Name: super-resolution live cell imaging of subcellular structures
Uploaded: 2021-01-13T13:00:00
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Die Autoren danken der Integrated Imaging Core Facility an der Johns Hopkins University für Mikroskope und Datenanalysesoftware. Wir danken J. Snedeker und Q. E. Yu für Korrekturlesen und Vorschläge und X.C. Lab-Mitgliedern für hilfreiche Diskussionen und Vorschläge. Unterstützt von NIGMS/NIH R35GM127075, dem Howard Hughes Medical Institute, der David and Lucile Packard Foundation und den Startup-Fonds der Johns Hopkins University (X.C.).

1. Herstellung eines Lebendzell-Bildgebungscocktails (Lebende Zellmedien)
<ol><li>Ergänzen Sie Schneiders Drosophila Medium mit 15% fetalem Rinderserum (FBS) und 0,6x Penicillin / Streptomycin. Stellen Sie den pH-Wert auf ca. 7,0 ein.</li>
	<li>Kurz vor der Verwendung des Mediums Insulin zu einer Endkonzentration von 200 μg/ml hinzufügen. HINWEIS: Dieses Medium ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der normalen Zellteilung und Entwicklung des Drosophila-Hodens während der Zeitrafferbildge...

<ol>
	<li>Breedijk, R. M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live-cell+super-resolution+technique+demonstrated+by+imaging+germinosomes+in+wild-type+bacterial+spores.">A live-cell super-resolution technique demonstrated by imaging germinosomes in wild-type bacterial spores.</a> Scientific Reports. 10 (1), 5312 (2020).</li><li>Maddox, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+mitotic+spindle.">Imaging the mitotic spindle.</a> Methods in Enzymology. 505, 81-103 (2012).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM):+A+method+for+super+resolution+fluorescence+imaging.">Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): A method for super resolution fluorescence imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (6), 075143 (2013).</li><li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics.">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nature Methods. 5 (5), 417-423 (2008).</li><li>Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+super-resolved+microscopy.">STED super-resolved microscopy.</a> Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).</li><li>Huff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Airyscan+detector+from+ZEISS:+confocal+imaging+with+improved+signal-to-noise+ratio+and+super-resolution.">The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution.</a> Nature Methods. 12 (12), (2015).</li><li>Huff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+2D+superresolution+mode+for+ZEISS+Airyscan.">The new 2D superresolution mode for ZEISS Airyscan.</a> Nature Methods. 14 (12), 1223 (2017).</li><li>Korobchevskaya, K., Lagerholm, B., Colin-York, H., Fritzsche, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+potential+of+Airyscan+microscopy+for+live+cell+imaging.">Exploring the potential of Airyscan microscopy for live cell imaging.</a> Photonics. 4 (4), 41 (2017).</li><li>Ranjan, R., Snedeker, J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+centromeres+differentially+coordinate+with+mitotic+machinery+to+ensure+biased+sister+chromatid+segregation+in+germline+stem+cells.">Asymmetric centromeres differentially coordinate with mitotic machinery to ensure biased sister chromatid segregation in germline stem cells.</a> Cell Stem Cell. 25 (5), 666-681 (2019).</li><li>Kahney, E. W., Ranjan, R., Gleason, R. J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+from+asymmetry+or+asymmetry+from+symmetry.">Symmetry from asymmetry or asymmetry from symmetry.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 82, 305-318 (2017).</li><li>Wooten, M., Ranjan, R., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+histone+inheritance+in+asymmetrically+dividing+stem+cells.">Asymmetric histone inheritance in asymmetrically dividing stem cells.</a> Trends in Genetics. 36 (1), 30-43 (2020).</li><li>Wooten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+histone+inheritance+via+strand-specific+incorporation+and+biased+replication+fork+movement.">Asymmetric histone inheritance via strand-specific incorporation and biased replication fork movement.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (8), 732-743 (2019).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Sivaguru, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+performance+of+airyscan+and+structured+illumination+superresolution+microscopy+in+the+study+of+the+surface+texture+and+3D+shape+of+pollen.">Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen.</a> Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).</li></ol>

Hochauflösende Mikroskopiemethoden bieten eine räumliche Auflösung von bis zu 10 Nanometern4,5,6. Die STORM- und PALM-Mikroskopiemethoden ermöglichen eine Auflösung von bis zu 20 bis 50 nm (XY-Auflösung), während die STED-Mikroskopie eine Auflösung von 20 bis 100 nm (XY-Auflösung) bietet. Die räumliche Auflösung der SIM-Mikroskopie ist auf 100 bis 130 nm15begrenzt. Aufgrund der hohen Photonendichte und der ...

Die Visualisierung subzellulärer Strukturen und Proteindynamiken in lebenden Zellen mit einer Auflösung jenseits der Beugungsgrenze des Lichts ist typischerweise sehr herausfordernd1-3. Während mehrere superauflösende Techniken wie Stochastic-Optical-Reconstruction-Microscopy (STORM), Photo-Activated-Localization-Microscopy (PALM) und Stimulated-Emission-Depletion (STED)4,5,6Mikroskopie entwickelt wurden, schränken Komplikationen bei der Probenvorbereitung sowie die Notwendigkeit, die Lebensfähigkeit und Aktivität ex vivo aufrechtzuerhalten, die Verwendung herkömmlicher hochauflösender Mikroskopie für die Bildgebung lebender Proben ein. Die konventionelle konfokale Mikroskopie kann keine räumliche Auflösung über ~230 nm XY-Auflösung hinaus erreichen und reicht oft nicht aus, um komplizierte zelluläre Unterstrukturen zu beobachten5,6. Eine neuere Entwicklung in der konfokalen Mikroskopie, die hochauflösende Airyscan-Bildgebung, ist jedoch in der Lage, etwa 140 nm (XY-Auflösung)7,8 zu erreichen und verfügt über eine relativ einfache Probenvorbereitung, die mit live-Bildgebung kompatibel ist. Da dieses bildgebende Detektionssystem eine lange Erfassungszeit benötigt, geht seine hohe räumliche Auflösung auf Kosten der zeitlichen Auflösung9. Daher wird eine Methode benötigt, um sicherzustellen, dass die Bildgebung lebender Zellen mit hoher räumlicher Auflösung erweitert wird.
Hier haben wir eine Methode entwickelt, um lebende Zellen in intaktem Gewebe in ihrer optimalen Auflösung zu beobachten, um subzelluläre Strukturen mit detaillierten räumlichen Informationen zu entschlüsseln. Dieses Verfahren ist so konzipiert, dass Proben über einen langen Zeitraum (~ 10 h) stabil montiert werden können, ohne sich zu bewegen oder zu degenerieren. Die bei dieser Technik verwendeten lebenden Zellmedien können die Zellfunktion unterstützen und Photobleaching für bis zu 10 Stunden unter einem hochauflösenden Mikroskop vermeiden. Schließlich minimiert dieses Protokoll die meisten Belastungen, die durch die ständige Beleuchtung von Lasern über längere Zeiträume verursacht werden, wie Hypoxie, Feuchtigkeits- und Temperaturänderungen sowie Nährstofferschöpfung.
Mit diesem Protokoll zur Abbildung von Drosophila männlichen Keimbahnstammzellen (GSCs) konnten wir beobachten, wie die asymmetrische Aktivität von Mikrotubuli eine bevorzugte Interaktion mit epigenetisch unterschiedlichen Schwesterchromatiden ermöglicht10,11,12,13. Diese Art von zellulären Ereignissen sind hochdynamisch und in lebenden Zellen mit anderen hochauflösenden Bildgebungsmethoden wie STORM, PALM oder STED sehr schwer zu visualisieren. Wir gehen davon aus, dass diese Methode für Zellbiologen sehr nützlich sein wird, da sie darauf abzielen, die dynamischen subzellulären Strukturen lebender Zellen in Geweben zu verstehen. Es gibt viele Bereiche, in denen diese Methode angewendet werden kann, wie z.B. die Untersuchung der Dynamik von Proteinen; Verständnis der Bewegung von Zellen; und Lineage Tracing und zelluläre Differenzierungsprozesse, unter anderen möglichen Anwendungen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator CS6 (figure making software)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane</td>
			<td>Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane</td>
			<td>Cat No. 08-67121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat. no. 26140079</td>
			<td>15% (V/V)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (analysis software)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image fluorescence intensity quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom cell culture dishes (FluroDish)</td>
			<td>World Precision Instrument, Inc.</td>
			<td>FD35PDL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris (image reconstruction software)</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>3D image reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imerssion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Immersol 518F/30 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. No. 15550</td>
			<td>200 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat No. - 15140-122</td>
			<td>0.6x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider Drosophila media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat No. - 11720-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue paper</td>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Wet to form humid chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN (imaging software)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution live cell imaging of subcellular structures

Es gibt seit langem einen entscheidenden Kompromiss zwischen räumlicher und zeitlicher Auflösung in der Bildgebung. Die Bildgebung über die Beugungsgrenze des Lichts hinaus wurde traditionell nur an festen Proben oder lebenden Zellen außerhalb von Geweben verwendet, die mit einem starken fluoreszierenden Signal markiert sind. Aktuelle hochauflösende Live-Cell-Imaging-Verfahren erfordern den Einsatz spezieller Fluoreszenzsonden, eine hohe Beleuchtung, mehrere Bildaufnahmen mit Nachbearbeitung oder oft eine Kombination dieser Prozesse. Diese Voraussetzungen schränken die biologischen Proben und Kontexte, auf die diese Technik angewendet werden kann, erheblich ein.
Hier beschreiben wir eine Methode, um superauflösende (~140 nm XY-Auflösung) Zeitraffer-Fluoreszenz-Live-Cell-Bildgebung in situ durchzuführen. Diese Technik ist auch mit niedriger Fluoreszenzintensität kompatibel, z. B. EGFP oder mCherry endogen markiert an niedrig exprimierten Genen. Als Proof-of-Principle haben wir diese Methode verwendet, um mehrere subzelluläre Strukturen im Drosophila-Hoden zu visualisieren. Während der Gewebevorbereitung bleiben sowohl die Zellstruktur als auch die Gewebemorphologie innerhalb des sezierten Hodens erhalten. Hier verwenden wir diese Technik, um die Dynamik von Mikrotubuli, die Wechselwirkungen zwischen Mikrotubuli und der Kernmembran sowie die Befestigung von Mikrotubuli an Zentromeren abbilden.
Diese Technik erfordert spezielle Verfahren bei der Probenvorbereitung, Probenmontage und Immobilisierung von Proben. Darüber hinaus müssen die Proben nach der Dissektion mehrere Stunden lang gehalten werden, ohne die Zellfunktion und -aktivität zu beeinträchtigen. Während wir die Bedingungen für die hochauflösende Live-Bildgebung speziell in Drosophila männlichen Keimbahnstammzellen (GSCs) und Vorläuferkeimzellen in seziertem Hodengewebe optimiert haben, ist diese Technik auf eine Vielzahl verschiedener Zelltypen anwendbar. Die Fähigkeit, Zellen unter ihren physiologischen Bedingungen zu beobachten, ohne die räumliche oder zeitliche Auflösung zu beeinträchtigen, wird als unschätzbares Werkzeug für Forscher dienen, die entscheidende Fragen der Zellbiologie angehen wollen.

Die Bildgebung von Lebendzellen jenseits der Beugungsgrenze im Drosophila-Gewebe, insbesondere für GSCs, bietet die Möglichkeit, die Dynamik subzellulärer Ereignisse im Kontext der Zellzyklusprogression zu untersuchen. Kürzlich hat eine Studie, die dieses Protokoll verwendet, gezeigt, dass Mikrotubuli-Aktivitäten am Mutterzentrosom gegenüber dem Tochterzentrosom in GSCs10zeitlich asymmetrisch sind. Das Mutterzentrosom strahlt Mikrotubuli etwa 4 Stunden vor dem mitotischen Eintritt a...

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Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

Hier wird ein Protokoll für die hochauflösende Bildgebung von Lebendzellen in intaktem Gewebe vorgestellt. Wir haben die Bedingungen für die Abbildung einer hochempfindlichen adulten Stammzellpopulation in ihrer nativen Gewebeumgebung standardisiert. Diese Technik beinhaltet das Ausbalancieren der zeitlichen und räumlichen Auflösung, um die direkte Beobachtung biologischer Phänomene in lebendem Gewebe zu ermöglichen.

Hochauflösende Live-Cell-Bildgebung subzellulärer Strukturen

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Unser Protokoll verwendet regelmäßige Fluorophorsonden und einfache Probenvorbereitungstechniken, die die abgebildete Zelle in physiologischem Zustand halten, um hochdynamische zelluläre Prozesse und detaillierte subzelluläre Strukturen zu untersuchen. Diese Technik ermöglicht es uns, zelluläre Prozesse mit einer Superauflösung und unter physiologischen Bedingungen über einen längeren Zeitraum zu untersuchen, ohne auf die spezielle oder vorübergehende Auflösung zu verzichten. Beginnen Sie, indem Sie eine 12 bis 14 Kilodalton Molekulargewichts-Cutoff-Dialysemembran in kleine Stücke schneiden und die Stücke mit 100 Mikrolitern lebendzelligem Zellmedium für etwa fünf Minuten einweichen.Während die Membranen einweichen, schneiden Sie den äußeren Ring eines 50-Milliliter-Rohrs in kleine Stücke und sterilisieren Sie die Stücke in 70% Ethanol. Für die Hodendissektion und -montage zehn zwei bis drei Tage alte anästhesierte männliche Fliegen unter einem Seziermikroskop in eine Sezierschale geben und mit einer feinen Zette die Hoden entfernen. Wenn alle Hoden gesammelt wurden, waschen Sie die Hoden zweimal in Lebendzellmedium und verteilen Sie mit einer Pipettenspitze 100 bis 150 Mikroliter Lebendzellmedium auf der vorbereiteten Glasbodenschale.Verwenden Sie eine feine Zette, um die Fliegen hoden in die Mitte der Schüssel zu übertragen und entfernen Sie alle bis auf etwa 10 Mikroliter des Mediums. Legen Sie die vorfeuchte Membran schnell auf die Hoden und legen Sie zwei bis drei kleine Kunststoffgewichte auf die Membran. Fügen Sie sofort 100 bis 150 Mikroliter frisches Lebendzellmedium hinzu und legen Sie den Ring wieder auf die erhöhte Seite der Schüssel.Legen Sie den Deckel wieder auf den Ring und schwenken Sie ein Stück Seidenpapier in Wasser, bevor Sie das Papier auf den Deckzettel legen. Dann decken Sie die Schüssel mit einem Deckel ab und befestigen Sie die Schüssel auf der Bühne eines hochauflösenden Mikroskops. Für die Keimbahnstammzellbildgebung öffnen Sie die Bildgebungssoftware und schalten das durchgelassene Licht ein.Verwenden Sie das 63X-Objektiv, um sich auf das Hodengewebe zu konzentrieren und die Laser einzuschalten. Klicken Sie auf "Leben", um Keimstammzellen zu finden. Passen Sie den Fokus an und klicken Sie auf "Frame Size", um die Framegröße auf 512 x 512 und 1024 x 1024 Pixel einzustellen, und auf "Averaging", um den Framedurchschnitt auf ein oder zwei festzulegen.Klicken Sie auf "Master Gain", um die Elektronenvervielfachungsverstärkung auf weniger als 800 einzustellen, und auf "Laser", um die Laserleistung auf 1% bis 2% einzustellen Zoomen Sie auf den Bereich oder die Zelle von Interesse, um die Bildaufnahmezeit zu reduzieren und die Fotobleiche zu reduzieren, und bestätigen Sie, dass das Bild optimal konfiguriert wurde, bevor Sie auf "Experiment starten" klicken, um die Zeitrafferbildaufnahme zu starten. Wenn die Airyscan-Erfassung nicht optimal konfiguriert ist, klicken Sie in den Abschnitten "Framegröße", "Z-Stack" und "Scanbereich" auf "Optimal" und optimieren Sie das Zeitintervall, die Anzahl der Z-Slices und die Dauer der Zeitrafferaufnahme entsprechend dem experimentellen Design und der Art der Probe. Wählen Sie nach der Bildgebung "Verarbeitung", "Batch" und "Airyscan-Verarbeitung" und wählen Sie die zu verarbeitenden Bilder aus.Klicken Sie dann auf "Prozess ausführen", um die Bilder mit Superauflösung zu erhalten. Die Lebendzellbildgebung von Drosophila-Hoden, die Alpha-Tubulin-GFP in Keimzellen im Frühstadium mit einem konfokalen Spinnscheibenmikroskop exprimieren, ermöglicht die Visualisierung der asymmetrischen Intensität von GFP-Signalen an zwei Zentrosomen, als helleres Signal am Mutterzentrosom und als relativ schwächeres Signal an den Tochterzentrosomen. Der Helligkeitsunterschied spiegelt sich wahrscheinlich in der zeitlichen Asymmetrie der Mikrotubuli-Keimbildung wider, aber die detaillierte Morphologie und Menge der Mikrotubuli kann nicht mit der konfokalen Mikroskopie der Spinnscheibe aufgelöst werden.Im Gegensatz dazu ermöglicht die hochauflösende Bildgebung lebender Zellen die Visualisierung und Quantifizierung der Morphologie und Anzahl von Mikrotubuli. Diese verbesserte Auflösung zeigt auch Muster asymmetrischer Mikrotubuli-Keimbildung, Dehnung und erhöhter Wechselwirkung mit der Kernmembran. Die Bildgebung von Lebendzellen ermöglicht auch die Visualisierung der asymmetrischen Kernmembraninvagination, nicht jedoch einzelner Mikrotubuli, die direkt in den Kern gelangen.Im Gegensatz dazu ermöglicht diese Superauflösungstechnik für lebende Zellen die direkte Beobachtung dieser Ereignisse durch gleichzeitige Bildgebung sowohl der Mikrotubuli als auch der Kernlamina. Während der Metaphase können beide Schwesterzentromere mittels Spinnscheibenmikroskopie als ein Signal detektiert werden, obwohl die zentrale Bindung der Mikrotubuli nicht beobachtet werden kann. Im Gegensatz dazu ermöglicht die hochauflösende Live-Bildgebung die Visualisierung der Mikrotubuli-Zentromer-Anhaftung in der frühen Prophase.Achten Sie darauf, eine Membran über die Hoden zu legen, um sicherzustellen, dass sie sich während der Bildgebung nicht bewegen oder schweben und um die Mikroskopeinstellungen zu optimieren, um Fotobleiche und Fototoxizität zu vermeiden. Es gibt viele Möglichkeiten, wie diese Methode angewendet werden kann, z. B. um Proteindynamik, lineare Stressung oder zelluläre Abwehrkräfte und Prozesse zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Biology

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Super-Resolution Imaging der Bakterien Abteilung Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Forschung

Biologie

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Testproben zur Optimierung STORM Super Resolution Mikroskopie

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

Imaging Cell Membrane Verletzung und subzellulärer Prozesse in der Reparatur beteiligt

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Probenvorbereitung für Single Virion Atomic Force Microscopy und Super-Resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Super-Resolution Imaging der zytokinetischen Z-Ring im Live-Bakterien mit Schnelle 3D-Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-Source-Einzelpartikelanalyse für Super Resolution Mikroskopie mit VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins

Live Cell Imaging von Pilzzellen Modi des Eintrags und subzelluläre Lokalisation der antimykotische Pflanze Defensine zu untersuchen

Small cysteine-rich defensins are one of the largest groups of host defense peptides present in all plants. Many plant defensins exhibit potent in vitro ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Grundzustand Erschöpfung Super-Resolution Imaging in Säugerzellen

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

Anwendung des High-Speed-Höchstauflösung Geschwindigkeit Mikroskopie in Live primäre Zilie

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...