Name: differentiation of monocytes into phenotypically distinct macrophages after treatment with human cord blood stem cell (cb-sc)-derived exosomes
Uploaded: 2020-11-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell CB-SC-Derived Exosomes at JoVE.com

Vi är tacksamma mot Mr Poddar och Mr Ludwig för generöst stöd via Hackensack UMC Foundation. Vi uppskattar Laura Zhao för engelsk redigering.

Protokollet följer riktlinjerna från institutionella mänskliga forskningsetiska kommitté vid Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health. Mänskliga buffy coat blod enheter köptes från New York Blood Center (New York, NY). Mänskliga navelsträngsblod enheter samlades in från friska givare och köptes från Cryo-Cell International blodbank (Oldsmar, FL). Både New York Blood Center och Cryo-Cell har fått alla ackrediteringar för blodsamlingar och distributioner, med IRB-godkännande och under...

<ol>
	<li>Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+educator+therapy+and+induction+of+immune+balance.">Stem cell educator therapy and induction of immune balance.</a> Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+type+1+diabetes+via+islet+beta+cell+regeneration+following+immune+modulation+by+cord+blood-derived+multipotent+stem+cells.">Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells.</a> BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+insulin+resistance+in+type+2+diabetes+via+immune+modulation+of+cord+blood-derived+multipotent+stem+cells+(CB-SCs)+in+stem+cell+educator+therapy:+phase+I/II+clinical+trial.">Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial.</a> BMC Medicine. 11, 160 (2013).</li><li>Delgado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+autoimmune+T-cell+memory+by+stem+cell+educator+therapy:+phase+1/2+clinical+trial.">Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial.</a> EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+regrowth+in+alopecia+areata+patients+following+Stem+Cell+Educator+therapy+BMC.">Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC.</a> Medicine. 13 (1), 87 (2015).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer:+small+vesicular+transporters+for+cancer+progression+and+metastasis,+biomarkers+in+cancer+therapeutics.">Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics.</a> PeerJ. 6, 4763 (2018).</li><li>Adamiak, M., Sahoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+myocardial+repair:+advances+and+challenges+in+the+development+of+next-generation+therapeutics.">Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics.</a> Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).</li><li>Akyurekli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+preclinical+studies+on+the+therapeutic+potential+of+mesenchymal+stromal+cell-derived+microvesicles.">A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles.</a> Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).</li><li>Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Released+exosomes+contribute+to+the+immune+modulation+of+cord+blood-derived+stem+cells+(CB-SC).">Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC).</a> Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).</li><li>Jacobson, G., K&#229;rsn&#228;s, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+parameters+in+semi-dry+electrophoretic+transfer.">Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer.</a> Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).</li><li>Dykstra, M. J., Reuss, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , (2011).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+vesicles:+general+methodologies+and+latest+trends.">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization:+different+gene+signatures+in+M1(LPS+)+vs.+classically+and+M2(LPS-)+vs.+alternatively+activated+macrophages.">Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).</li></ol>

Tillämpning av exosomer är ett framväxande fält för klinisk diagnos, läkemedelsutveckling och regenerativ medicin. Här presenterar vi ett utförligt protokoll angående beredning av CB-SC-härledda exosomer och den funktionella studie av exosomer på differentiering av mänskliga monocyter. Det nuvarande protokollet visat att funktionella CB-SC-härledda exosomer är isolerade genom sekventiell centrifugering och ultracentrifugeringen med hög renhet och uppvisar immunmoduleringen på monocyter.
<p class="jove...

Stamceller från navelsträngsblod (CB-SC) är unika typer av stamceller som identifieras från navelsträngsblod och särskiljs från andra kända typer av stamceller såsom mesenkymala stamceller (MSC) och hematopoitiska stamceller (HSC)1. Baserat på deras unika egenskaper immunmodulering och deras förmåga att tätt hålla sig till ytan av Petri rätter, utvecklade vi en ny teknik som utsetts till Stem Cell Educator (SCE) terapi i kliniska prövningar2,3. Under SCE terapi, en patients perifert blod mononuclear celler (PBMC) samlas in och cirkuleras genom en cell separator och co-odlade med anhängare CB-SC in vitro. Dessa "utbildade" celler (CB-SC-behandlade PBMC) sedan återförs till patientens cirkulation i en sluten loop system. Kliniska prövningar har redan visat den kliniska säkerheten och effekten av SCE-behandling för behandling av autoimmuna sjukdomar inklusive typ 1-diabetes (T1D)2,4 och alopecia areata (AA)5.
Exosomer är en familj av nanopartiklar med diametrar som sträcker sig 30\u2012150 nm och finns i alla biofluid och cellkultur media6. Exosomer är berikade med många bioaktiva molekyler inklusive lipider, mRNAs, proteiner och microRNAs (miRNA), och spelar en viktig roll i cell-till-cell kommunikation. På senare tid har exosomer blivit mer attraktiva för forskare och läkemedelsföretag på grund av deras terapeutiska potentialer ikliniker 7,8,9. Nyligen visade våra mekanistiska studier att CB-SC-släppt exosomer bidra till immun modulering av SCE terapi10.
Här beskriver vi protokollet för att utforska mekanismen för SCE terapi inriktning monocyter av CB-SC-släppt exosomer. Först var CB-SC-frisläppt exosomer isolerade från CB-SC-härledda betingade medier med hjälp av metoder ultracentrifugation och valideras av flödescytometri, västra blot (WB) och dynamiska ljusspridning (DLS). Andra, CB-SC-härledda exosomer var märkta med en grön fluorescerande lipophilic färgämne: Dio. För det tredje var de co-odlade med PBMC att undersöka de positiva procentsatserna av Dio-märkt CB-SC-härledda exosomer på de olika subpopulationer av PBMC genom flöde cytometri. Detta protokoll ger vägledning för att studera verkan av exosomer som ligger bakom immunmoduleringen av stamceller.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>Non-tissue culture 
			plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio)</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>D4292-20MG</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 Mesh Grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td>Tissue culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td>Tissue culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Alix</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>634501</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2268110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Calnexin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>699401</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2728519</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561356</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_10611859</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B36294</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2728099</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD163 antibody, PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>556018</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_396296</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD19 antibody, PC5</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2643U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_131160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD206 antibody, FITC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>551135</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_394065</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>564127</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2738610</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD270 antibody, PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>318806</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2203703</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300431</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_1595437</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD34 antibody, APC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2427U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD4 antibody, APC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555349</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_398593</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM3548U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_1575969</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD56 antibody, PE</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM2073U</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_131195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD63 antibody,PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561925</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_10896821</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94686</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD80 antibody, APC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30642</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD81 antibody, FITC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561956</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_394049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30646</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD9 antibody, FITC</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>MA5-16860</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2538339</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>348919</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2716134</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>50-5841-82</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_11218882</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoScientic</td>
			<td>53-9811-82</td>
			<td>store at 4 &#176;C, RRID: AB_2574479</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A1933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffy coat</td>
			<td>New York Blood Center</td>
			<td></td>
			<td>40-60 ml/unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable semi-micro cuvette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97000590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>131510014</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Chanber cell counting slides</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Human CD63 Detection reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10606D</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS density grandient media</td>
			<td>GE Health</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor(25&#176;)</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75003698</td>
			<td>Maxium 24,700 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>3 lasers 
			10 Color Max</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cord blood</td>
			<td>Cryo-Cell International</td>
			<td></td>
			<td>40-100 ml/unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fc Block</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>564220</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentriguge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker MP4</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>S-3500-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>56-66211E</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti2 microscope</td>
			<td>Nikon instruments Inc</td>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>NIS-Elements software version 5.11.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hochest 33342</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>62249</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revert microsopy</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12563518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor 41 Ti</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td>Maxium 41,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>75003655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-20 cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-2100 PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X&#39;VIVO 15 Serum-free medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BEBP04-744Q</td>
			<td>1000 ml Culture medium, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of monocytes into phenotypically distinct macrophages after treatment with human cord blood stem cell (cb-sc)-derived exosomes

Stem Cell Educator (SCE) terapi är en ny klinisk metod för behandling av typ 1 diabetes och andra autoimmuna sjukdomar. SCE terapi cirkulerar den isolerade patientens blod mononukleära celler (t.ex., lymfocyter och monocyter) genom en aferes maskin, co-kulturer patientens blod mononukleära celler med anhängare navelsträng blod-derived stamceller (CB-SC) i SCE-enheten, och sedan returnerar dessa "utbildade" immunceller till patientens blod. Exosomer är nano-sized extracellulära vesiklar mellan 30\u2012150 nm existerande i alla biofluid och cell kultur media. För att ytterligare utforska molekylära mekanismer som ligger bakom SCE terapi och bestämma åtgärder av exosomer som frigörs från CB-SC, undersöker vi vilka celler som fagocytize dessa exosomer under behandlingen med CB-SC. Genom co-odling Dio-märkt CB-SC-härledda exosomer med humant perifert blod mononukleära celler (PBMC), fann vi att CB-SC-härledda exosomer togs främst upp av mänskliga CD14-positiva monocyter, vilket leder till differentiering av monocyter i typ 2 makrofager (M2), med spindel-liknande morfologi och uttryck för M2-associerade ytan molekylära markörer. Här presenterar vi ett protokoll för isolering och karakterisering av CB-SC-härledda exosomer och protokollet för samkultur av CB-SC-härledda exosomer med mänskliga monocyter och övervakningen av M2 differentiering.

Inledningsvis var fenotyp och renhet av CB-SC undersöktes av flöde cytometri med CB-SC-associerade markörer såsom leukocyte gemensamma antigen CD45, ES cell-specifika transkriptionsfaktorer OCT3/4 och SOX2. CB-SC-visning av höga halter av CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 och galectin 9-uttryck, men inget uttryck för CD34 (Bild 1A). Flödescytometrianalys bekräftade uttrycket av exosome-specifika markörer inklusive CD9, CD81, och CD63 var på CB-SC-härledda exosomer (Fi...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell CB-SC-Derived Exosomes at JoVE.com

Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell CB-SC-Derived Exosomes

Exosome ansökan är ett framväxande verktyg för läkemedelsutveckling och regenerativ medicin. Vi upprättar en exosome isolering protokoll med hög renhet att isolera exosomer från nya identifierade stamceller som kallas CB-SC för mekanistiska studier. Vi även coculture CB-SC-härledda exosomer med mänskliga monocyter, vilket leder till deras differentiering till fenotypiskt distinkta makrofager.

Differentiering av monocyter till fenotypiskt distinkta makrofager efter behandling med humant navelsträngsblod stem cell (CB-SC)-Härledda exosomer

Stem Cell Educator (SCE) therapy is a novel clinical approach for the treatment of type 1 diabetes and other autoimmune diseases. SCE therapy circulates ...

Stem Cell Educator terapin utvecklades för att behandla typ I-diabetes och den andra autoimmuna sjukdomen. Denna metod har utvecklats för att utforska molekylen mekanismen bakom immun moderation av Stem Cell Educator terapi genom CB-SC släppt exosomer. Detta protokoll ger vägledning om hur man rena exosomer från en människa navelsträngsblod stamceller kulturer och bestämma deras immun modulering av monocyter.Demonstrera förfarandet kommer att Wei Hu, en doktorand, från mitt labb. Till att börja med centrifuger cb-SC-härledda betingade medium tre gånger som beskrivs i texten manuskriptet, samla supernatanten i en ny 50 milliliter koniska röret efter varje centrifugering. Efter den tredje centrifugering, filtrera erhållna supernatant med en 0,22 microliter filter och överföra 15 milliliter media till varje 10 kilodalton centrifugalfilter enhet.Centrifuger vid 4, 000 x g i 30 minuter för att isolera det koncentrerade exosomer media. Överför de koncentrerade exosomerna till ett ultracentrifugrör. Pellet sedan exosomerna vid 100, 000 x g i 80 minuter vid fyra grader Celsius.Kassera sedan supernatanten och resuspend pelleted exosomer i 10 milliliter PBS. Utför en sista ultracentrifugering för att samla exome pelleten och resuspend det i 200 mikroliter av PBS. Lägg till 30 miljoner mänskliga PBMCs till ett 15 milliliterrör och centrifug vid 300 x g i 10 minuter vid fyra grader Celsius.Resuspend cellerna i 300 mikroliter av kalla PBS och tillsätt 60 mikroliter av CD14 mikropärlor. Blanda väl och inkubera cellerna på is i 15 minuter. Tillsätt ytterligare sex milliliter kall PBS och centrifug vid 300 x g i 10 minuter vid fyra grader Celsius.Sedan resuspend de pelleterade cellerna i 500 mikroliter av kall rinnande buffert. Placera separationskolumnen i magnetavskiljaren och tvätta den tre gånger med två milliliter kallrinspringsbuffert. Överför de återanvända cellerna i separationskolumnen och låt dem passera.Återigen, tvätta kolonnen tre gånger med två milliliter körbuffert per tvätt. Lyft sedan kolonnen från magnetavskiljaren och placera den över ett centrifugrör på 15 milliliter på is. Elute de CD14 positiva celler med två milliliter kall kör buffert och centrifugeras vid 300 x g i 10 minuter vid fyra grader Celsius att pellet cellerna.Resuspend pelleten i två milliliter av kallt kemiskt definierat serum medium och överföra 50 mikroliter av den i en 1,5 milliliter rör. Stain de erhållna cellerna med 10 mikroliter av Krome Orange-konjugerat anti-mänskliga CD14 monoklonala antikroppar i 20 minuter. Tillsätt en milliliter PBS och centrifug vid 300 x g i 10 minuter för att pelleta cellerna.Resuspend cell pelleten i 200 mikroliter av PBS och överföra den till en fem milliliter rör. Bestäm renheten hos CD14+monocyter genom flödescytometri. Frö en miljon av de erhållna renade monocyterna i en vävnadskultur behandlad sex-brunnsplatta och inkubera i två timmar vid 37 grader Celsius under 5%koldioxid.Efter inkubationen kassera supernatanten och tillsätt försiktigt två milliliter av 37 graders förvättnad kemiskt definierat serumfritt odlingsmedium, tillsätt sedan 80 mikrogram av de CB-SC-härledda exosomerna till monocytekulturen i sex-brunnsplattan med en total volym på två milliliter. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius under 5%koldioxid i tre till fyra dagar. Sedan bild cellen morfologi med hjälp av en inverterad mikroskop vid 200X förstoring.Tillsätt en milliliter PBS-baserad cellsorsociationsbuffert för att lossa cellerna genom att pipettera upp och ner och skörda de återstående cellerna med en cellskrapa. Samla cellerna genom centrifugering vid 1, 690 x g i fem minuter och återanvänd dem i 200 mikroliter PBS. Lägg till fem mikroliter av FC-blockerare för att blockera den icke-specifika bindningen och lägg sedan till antikropparna.Inkubera cellerna i rumstemperatur i 30 minuter. Tillsätt en milliliter PBS till de inkuberade cellerna och centrifug dem vid 300 x g i 10 minuter. Resuspend pelleten i 200 mikroliter av PBS och tillsätt fem mikroliter propidium iodid per prov.Överför cellerna till ett nytt fem milliliter flödesrör och utför flödescytometri för att utvärdera nivåerna av CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 och CD209-uttryck. Fenotyp och renhet av CB-SCs undersöktes av flöde cytometry med CB-SC associerade markörer. Analysen visade höga halter av CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 och galectin 9 uttryck men inget uttryck för CD34 observerades.Flödescytometrianalys bekräftar också uttrycket av exome specifika markörer, CD9, CD 81 och CD63 på CB-SC-härledda exosomer. Storleken morfologi av exosomes präglades av TEM och storleken fördelningen fastställdes av DLS. Western blot bevisar ytterligare uttrycket av exome associerade markör Alix utan uttryck för ER associerade markör, calnexin.Den direkta interaktionen mellan Dio-märkt CB-SC-Exo med PBMC observerades med hjälp av fluorescensmikroskopi. För att bättre definiera vilka cellpopulation interagerade med ratten märkt CB-SC-Exo, var olika cell fack gated med cell specifika markörer, såsom CD3 för T-celler, CD11C för myeloisk dendritiska celler, CD14 för monocyter, CD19 för B-celler och CD56 för NK celler. Monocyter var främst riktade av CB-SC-härledda exosomer som de uppvisade högre median fluorescens intensiteter än de andra immunceller.Exosomen behandlade monocyter framgångsrikt differentieras till spindel-liknande morfologier. det fanns en uppreglering i nivån av M2 associerade markörer, såsom CD163, CD206 och CD209 efter behandlingen med CB-SC-härledda exosomer. Fenotypisk jämförelse mellan konventionella M2 makrofager och cb-SC exome-inducerad M2 makrofager visade inga signifikanta skillnader.Det viktigaste steget i detta protokoll är att lägga till CB-SC-härledda exosomer till monocyter av kultur i sex-väl platta och inkubera den i tre till fyra dagar, som behövs för att cellens differentiering till andra typ 2 makrofager med spindel-liknande morfologi. Därefter kommer vi att utforska molekylen komponenter insidan av CB-SC-härledda exosomer som bidragit till induktion av differentiering av monocyt i typ 2 makrofager.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Derived Exosomes

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Expanderande Cytotoxiska T-lymfocyter från navelsträngsblod att Target cytomegalovirus, Epstein-Barr-virus, och adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Klinisk tillämpning av<em&gt; Törnrosa</em&gt; Konstgjord och antigenpresenterande celler för att genetiskt modifiera T celler från perifert och navelsträngsblod

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolering av prekursor B-cell-underuppsättningar från navelsträngsblod

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Isolering av humana monocyter från Double gradientcentrifugering och deras differentiering till makrofager i teflonbelagda Cell Culture Väskor

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Kultur av makrofag kolonistimulerande faktor Differentierad Human Monocyte-härledda makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran effektiviserar Lentiviral transduktion murina och mänskliga primära NK-celler

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analys av Lymphocyte Extravasation Med användning av ett<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det mänskliga blod-hjärnbarriären

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyt differentiering och trombocytantal Formation från mänskliga sladd blod-derived CD34+ celler

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

Inducerad differentiering av M-Cellliknande celler i humana stamcells-härledda ileal Enteroid Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Isolering, transfektion och kultur av primära mänskliga monocyter

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...