su diferenciación a macrófagos en Bolsos Cultivo Celular recubiertos de teflón

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

La cultura de los macrófagos derivados de monocitos-macrófagos factor estimulante de colonia humana diferenciada

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextrano mejora la eficiencia de transducción lentivirales de las células NK primaria murinas y humanas

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro humano

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Diferenciación de megacariocitos y plaquetas formación de humanos CD34 derivadas de sangre de la cuerda+ de las células

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

Diferenciación inducida de células similares a células M en monocapas de enteroide ileal derivadas de células madre humanas

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Aislamiento, transfección y cultivo de monocitos humanos primarios

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...