Name: super-resolution live cell imaging of subcellular structures
Uploaded: 2021-01-13T13:00:00
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作者感谢约翰霍普金斯大学的集成成像核心设施提供显微镜和数据分析软件。我们感谢 J. 斯内德克和 Q. E. Yu 的校对和建议，以及 X .C实验室成员的有益讨论和建议。由NIGMS/NIH R35GM127075、霍华德·休斯医学研究所、大卫和露西尔·帕卡德基金会以及约翰·霍普金斯大学启动基金（X.C.）支持。

1. 准备活细胞成像鸡尾酒（活细胞介质）
<ol><li>补充施耐德的 果蝇 介质与15%的胎儿牛血清（FBS）和0.6倍青霉素/链霉素。将 pH 值调整到大约 7.0。</li>
	<li>在使用介质之前，将胰岛素添加到最终浓度为 200 μg/mL 的浓度中。 注：这种介质对于在延时成像10、14期间保持正常细胞分裂和果蝇睾睾司发育至关重要。</li>
</ol>2. 准...

<ol>
	<li>Breedijk, R. M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live-cell+super-resolution+technique+demonstrated+by+imaging+germinosomes+in+wild-type+bacterial+spores.">A live-cell super-resolution technique demonstrated by imaging germinosomes in wild-type bacterial spores.</a> Scientific Reports. 10 (1), 5312 (2020).</li><li>Maddox, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+mitotic+spindle.">Imaging the mitotic spindle.</a> Methods in Enzymology. 505, 81-103 (2012).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM):+A+method+for+super+resolution+fluorescence+imaging.">Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): A method for super resolution fluorescence imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (6), 075143 (2013).</li><li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics.">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nature Methods. 5 (5), 417-423 (2008).</li><li>Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+super-resolved+microscopy.">STED super-resolved microscopy.</a> Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).</li><li>Huff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Airyscan+detector+from+ZEISS:+confocal+imaging+with+improved+signal-to-noise+ratio+and+super-resolution.">The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution.</a> Nature Methods. 12 (12), (2015).</li><li>Huff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+2D+superresolution+mode+for+ZEISS+Airyscan.">The new 2D superresolution mode for ZEISS Airyscan.</a> Nature Methods. 14 (12), 1223 (2017).</li><li>Korobchevskaya, K., Lagerholm, B., Colin-York, H., Fritzsche, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+potential+of+Airyscan+microscopy+for+live+cell+imaging.">Exploring the potential of Airyscan microscopy for live cell imaging.</a> Photonics. 4 (4), 41 (2017).</li><li>Ranjan, R., Snedeker, J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+centromeres+differentially+coordinate+with+mitotic+machinery+to+ensure+biased+sister+chromatid+segregation+in+germline+stem+cells.">Asymmetric centromeres differentially coordinate with mitotic machinery to ensure biased sister chromatid segregation in germline stem cells.</a> Cell Stem Cell. 25 (5), 666-681 (2019).</li><li>Kahney, E. W., Ranjan, R., Gleason, R. J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+from+asymmetry+or+asymmetry+from+symmetry.">Symmetry from asymmetry or asymmetry from symmetry.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 82, 305-318 (2017).</li><li>Wooten, M., Ranjan, R., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+histone+inheritance+in+asymmetrically+dividing+stem+cells.">Asymmetric histone inheritance in asymmetrically dividing stem cells.</a> Trends in Genetics. 36 (1), 30-43 (2020).</li><li>Wooten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+histone+inheritance+via+strand-specific+incorporation+and+biased+replication+fork+movement.">Asymmetric histone inheritance via strand-specific incorporation and biased replication fork movement.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (8), 732-743 (2019).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Sivaguru, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+performance+of+airyscan+and+structured+illumination+superresolution+microscopy+in+the+study+of+the+surface+texture+and+3D+shape+of+pollen.">Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen.</a> Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).</li></ol>

超分辨率显微镜方法提供高达10秒的纳米4，5，6的空间分辨率。STORM 和 PALM 显微镜方法允许分辨率高达 20 到 50 nm（XY 分辨率），而 STED 显微镜的分辨率为 20 到 100 nm（XY 分辨率）。SIM显微镜的空间分辨率限制在100至130纳米15。然而，由于其高光子密度和较长的采集时间，使用这些技术进行活细胞成像极具挑战性。
<p c...

可视化活细胞中的亚细胞结构和蛋白质动力学，其分辨率超过光的衍射极限，通常具有非常具有挑战性的1-3。虽然已经开发了多种超分辨率技术，如随机光学-光学重建-显微镜（STORM）、光激活-本地化-显微镜（PALM）和刺激-排放-消耗（STED）4、5、6显微镜，但标本制备中的并发症以及保持生存能力和活性（外视）的需要，限制了传统超分辨率显微镜对成像活体样品的使用。传统的共聚焦显微镜不能达到空间分辨率超过+230纳米XY分辨率，往往不足以观察复杂的细胞下部结构5，6。然而，最近在共聚焦显微镜，Airyscan超分辨率成像的发展，能够达到约140纳米（XY分辨率）7，8，并具有相对简单的样品制备，与实时成像兼容。由于这种成像检测系统需要较长的采集时间，其高空间分辨率确实要以时间分辨率9为代价。因此，需要一种方法来确保活细胞成像以高空间分辨率扩展。
在这里，我们开发了一种方法，以最佳分辨率观察完整组织中的活细胞，以破译具有详细空间信息的亚细胞结构。此方法的设计是这样的，以便样品可以稳定地安装很长一段时间 （+ 10 小时）， 而无需移动或退化。该技术中使用的活细胞介质可以在超分辨率显微镜下支持细胞功能，避免光出血长达 10 小时。最后，此协议将激光在长时间内持续照明（如缺氧、湿度和温度变化以及营养耗尽）造成的大多数压力降至最低。
利用这个协议来成像果蝇雄性生殖系干细胞（GSC），我们能够观察微管的不对称活性如何允许与表观遗传上不同的姐妹染色体10，11，12，13的优先相互作用。这些类型的细胞事件具有高度动态性，很难使用其他超分辨率成像方法（如风暴、PALM 或 STED）在活细胞中可视化。我们预计，这种方法将变得非常有用的细胞生物学家，因为他们的目标是了解活细胞的动态亚细胞结构，生活在组织。有许多领域可以应用这种方法，如研究蛋白质的动态：了解细胞的运动;和血统追踪和细胞分化过程，以及其他可能的应用。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator CS6 (figure making software)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane</td>
			<td>Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane</td>
			<td>Cat No. 08-67121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat. no. 26140079</td>
			<td>15% (V/V)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (analysis software)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image fluorescence intensity quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom cell culture dishes (FluroDish)</td>
			<td>World Precision Instrument, Inc.</td>
			<td>FD35PDL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris (image reconstruction software)</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>3D image reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imerssion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Immersol 518F/30 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. No. 15550</td>
			<td>200 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat No. - 15140-122</td>
			<td>0.6x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider Drosophila media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat No. - 11720-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue paper</td>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Wet to form humid chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN (imaging software)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution live cell imaging of subcellular structures

长期以来，在成像的空间和时间分辨率之间一直存在关键的权衡。传统上，超过光衍射极限的成像仅限于在标有强荧光信号的组织外的固定样品或活细胞上使用。当前的超分辨率活细胞成像技术需要使用特殊的荧光探头、高照明、多次图像采集和收购后处理，或者通常这些过程的组合。这些先决条件显著限制了该技术可以应用于的生物样本和上下文。
在这里，我们描述了一种在现场执行超分辨率（+140 nm XY 分辨率）延时荧光活细胞成像的方法。该技术还与低荧光强度相容，例如，EGFP 或 mCherry 内生标记在低表达基因。作为原理证明，我们使用这种方法可视化 德罗索菲拉 睾肠中的多个子细胞结构。在组织准备过程中，细胞结构和组织形态都保持在解剖睾膜内。在这里，我们使用这项技术来成像微管动力学，微管和核膜之间的相互作用，以及微管与中心体的附着。
该技术要求在样品准备、样品安装和标本固定方面进行特殊程序。此外，标本必须在解剖后保持数小时，同时不影响细胞功能和活动。虽然我们已经优化了活超分辨率成像的条件，特别是在 果蝇 雄性生殖干细胞（GSC）和祖细胞在解剖睾酮组织，这项技术广泛适用于各种不同的细胞类型。能够在不牺牲空间或时间分辨率的情况下观察细胞的生理条件，对于寻求解决细胞生物学关键问题的研究人员来说，将是一个宝贵的工具。

超过果蝇组织衍射极限的活细胞成像，特别是GSC，为研究细胞周期进展背景下亚细胞事件的动态提供了机会。最近，利用这一协议的研究表明，在GSC10中，母亲中心体与女儿中心体的微管活动在时间上不对称。母亲中心体在子宫切入前约4小时发出微管，而女儿中心只在子宫增多时发出微管。来自母中心体的高度活跃的微管与核膜相互作用，并诱导两极分化的核包络分解（N...

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Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

这里介绍了一个在完整组织中进行超分辨率活细胞成像的协议。我们已经标准化了在其原生组织环境中成像高度敏感的成人干细胞群的条件。该技术涉及平衡时间和空间分辨率，以便直接观察活组织中的生物现象。

亚细胞结构的超分辨率活细胞成像

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

我们的协议使用定期荧光探针和简单的标本制备技术，在生理条件下维持成像细胞，以研究高动态细胞过程和详细的亚细胞结构。这项技术使我们能够在超分辨率和生理条件下长期研究细胞过程，而不会牺牲特殊或临时分辨率。首先将12至14千达尔顿分子重量的截断透析膜切成小块，用100微升活细胞介质浸泡约5分钟。当膜浸泡时，将50毫升管的外环切成小块，用70%乙醇对碎片进行消毒。对于睾丸解剖和安装，将十只两到三天的麻醉雄性苍蝇转移到解剖显微镜下的解剖盘中，并使用细钳切除睾丸。收集完所有睾片后，在活细胞介质中清洗睾试两次，并使用移液器尖端将 100 到 150 微升活细胞介质扩散到准备好的玻璃底盘中。使用细钳将苍蝇睾片转移到盘的中心，并去除所有，但约10微升的介质。快速将预湿膜放在睾片上，并将两到三个小塑料重量放在膜上。立即加入100至150微升的新鲜活细胞介质，并将环放回盘子的高架侧。将盖子滑回环上，将一块纸巾旋转到水中，然后将纸放在盖子上。然后，用盖子盖住盘子，将盘子固定在超分辨率显微镜的舞台上。对于生殖系干细胞成像，打开成像软件并打开传输的光。使用 63X 目标聚焦睾片组织并打开激光。点击"活"找到老年干细胞。调整对焦并单击帧大小"，将帧大小设置为 512 乘 512 和 1024 到 1024 像素之间，并平均"将帧平均设置为一到两个。单击"主增益"将电子乘法增益设置为小于 800，将激光功率设置为 1% 到 2% 放大到感兴趣的区域或单元格，以减少图像采集时间并减少照片漂白，并在单击"开始实验"之前确认图像已优化配置"，以启动延时图像捕获。如果 Airyscan 采集没有以最佳方式配置"显示"，请单击帧大小、Z 堆栈和扫描区域"部分中的"最佳"，并根据标本的实验设计和类型优化 Z 切片的时间间隔、Z 切片数量和延时成像的持续时间。成像后，选择处理、批次和 Airyscan 处理，并选择要处理的图像。然后单击"运行过程"以获取超分辨率图像。使用旋转的圆盘共聚焦显微镜在早期生殖细胞中表达α tubulin GFP 的果蝇的活细胞成像，使两个中心体的 GFP 信号的不对称强度可视化，作为母体中心体的较亮信号和在女儿中心体的相对较弱的信号。亮度的差异可能反映在微管核的时间不对称上，但微管的详细形态和数量无法通过旋转盘共聚焦显微镜解决。相比之下，活细胞超分辨率成像允许显化和量化微管形态和数字。这种改进的分辨率还揭示了不对称微管核化、拉长和与核膜相互作用增加的模式。活细胞成像还允许不对称核膜的可视化，但不允许直接进入核体的单个微管可视化。相比之下，这种活细胞超分辨率技术允许通过同时成像微管和核拉米纳来直接观察这些事件。在元相期间，使用旋转盘显微镜可以检测到两个姐妹中心为一个信号，但无法观察到微管中央附件。相比之下，超分辨率实时成像允许在早期前相中可视化微管中心附件。请务必在睾片上放置膜，以确保它们在成像过程中不会移动或漂浮，并优化显微镜设置以避免照片漂白和照片毒性。有许多方法可以应用，例如研究蛋白质动力学、线性应力或细胞防御和过程。

Research

JoVE Journal

Biology

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

超分辨率成像细菌科机械

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科研

生物学

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活体显微镜成像的亚细胞结构的活体小鼠表达荧光蛋白

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Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

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Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

在Cytokineticž圈的活细菌超分辨率成像使用快速三维结构照明显微镜（F3D-SIM卡）

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

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与VirusMapper超分辨率显微镜开源单粒子分析

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高速超分辨速度显微镜在活原纤毛中的应用

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...