Name: super-resolution live cell imaging of subcellular structures
Uploaded: 2021-01-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures at JoVE.com

המחברים רוצים להודות למתקן הליבה המשולבת של הדמיה באוניברסיטת ג'ונס הופקינס על מיקרוסקופים ותוכנות לניתוח נתונים. אנו מודים לג'יי סנדקר ול-Q. E. Yu על הגהה והצעות, ולחברי המעבדה של X.C על דיונים והצעות מועילים. נתמך על ידי NIGMS / NIH R35GM127075, המכון הרפואי הווארד יוז, קרן דוד ולוסיל פקרד, וקרנות ההפעלה של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס (X.C.).

1. הכנת קוקטייל הדמיה של תאים חיים (מדיה סלולרית חיה)
<ol><li>תוספת מדיום הדרוזופילה של שניידר עם 15% סרום בקר עוברי (FBS) ו 0.6x פניצילין/סטרפטומיצין. כוונן את ה- pH לכ- 7.0.</li>
	<li>רגע לפני השימוש במדיום, להוסיף אינסולין לריכוז הסופי של 200 מיקרוגרם / מ"ל. הערה: מדיה זו היא קריטית לשמירה על חלוקת תאים ...

<ol>
	<li>Breedijk, R. M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live-cell+super-resolution+technique+demonstrated+by+imaging+germinosomes+in+wild-type+bacterial+spores.">A live-cell super-resolution technique demonstrated by imaging germinosomes in wild-type bacterial spores.</a> Scientific Reports. 10 (1), 5312 (2020).</li><li>Maddox, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+mitotic+spindle.">Imaging the mitotic spindle.</a> Methods in Enzymology. 505, 81-103 (2012).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM):+A+method+for+super+resolution+fluorescence+imaging.">Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): A method for super resolution fluorescence imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (6), 075143 (2013).</li><li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics.">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nature Methods. 5 (5), 417-423 (2008).</li><li>Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+super-resolved+microscopy.">STED super-resolved microscopy.</a> Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).</li><li>Huff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Airyscan+detector+from+ZEISS:+confocal+imaging+with+improved+signal-to-noise+ratio+and+super-resolution.">The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution.</a> Nature Methods. 12 (12), (2015).</li><li>Huff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+2D+superresolution+mode+for+ZEISS+Airyscan.">The new 2D superresolution mode for ZEISS Airyscan.</a> Nature Methods. 14 (12), 1223 (2017).</li><li>Korobchevskaya, K., Lagerholm, B., Colin-York, H., Fritzsche, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+potential+of+Airyscan+microscopy+for+live+cell+imaging.">Exploring the potential of Airyscan microscopy for live cell imaging.</a> Photonics. 4 (4), 41 (2017).</li><li>Ranjan, R., Snedeker, J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+centromeres+differentially+coordinate+with+mitotic+machinery+to+ensure+biased+sister+chromatid+segregation+in+germline+stem+cells.">Asymmetric centromeres differentially coordinate with mitotic machinery to ensure biased sister chromatid segregation in germline stem cells.</a> Cell Stem Cell. 25 (5), 666-681 (2019).</li><li>Kahney, E. W., Ranjan, R., Gleason, R. J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+from+asymmetry+or+asymmetry+from+symmetry.">Symmetry from asymmetry or asymmetry from symmetry.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 82, 305-318 (2017).</li><li>Wooten, M., Ranjan, R., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+histone+inheritance+in+asymmetrically+dividing+stem+cells.">Asymmetric histone inheritance in asymmetrically dividing stem cells.</a> Trends in Genetics. 36 (1), 30-43 (2020).</li><li>Wooten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+histone+inheritance+via+strand-specific+incorporation+and+biased+replication+fork+movement.">Asymmetric histone inheritance via strand-specific incorporation and biased replication fork movement.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (8), 732-743 (2019).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Sivaguru, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+performance+of+airyscan+and+structured+illumination+superresolution+microscopy+in+the+study+of+the+surface+texture+and+3D+shape+of+pollen.">Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen.</a> Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).</li></ol>

שיטות מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר לספק רזולוציה מרחבית גבוה ככל 10s של ננומטר4,5,6. שיטות המיקרוסקופיה STORM ו- PALM מאפשרות רזולוציה של עד 20 עד 50 ננומטר (רזולוציית XY), בעוד שמיקרוסקופיית STED מציעה רזולוציה של 20 עד 100 ננומטר (רזולוציית XY). הרזולוציה ה...

הדמיית מבנים תת-תאיים ודינמיקת חלבונים בתאים חיים עם רזולוציה מעבר למגבלת עקיפה של האור היא בדרך כלל מאתגרת מאוד1-3. בעוד טכניקות סופר-רזולוציה מרובות כגון סטוכוסטיק-אופטי-שחזור-מיקרוסקופיה (STORM), פוטו-מופעל-לוקליזציה-מיקרוסקופיה (PALM) ו-Stimulated-Emission-דלדול (STED)4,5,6 מיקרוסקופיה פותחו, סיבוכים בהכנת הדגימה כמו גם הצורך לשמור על כדאיות ופעילות ex vivo, להגביל את השימוש במיקרוסקופיה סופר-רזולוציה קונבנציונלית עבור דגימות חיות הדמיה. מיקרוסקופיה קונפוקלית קונבנציונלית אינה יכולה להגיע לרזולוציה מרחבית מעבר לרזולוציית XY של ~ 230 ננומטר ולעתים קרובות אינה מספיקה כדי לצפות במת-מבנים תאיים מורכבים5,6. עם זאת, פיתוח לאחרונה במיקרוסקופיה קונפוקלית, הדמיה סופר-רזולוציית Airyscan, הוא מסוגל להשיג כ 140 ננומטר (XY-רזולוציה)7,8 ויש לו הכנת מדגם פשוטה יחסית התואמת הדמיה חיה. מאז מערכת זיהוי הדמיה זו דורשת זמן רכישה ארוך, הרזולוציה המרחבית הגבוהה שלה באה במחיר של רזולוציה זמנית9. לכן, דרושה שיטה כדי להבטיח כי הדמיית תאים חיים מורחבת עם רזולוציה מרחבית גבוהה.
כאן, פיתחנו שיטה להתבוננות בתאים חיים ברקמה שלמה ברזולוציה האופטימלית שלה לפענוח מבנים תת-תאיים עם מידע מרחבי מפורט. שיטה זו מתוכננת כך שניתן להרכיב דגימות ביציבות במשך תקופה ארוכה של זמן (~ 10 שעות) מבלי לזוז או להתנוון. המדיה התאית החיה המשמשת בטכניקה זו יכולה לתמוך בתפקוד התאי ולהימנע מהלבנת תמונות עד 10 שעות תחת מיקרוסקופ ברזולוציה סופר. לבסוף, פרוטוקול זה ממזער את רוב הלחצים הנגרמים על ידי תאורה מתמדת של לייזרים על פני פרקי זמן ממושכים כגון היפוקסיה, שינויים בלחות וטמפרטורה, כמו גם תשישות תזונתית.
באמצעות פרוטוקול זה כדי לדמיין תאי גזע נבט זכר Drosophila (GSCs), הצלחנו לראות כיצד הפעילות האסימטרית של microtubules מאפשר אינטראקציה מועדפת עם כרומטידים אחות ייחודית אפיגנטית10,11,12,13. סוגים אלה של אירועים תאיים הם דינמיים מאוד וקשה מאוד לדמיין אותם בתאים חיים באמצעות שיטות הדמיה אחרות ברזולוציית-על כגון STORM, PALM או STED. אנו צופים כי שיטה זו תהפוך שימושית מאוד עבור ביולוגים תא כפי שהם שואפים להבין את המבנים התת-תאיים הדינמיים של תאים חיים המתגוררים ברקמות. ישנם תחומים רבים שבהם ניתן ליישם שיטה זו, כגון לימוד הדינמיקה של חלבונים; הבנת תנועת התאים; ותהליכי מעקב אחר שושלת שושלתיים ובידול סלולרי, בין יישומים אפשריים אחרים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator CS6 (figure making software)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane</td>
			<td>Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane</td>
			<td>Cat No. 08-67121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat. no. 26140079</td>
			<td>15% (V/V)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (analysis software)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image fluorescence intensity quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom cell culture dishes (FluroDish)</td>
			<td>World Precision Instrument, Inc.</td>
			<td>FD35PDL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris (image reconstruction software)</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>3D image reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imerssion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Immersol 518F/30 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. No. 15550</td>
			<td>200 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat No. - 15140-122</td>
			<td>0.6x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider Drosophila media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat No. - 11720-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue paper</td>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Wet to form humid chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN (imaging software)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution live cell imaging of subcellular structures

זה זמן רב יש החלפה מכרעת בין רזולוציה מרחבית וטמפורלית בהדמיה. הדמיה מעבר למגבלת עקיפה של אור הוגבלה באופן מסורתי לשימוש רק על דגימות קבועות או תאים חיים מחוץ לרקמה המסומנת באות פלואורסצנטי חזק. טכניקות הדמיית תאים חיים ברזולוציית-על הנוכחית דורשות שימוש בבדיקות פלואורסצנטיות מיוחדות, תאורה גבוהה, רכישות מרובות של תמונות עם עיבוד לאחר הרכישה, או לעתים קרובות שילוב של תהליכים אלה. תנאים מוקדמים אלה מגבילים באופן משמעותי את הדגימות וההקשרים הביולוגיים שניתן ליישם טכניקה זו.
כאן אנו מתארים שיטה לביצוע רזולוציית-על (~ 140 ננומטר XY-רזולוציה) זמן לשגות הדמיית תאים חיים במקום. טכניקה זו תואמת גם עם עוצמה פלואורסצנטית נמוכה, למשל, EGFP או mCherry אנדוגנית מתויגת בגנים בעלי ביטוי נמוך. כהוכחה לעיקרון, השתמשנו בשיטה זו כדי לדמיין מבנים תת-תאיים מרובים באשך Drosophila. במהלך הכנת הרקמה, הן המבנה התאי והן מורפולוגיה של הרקמות נשמרים בתוך האשכים הניתחו. כאן, אנו משתמשים בטכניקה זו כדי לדמיין דינמיקה microtubule, האינטראקציות בין microtubules ואת הממברנה הגרעינית, כמו גם את החיבור של microtubules כדי centromeres.
טכניקה זו דורשת הליכים מיוחדים בהכנת מדגם, הרכבה מדגם ושתקה של דגימות. בנוסף, יש לשמור על הדגימות מספר שעות לאחר הניתוח מבלי להתפשר על תפקוד ופעילות התא. בעוד שיש לנו אופטימיזציה התנאים עבור הדמיה ברזולוציה סופר חי במיוחד בתאי גזע נבט זכר Drosophila (GSCs) ותאי נבט אבות ברקמת האשכים ניתחו, טכניקה זו חלה באופן כללי על מגוון סוגי תאים שונים. היכולת להתבונן בתאים בתנאים הפיזיולוגיים שלהם מבלי להקריב רזולוציה מרחבית או זמנית תשמש ככלי רב ערך לחוקרים המבקשים לטפל בשאלות מכריעות בביולוגיה של התא.

הדמיית תאים חיים מעבר למגבלת עקיפה ברקמת Drosophila, במיוחד עבור GSCs, מספק הזדמנות לחקור את הדינמיקה של אירועים תת-תאיים בהקשר של התקדמות מחזור התא. לאחרונה, מחקר המשתמש בפרוטוקול זה הראה כי פעילויות microtubule במרכז האם לעומת הבת centrosome הם אסימטריים זמנית ב- GSCs10. האם צנטרוזום נובעת m...

Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures at JoVE.com

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

מוצג כאן פרוטוקול להדמיית תאים חיים ברזולוציית-על ברקמה שלמה. התקנו את התנאים להדמיית אוכלוסיית תאי גזע בוגרים רגישים מאוד בסביבת הרקמה הטבעית שלה. טכניקה זו כרוכה באיזון רזולוציה זמנית ומרחבית כדי לאפשר תצפית ישירה של תופעות ביולוגיות ברקמה חיה.

הדמיית תאים חיים ברזולוציה סופר-רזולוציה של מבנים תת-תאיים

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

הפרוטוקול שלנו משתמש בבדיקות פלואורופור רגילות וטכניקות הכנת דגימה פשוטות השומרות על התא המדומן במצב פיזיולוגי כדי לחקור תהליך תאי דינמי ביותר ומבנים תת-תאיים מפורטים. טכניקה זו מאפשרת לנו לחקור תהליכים תאיים ברזולוציית-על ובתנאים פיזיולוגיים לתקופה ממושכת מבלי להקריב את הרזולוציה המיוחדת או הזמנית. התחל על ידי חיתוך 12 עד 14 קילודלטון מולקולרי ניתוק קרום דיאליזה לחתיכות קטנות והשרות את החלקים עם 100 microliters של בינוני תא חי במשך כחמש דקות.בזמן הקרומים ספוגים, חותכים את הטבעת החיצונית של צינור 50 מיליליטר לחתיכות קטנות ומעקרים את החלקים ב -70%אתנול. עבור ניתוח האשכים והרכבה, להעביר עשרה שניים עד שלושה ימים זכר מרדים זבובים לתוך צלחת ניתוח תחת מיקרוסקופ ניתוח ולהשתמש מלקחיים עדינים כדי להסיר את האשכים. כאשר כל האשכים נאספו, לשטוף את האשכים פעמיים בינוני תא חי ולהשתמש טיפ פיפטה להתפשט 100 עד 150 microliters של תא חי בינוני לצלחת התחתונה זכוכית מוכן.השתמש במלקחיים עדינים כדי להעביר את האשכים הזבוב למרכז המנה ולהסיר את כל אבל כ 10 microliters של המדיום. במהירות, מניחים את הממברנה הרטובה מראש על האשכים ומניחים שניים עד שלושה משקולות פלסטיק קטנות על הממברנה. מיד, מוסיפים 100 עד 150 מיקרוליטרים של בינוני תא חי טרי ומניחים את הטבעת בחזרה על הצד המוגבה של המנה.מניחים את החלקת הכיסוי בחזרה על הטבעת ומערבבים פיסת נייר טישו במים לפני הנחת הנייר על פתק הכיסוי. לאחר מכן, לכסות את המנה עם מכסה ולאבטח את המנה על הבמה של מיקרוסקופ רזולוציה סופר. להדמיית תאי גזע חיידקיים, פתחו את תוכנת ההדמיה והדליקו את האור המועבר.השתמש במטרה 63X להתמקד ברקמת האשכים ולהדליק את הלייזרים. לחץ על Live"כדי לאתר תאי גזע נבטים. התאם את המוקד ולחץ על גודל מסגרת כדי להגדיר את גודל המסגרת בין 512 ל- 512 ל- 1024 על ידי פיקסלים 1024, ועל ממוצע "כדי להגדיר את ממוצע המסגרת לאחד או שניים.לחץ על Master Gain כדי להגדיר את רווח הכפלת האלקטרונים לפחות מ- 800, ועל לייזרים"כדי להגדיר את עוצמת הלייזר ל- 1%עד 2% הגדלה לאזור או לתא העניין כדי לקצר את זמן רכישת התמונה ולהפחית את ההלבנה של התמונות, ולאשר כי התמונה הוגדרה בצורה אופטימלית לפני לחיצה על Start Experiment"כדי להתחיל את לכידת התמונה בזמן. אם רכישת Airyscan אינה מוגדרת באופן אופטימלי"מוצג, לחץ על אופטימלי "בגודל מסגרת, Z-Stack, ו אזור סריקה", ולמטב את מרווח הזמן, מספר פרוסות Z ומשך הדמיית זמן לשגות, על פי העיצוב הניסיוני וסוג הדגימה. לאחר ההדמיה, בחר עיבוד, אצווה ועיבוד Airyscan ובחר את התמונות לעיבוד.לאחר מכן לחץ על הפעל תהליך"כדי לקבל את תמונות רזולוציית העל. הדמיית תאים חיים של אשכים drosophila מבטא אלפא טובולין GFP בתאי נבט בשלב מוקדם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק ספינינג, מאפשר הדמיה של העוצמה האסימטרית של אותות GFP בשני centrosomes, כאות בהיר יותר במרכז האם אות חלש יחסית במרכז הבת. ההבדל בבהירות משתקף ככל הנראה על ידי הא-סימטריה הזמנית של התגרענות המיקרוטובולה, אך לא ניתן לפתור את המורפולוגיה המפורטת ואת כמות המיקרוטובולות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב.לעומת זאת, הדמיית רזולוציית-על של תאים חיים מאפשרת הדמיה וכימות של מורפולוגיה ומספרים של מיקרוטובולות. רזולוציה משופרת זו חושפת גם דפוסים של התגרענות מיקרוטובולת אסימטרית, התארכות ואינטראקציה מוגברת עם הממברנה הגרעינית. הדמיית תאים חיים מאפשרת גם הדמיה של התפשטות קרום גרעיני אסימטרי, אך לא של מיקרוטובולות בודדות שנכנסות ישירות לגרעין.לעומת זאת, טכניקת רזולוציית-על של תאים חיים זו מאפשרת התבוננות ישירה באירועים אלה על ידי הדמיה סימולטנית של שני המיקרוטובולים ושל המרינה הגרעינית. במהלך metaphase, שני centromeres אחות ניתן לזהות כאות אחד באמצעות מיקרוסקופיית דיסק ספינינג, אם כי הקובץ המצורף המרכזי microtubule לא ניתן לראות. לעומת זאת, הדמיה חיה ברזולוציית-על מאפשרת הדמיה חזותית של הקובץ המצורף של צנטרומר מיקרוטובול בפרופאזה מוקדמת.הקפד למקם קרום מעל האשכים כדי להבטיח שהם לא לזוז או לצוף במהלך הדמיה כדי לייעל את הגדרות המיקרוסקופ כדי למנוע הלבנת תמונה ורעילות תמונה. ישנן דרכים רבות שבהן ניתן ליישם שיטה זו, כגון לחקור דינמיקת חלבונים, הדגשה ליניארית, או הגנות ותהליכים תאיים.

Research

JoVE Journal

Biology

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

הדמית סופר רזולוציה של מכונות אגף קטריאלי

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

דוגמאות מבחן לייעול STORM סופר רזולוציה מיקרוסקופית

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

תא ההדמיה ממברנה פגיעה ותהליכי subcellular המעורבים בתיקון

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins

הדמיה לחיות תאים תאים פטרייתי לחקור מצבים של ערך ולוקליזציה Subcellular של הצמח נגד פטריות Defensins

Small cysteine-rich defensins are one of the largest groups of host defense peptides present in all plants. Many plant defensins exhibit potent in vitro ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

הדמיה סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע בתאים בתרבית

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

יישום של מיקרוסקופיית מהירות רזולוציה סופר מהיר ב ריסי העיקרי בשידור חי

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...