Name: super-resolution live cell imaging of subcellular structures
Uploaded: 2021-01-13T13:00:00
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Les auteurs tiennent à remercier l’installation Integrated Imaging Core de l’Université Johns Hopkins pour ses microscopes et ses logiciels d’analyse de données. Nous remercions J. Snedeker et Q. E. Yu pour la relecture et les suggestions, et les membres du laboratoire X.C. pour leurs discussions et suggestions utiles. Soutenu par nigms/NIH R35GM127075, le Howard Hughes Medical Institute, la Fondation David et Lucile Packard et les fonds de démarrage de l’Université Johns Hopkins (X.C.).

1. Préparation d’un cocktail d’imagerie cellulaire en direct (médias cellulaires en direct)
<ol><li>Compléter le milieu de la drosophile de Schneider avec 15% de sérum fœtal bovin (FBS) et 0,6x pénicilline / streptomycine. Ajuster le pH à environ 7,0.</li>
	<li>Juste avant d’utiliser le milieu, ajouter l’insuline à une concentration finale de 200 μg/mL. REMARQUE: Ce milieu est essentiel pour maintenir la division cellulaire normale et le développement du testicule de drosophile pe...

<ol>
	<li>Breedijk, R. M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live-cell+super-resolution+technique+demonstrated+by+imaging+germinosomes+in+wild-type+bacterial+spores.">A live-cell super-resolution technique demonstrated by imaging germinosomes in wild-type bacterial spores.</a> Scientific Reports. 10 (1), 5312 (2020).</li><li>Maddox, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+mitotic+spindle.">Imaging the mitotic spindle.</a> Methods in Enzymology. 505, 81-103 (2012).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM):+A+method+for+super+resolution+fluorescence+imaging.">Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): A method for super resolution fluorescence imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (6), 075143 (2013).</li><li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics.">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nature Methods. 5 (5), 417-423 (2008).</li><li>Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+super-resolved+microscopy.">STED super-resolved microscopy.</a> Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).</li><li>Huff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Airyscan+detector+from+ZEISS:+confocal+imaging+with+improved+signal-to-noise+ratio+and+super-resolution.">The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution.</a> Nature Methods. 12 (12), (2015).</li><li>Huff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+2D+superresolution+mode+for+ZEISS+Airyscan.">The new 2D superresolution mode for ZEISS Airyscan.</a> Nature Methods. 14 (12), 1223 (2017).</li><li>Korobchevskaya, K., Lagerholm, B., Colin-York, H., Fritzsche, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+potential+of+Airyscan+microscopy+for+live+cell+imaging.">Exploring the potential of Airyscan microscopy for live cell imaging.</a> Photonics. 4 (4), 41 (2017).</li><li>Ranjan, R., Snedeker, J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+centromeres+differentially+coordinate+with+mitotic+machinery+to+ensure+biased+sister+chromatid+segregation+in+germline+stem+cells.">Asymmetric centromeres differentially coordinate with mitotic machinery to ensure biased sister chromatid segregation in germline stem cells.</a> Cell Stem Cell. 25 (5), 666-681 (2019).</li><li>Kahney, E. W., Ranjan, R., Gleason, R. J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+from+asymmetry+or+asymmetry+from+symmetry.">Symmetry from asymmetry or asymmetry from symmetry.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 82, 305-318 (2017).</li><li>Wooten, M., Ranjan, R., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+histone+inheritance+in+asymmetrically+dividing+stem+cells.">Asymmetric histone inheritance in asymmetrically dividing stem cells.</a> Trends in Genetics. 36 (1), 30-43 (2020).</li><li>Wooten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+histone+inheritance+via+strand-specific+incorporation+and+biased+replication+fork+movement.">Asymmetric histone inheritance via strand-specific incorporation and biased replication fork movement.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (8), 732-743 (2019).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Sivaguru, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+performance+of+airyscan+and+structured+illumination+superresolution+microscopy+in+the+study+of+the+surface+texture+and+3D+shape+of+pollen.">Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen.</a> Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).</li></ol>

Les méthodes de microscopie à super-résolution fournissent une résolution spatiale aussi élevée que 10s de nanomètres4,5,6. Les méthodes de microscopie STORM et PALM permettent une résolution allant jusqu’à 20 à 50 nm (résolution XY), tandis que la microscopie STED offre une résolution de 20 à 100 nm (résolution XY). La résolution spatiale de la microscopie SIM est limitée à 100 à 130 nm15. Cepend...

La visualisation des structures subcellulaires et de la dynamique des protéines dans les cellules vivantes avec une résolution supérieure à la limite de diffraction de la lumière est généralement très difficile1-3. Alors que plusieurs techniques de super-résolution telles que la microscopie stochastique-optique-reconstruction-microscopie (STORM), la photo-activité-localisation-microscopie (PALM) et la microscopie à émission stimulée (STED)4,5,6 ont été développées, les complications dans la préparation des échantillons ainsi que la nécessité de maintenir la viabilité et l’activité ex vivo, limitent l’utilisation de la microscopie à super-résolution conventionnelle pour l’imagerie d’échantillons vivants. La microscopie confocale conventionnelle ne peut pas atteindre une résolution spatiale au-delà de ~230 nm XY-résolution et est souvent insuffisante pour observer des sous-structures cellulaires complexes5,6. Cependant, un développement récent en microscopie confocale, l’imagerie à super-résolution Airyscan, est capable d’atteindre environ 140 nm (résolution XY)7,8 et dispose d’une préparation d’échantillon relativement simple compatible avec l’imagerie en direct. Étant donné que ce système de détection d’imagerie nécessite un long temps d’acquisition, sa haute résolution spatiale se fait au détriment de la résolution temporelle9. Par conséquent, une méthode est nécessaire pour s’assurer que l’imagerie des cellules vivantes est étendue avec une résolution spatiale élevée.
Ici, nous avons développé une méthode pour observer des cellules vivantes dans le tissu intact à sa résolution optimale pour déchiffrer des structures subcellulaires avec des informations spatiales détaillées. Cette méthode est conçue comme telle de manière à ce que les échantillons puissent être montés de manière stable pendant une longue période de temps (~ 10 h) sans bouger ni dégénérer. Les milieux cellulaires vivants utilisés dans cette technique peuvent prendre en charge la fonction cellulaire et éviter le photobleaching jusqu’à 10 heures sous un microscope à super-résolution. Enfin, ce protocole minimise la plupart des stress causés par l’éclairage constant des lasers sur de longues périodes de temps telles que l’hypoxie, les changements d’humidité et de température, ainsi que l’épuisement des nutriments.
En utilisant ce protocole pour imager les cellules souches germinales mâles (CSG) de la drosophile, nous avons pu observer comment l’activité asymétrique des microtubules permet une interaction préférentielle avec des chromatides sœurs épigénétiquement distinctes10,11,12,13. Ces types d’événements cellulaires sont très dynamiques et sont très difficiles à visualiser dans les cellules vivantes à l’aide d’autres méthodes d’imagerie à super-résolution telles que STORM, PALM ou STED. Nous prévoyons que cette méthode deviendra très utile pour les biologistes cellulaires car ils visent à comprendre les structures subcellulaires dynamiques des cellules vivantes résidant dans les tissus. Il existe de nombreux domaines dans lesquels cette méthode peut être appliquée, tels que l’étude de la dynamique des protéines; comprendre le mouvement des cellules; et le traçage de lignée et les processus de différenciation cellulaire, entre autres applications possibles.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator CS6 (figure making software)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane</td>
			<td>Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane</td>
			<td>Cat No. 08-67121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat. no. 26140079</td>
			<td>15% (V/V)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (analysis software)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image fluorescence intensity quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom cell culture dishes (FluroDish)</td>
			<td>World Precision Instrument, Inc.</td>
			<td>FD35PDL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris (image reconstruction software)</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>3D image reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imerssion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Immersol 518F/30 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. No. 15550</td>
			<td>200 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat No. - 15140-122</td>
			<td>0.6x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider Drosophila media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat No. - 11720-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue paper</td>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Wet to form humid chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN (imaging software)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution live cell imaging of subcellular structures

Il y a longtemps eu un compromis crucial entre la résolution spatiale et temporelle en imagerie. L’imagerie au-delà de la limite de diffraction de la lumière a traditionnellement été limitée à être utilisée uniquement sur des échantillons fixes ou des cellules vivantes en dehors des tissus marqués avec un signal fluorescent fort. Les techniques actuelles d’imagerie de cellules vivantes à super-résolution nécessitent l’utilisation de sondes de fluorescence spéciales, un éclairage élevé, des acquisitions d’images multiples avec traitement post-acquisition, ou souvent une combinaison de ces processus. Ces conditions préalables limitent considérablement les échantillons biologiques et les contextes auxquels cette technique peut être appliquée.
Nous décrivons ici une méthode pour effectuer une super-résolution (~ 140 nm XY-résolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. Cette technique est également compatible avec une faible intensité fluorescente, par exemple, EGFP ou mCherry marqué de manière endogène à des gènes faiblement exprimés. Comme preuve de principe, nous avons utilisé cette méthode pour visualiser plusieurs structures subcellulaires chez le testicule de drosophile. Pendant la préparation de tissu, la structure cellulaire et la morphologie de tissu sont maintenues dans le testicule disséqué. Ici, nous utilisons cette technique pour imager la dynamique des microtubules, les interactions entre les microtubules et la membrane nucléaire, ainsi que la fixation des microtubules aux centromères.
Cette technique nécessite des procédures spéciales pour la préparation des échantillons, le montage des échantillons et l’immobilisation des échantillons. De plus, les échantillons doivent être conservés pendant plusieurs heures après la dissection sans compromettre la fonction et l’activité cellulaires. Bien que nous ayons optimisé les conditions d’imagerie en direct à super-résolution spécifiquement dans les cellules souches germinales mâles (GSC) de la drosophile et les cellules germinales progénitrices dans le tissu de testicule disséqué, cette technique est largement applicable à une variété de types de cellules différents. La capacité d’observer les cellules dans leurs conditions physiologiques sans sacrifier la résolution spatiale ou temporelle sera un outil précieux pour les chercheurs qui cherchent à aborder des questions cruciales en biologie cellulaire.

L’imagerie des cellules vivantes au-delà de la limite de diffraction dans le tissu drosophile, en particulier pour les GSC, offre l’occasion d’étudier la dynamique des événements subcellulaires dans le contexte de la progression du cycle cellulaire. Récemment, une étude utilisant ce protocole a prouvé que les activités de microtubule au centrosome mère contre le centrosome de fille sont temporellement asymétriques dans les GSCs10. Le centrosome de mère émane des microtub...

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Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

Présenté ici est un protocole pour l’imagerie de cellules vivantes de super-résolution dans le tissu intact. Nous avons normalisé les conditions d’imagerie d’une population de cellules souches adultes très sensibles dans son environnement tissulaire natif. Cette technique consiste à équilibrer la résolution temporelle et spatiale pour permettre l’observation directe des phénomènes biologiques dans les tissus vivants.

Imagerie de cellules vivantes à super-résolution de structures subcellulaires

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Notre protocole utilise des sondes fluorophores régulières et des techniques simples de préparation d’échantillons qui maintiennent la cellule imbrique dans un état physiologique pour étudier le processus cellulaire hautement dynamique et les structures subcellulaires détaillées. Cette technique nous permet d’étudier les processus cellulaires à une super résolution et dans des conditions physiologiques pendant une période prolongée sans sacrifier la résolution spéciale ou temporaire. Commencez par couper une membrane de dialyse de coupure de poids moléculaire de 12 à 14 kilodaltons en petits morceaux et trempez les morceaux avec 100 microlitres de milieu cellulaire vivant pendant environ cinq minutes.Pendant que les membranes trempent, coupez l’anneau extérieur d’un tube de 50 millilitres en petits morceaux et stérilisez les morceaux dans de l’éthanol à 70%. Pour la dissection et le montage des testicules, transférer dix mouches mâles anesthésiées âgées de deux à trois jours dans une parabole de dissection sous un microscope de dissection et utiliser une pince fine pour enlever les testicules. Lorsque tous les testicules ont été collectés, lavez les testicules deux fois dans un milieu cellulaire vivant et utilisez une pointe de pipette pour étaler 100 à 150 microlitres de milieu cellulaire vivant sur le fond de verre préparé.Utilisez une pince fine pour transférer les testicules volants au centre de la parabole et enlevez tous les microlitres du milieu sauf environ 10. Rapidement, placez la membrane pré-humide sur les testicules et placez deux à trois petits poids en plastique sur la membrane. Immédiatement, ajoutez 100 à 150 microlitres de milieu cellulaire vivant frais et replacez l’anneau sur le côté élevé du plat.Replacez le couvercle sur l’anneau et faire pivoter un morceau de papier de soie dans de l’eau avant de placer le papier sur le bordereau de couverture. Ensuite, couvrez le plat avec un couvercle et fixez le plat sur la scène d’un microscope à super résolution. Pour l’imagerie des cellules souches germinales, ouvrez le logiciel d’imagerie et allumez la lumière transmise.Utilisez l’objectif 63X pour vous concentrer sur le tissu des testicules et allumez les lasers. Cliquez sur Live"pour localiser les cellules souches germinales. Ajustez le focus et cliquez sur Taille de l’image « pour définir la taille de l’image entre 512 par 512 et 1024 par 1024 pixels, et Moyenne"pour définir la moyenne de l’image sur un ou deux.Cliquez sur Master Gain « pour définir le gain de multiplication des électrons à moins de 800, et Lasers"pour régler la puissance laser sur 1% à 2%Zoom sur la région ou la cellule d’intérêt pour réduire le temps d’acquisition de l’image et réduire le blanchiment de la photo, et confirmez que l’image a été configurée de manière optimale avant de cliquer sur Démarrer l’expérience"pour démarrer la capture d’image time lapse. Si Airyscan Acquisition n’est pas configuré de manière optimale, cliquez sur Optimal dans les sections taille de trame, Z-Stack et Scan Area, et optimisez l’intervalle de temps, le nombre de tranches Z et la durée de l’imagerie time-lapse, en fonction de la conception expérimentale et du type d’échantillon. Après l’imagerie, sélectionnez Traitement, Traitement par lots et Traitement Airyscan, puis sélectionnez les images à traiter.Cliquez ensuite sur Exécuter le processus"pour obtenir les images de super résolution. L’imagerie cellulaire en direct des testicules de drosophile exprimant l’alpha-tubuline GFP dans les cellules germinales de stade précoce à l’aide d’un microscope confocal à disque tournant, permet la visualisation de l’intensité asymétrique des signaux GFP à deux centrosomes, comme un signal plus lumineux au centrosome mère et un signal relativement plus faible aux centrosomes filles. La différence de luminosité est probablement reflétée par l’asymétrie temporelle de la nucléation des microtubules, mais la morphologie détaillée et la quantité des microtubules ne peuvent pas être résolues à l’aide de la microscopie confocale à disque tournant.En revanche, l’imagerie à super résolution de cellules vivantes permet la visualisation et la quantification de la morphologie et du nombre de microtubules. Cette résolution améliorée révèle également des modèles de nucléation asymétrique des microtubules, d’allongement et d’interaction accrue avec la membrane nucléaire. L’imagerie des cellules vivantes permet également la visualisation de l’invagination asymétrique de la membrane nucléaire, mais pas des microtubules individuels qui pénètrent directement dans le noyau.En revanche, cette technique de super résolution de cellules vivantes permet l’observation directe de ces événements par imagerie simultanée des microtubules et de la lame nucléaire. Pendant la métaphase, les deux centromères frères peuvent être détectés comme un seul signal utilisant la microscopie de disque tournant, bien que la fixation centrale de microtubule ne puisse pas être observée. En revanche, l’imagerie en direct de super résolution permet la visualisation de l’attachement du centromère des microtubules dans la prophase précoce.Assurez-vous de placer une membrane sur les testicules pour vous assurer qu’ils ne bougent pas ou ne flottent pas pendant l’imagerie et pour optimiser les réglages du microscope pour éviter le blanchiment photographique et la phototoxicité. Il existe de nombreuses façons d’appliquer cette méthode, par exemple pour étudier la dynamique des protéines, le stress linéaire ou les défenses et processus cellulaires.

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