Name: super-resolution live cell imaging of subcellular structures
Uploaded: 2021-01-13T13:00:00
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著者らは、ジョンズ・ホプキンス大学の統合イメージング・コア施設に、顕微鏡とデータ分析ソフトウェアに感謝したいと考えています。J.スネデカーとQ.E.ユーに校正と提案、X.Cラボメンバーに有益な議論や提案を感謝します。NIGMS/NIH R35GM127075、ハワードヒューズ医学研究所、デビッドとルシルパッカード財団、ジョンズホプキンス大学のスタートアップファンド(X.C.)

1. 生細胞イメージングカクテル(生細胞培地)の調製
<ol><li>15%のウシ胎児血清(FBS)と0.6xペニシリン/ストレプトマイシンとシュナイダーの ショウジョウバエ 培地を補う。pH を約 7.0 に調整します。</li>
	<li>培地を使用する直前に、インスリンを200 μg/mLの最終濃度に加えます。 注:この培地は、タイムラプスイメージング10、14の間に正常な細?...

<ol>
	<li>Breedijk, R. M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live-cell+super-resolution+technique+demonstrated+by+imaging+germinosomes+in+wild-type+bacterial+spores.">A live-cell super-resolution technique demonstrated by imaging germinosomes in wild-type bacterial spores.</a> Scientific Reports. 10 (1), 5312 (2020).</li><li>Maddox, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+mitotic+spindle.">Imaging the mitotic spindle.</a> Methods in Enzymology. 505, 81-103 (2012).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM):+A+method+for+super+resolution+fluorescence+imaging.">Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): A method for super resolution fluorescence imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (6), 075143 (2013).</li><li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics.">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nature Methods. 5 (5), 417-423 (2008).</li><li>Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+super-resolved+microscopy.">STED super-resolved microscopy.</a> Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).</li><li>Huff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Airyscan+detector+from+ZEISS:+confocal+imaging+with+improved+signal-to-noise+ratio+and+super-resolution.">The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution.</a> Nature Methods. 12 (12), (2015).</li><li>Huff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+2D+superresolution+mode+for+ZEISS+Airyscan.">The new 2D superresolution mode for ZEISS Airyscan.</a> Nature Methods. 14 (12), 1223 (2017).</li><li>Korobchevskaya, K., Lagerholm, B., Colin-York, H., Fritzsche, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+potential+of+Airyscan+microscopy+for+live+cell+imaging.">Exploring the potential of Airyscan microscopy for live cell imaging.</a> Photonics. 4 (4), 41 (2017).</li><li>Ranjan, R., Snedeker, J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+centromeres+differentially+coordinate+with+mitotic+machinery+to+ensure+biased+sister+chromatid+segregation+in+germline+stem+cells.">Asymmetric centromeres differentially coordinate with mitotic machinery to ensure biased sister chromatid segregation in germline stem cells.</a> Cell Stem Cell. 25 (5), 666-681 (2019).</li><li>Kahney, E. W., Ranjan, R., Gleason, R. J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+from+asymmetry+or+asymmetry+from+symmetry.">Symmetry from asymmetry or asymmetry from symmetry.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 82, 305-318 (2017).</li><li>Wooten, M., Ranjan, R., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+histone+inheritance+in+asymmetrically+dividing+stem+cells.">Asymmetric histone inheritance in asymmetrically dividing stem cells.</a> Trends in Genetics. 36 (1), 30-43 (2020).</li><li>Wooten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+histone+inheritance+via+strand-specific+incorporation+and+biased+replication+fork+movement.">Asymmetric histone inheritance via strand-specific incorporation and biased replication fork movement.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (8), 732-743 (2019).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Sivaguru, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+performance+of+airyscan+and+structured+illumination+superresolution+microscopy+in+the+study+of+the+surface+texture+and+3D+shape+of+pollen.">Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen.</a> Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).</li></ol>

超解像顕微鏡法は、ナノメートル4、5、6の10sの高い空間分解能を提供する。STORMおよびPALM顕微鏡法では、最大20~50nm(XY解像度)の分解能が可能で、STED顕微鏡は20~100nm(XY解像度)の分解能を実現します。SIM顕微鏡の空間分解能は100〜130 nm15に制限されています。しかし、高光子密度と長い取得時間のため、これらの技術?...

光の回折限界を超える分解能を持つ生細胞における細胞下構造およびタンパク質ダイナミクスの可視化は、典型的には1-3という非常に困難である。確率的光学再構成顕微鏡(STORM)、光活性化局在化顕微鏡(PALM)、刺激放出破壊(STED)4、5、6顕微鏡検査などの複数の超解像技術が開発されている一方で、検体調製の合併症、および生きている生き物の生存率と活性を維持する必要性、ライブイメージング用の従来の超解像顕微鏡の使用が制限されています。従来の共焦点顕微鏡は、〜230 nmのXY解像度を超える空間解像度に達することができず、複雑な細胞下構造5,6を観察するには不十分であることが多い。しかし、最近の共焦点顕微鏡法の開発では、Airyscan超解像イメージングは、約140nm(XY解像度)7、8を達成することができ、ライブイメージングと互換性のある比較的簡単なサンプル調製物を有する。この撮像検出システムは、長い取得時間を必要とするため、その高い空間分解能は、時間分解能9を犠牲にして来る。したがって、ライブセルイメージングを高い空間分解能で拡張するための方法が必要です。
ここでは、細胞内の細胞構造を詳細な空間情報で解読するための最適な分解能で、インタクト組織で生きた細胞を観察する方法を開発しました。この方法は、サンプルが移動または退行することなく長期間(〜10時間)安定して取り付けることができるように設計されています。この技術で使用される生細胞媒体は細胞機能を支え、超解像顕微鏡の下で10時間までの光の消光を避けることができる。最後に、このプロトコルは、低酸素症、湿度や温度の変化、ならびに栄養の枯渇などの長期間にわたってレーザーの一定の照明によって引き起こされるほとんどのストレスを最小限に抑えます。
このプロトコルを用いてショウジョウバエの生殖細胞幹細胞(GSC)をイメージし、微小管の非対称活性がエピジェネティックに異なる姉妹クロマチド10、11、12、13との優向的相互作用を可能にする方法を観察することができた。これらのタイプの細胞イベントは非常に動的であり、STORM、PALM、STEDなどの他の超解像度イメージング法を使用して、生細胞で視覚化することは非常に困難です。この方法は、組織に存在する生細胞の動的な細胞下構造を理解することを目的として、細胞生物学者にとって非常に有用なものになると予想されます。タンパク質のダイナミクスの研究など、この方法を適用できる多くの分野があります。細胞の動きを理解する。他の可能なアプリケーションの中で、系統トレースと細胞分化プロセス。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator CS6 (figure making software)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane</td>
			<td>Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane</td>
			<td>Cat No. 08-67121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat. no. 26140079</td>
			<td>15% (V/V)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (analysis software)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image fluorescence intensity quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom cell culture dishes (FluroDish)</td>
			<td>World Precision Instrument, Inc.</td>
			<td>FD35PDL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris (image reconstruction software)</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>3D image reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imerssion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Immersol 518F/30 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. No. 15550</td>
			<td>200 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat No. - 15140-122</td>
			<td>0.6x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider Drosophila media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat No. - 11720-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue paper</td>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Wet to form humid chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN (imaging software)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution live cell imaging of subcellular structures

イメージングにおける空間的解像度と時間的解像度の間には、長い間重要なトレードオフがありました。光の回折限界を超えるイメージングは、従来、強力な蛍光シグナルで標識された組織外の固定サンプルまたは生細胞にのみ使用することが制限されてきました。現在の超高解像度ライブセルイメージング技術では、特殊な蛍光プローブ、高い照明、取得後処理を伴う複数の画像取得、またはしばしばこれらのプロセスの組み合わせを使用する必要があります。これらの前提条件は、この技術を適用できる生物学的サンプルおよびコンテキストを大幅に制限します。
ここでは、超分解能(〜140nm XY分解能)の蛍光生細胞イメージングをその時点で行う方法について説明する。この技術はまた、低蛍光強度、例えば、低発現遺伝子で内因的にタグ付けされたEGFPまたはmCherryと互換性がある。原理実証として、ショ ウジョウバエ 精巣の複数の細胞下構造を可視化するためにこの方法を用いてきた。組織の準備中に、細胞構造と組織形態の両方が解剖された精巣内で維持される。ここでは、この技術を用いて、微小管ダイナミクス、微小管と核膜の相互作用、セントロメアへの微小管の付着を画像化します。
この技術は、試料の調製、サンプルの取り付けおよび固定化に特別な手順を必要とします。さらに、標本は、細胞機能および活動を損なうことなく解剖後数時間維持されなければならない。ショ ウジョウバエ の男性生殖細胞幹細胞(GSC)および解剖精巣組織の前駆細胞における生きた超解像イメージングの条件を最適化しましたが、この技術は様々な異なる細胞タイプに広く適用されます。空間的または時間的な解像度を犠牲にすることなく、生理学的条件下で細胞を観察する能力は、細胞生物学における重要な問題に取り組む研究者にとって非常に貴重なツールとして役立ちます。

ショウジョウバエ組織の回折限界を超えた生細胞イメージングは、特にGSCの場合、細胞周期進行の文脈における細胞内事象のダイナミクスを調査する機会を提供する。最近、このプロトコルを利用した研究では、母中心と娘の中心点での微小管活動がGSC10において時間的に非対称であることを示している。母心部は、有糸の開始の約4時間前に微小管を発するが、娘の?...

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Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

ここで提示される、インタクト組織における超解像ライブ細胞イメージングのためのプロトコルである。我々は、そのネイティブ組織環境で非常に敏感な成体幹細胞集団をイメージングするための条件を標準化しました。この技術は、生きた組織における生物学的現象の直接観察を可能にするために、時間的および空間的分解能のバランスを取ることを含む。

細胞下構造の超分解能ライブ細胞イメージング

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

当社のプロトコルは、通常のフルオロフォアプローブと、画像化された細胞を生理学的状態に維持する簡単な標本調製技術を使用して、高度に動的な細胞プロセスと詳細なサブ細胞構造を研究しています。この技術は、特別なまたは一時的な解像度のいずれかを犠牲にすることなく、超解像度で、生理学的条件下で細胞プロセスを調査することができます。12~14キロの分子量カットオフ透析膜を小片に切り取り、100マイクロリットルの生細胞培地で約5分間浸漬します。膜が浸っている間に、50ミリリットルのチューブの外輪を小さく切り、70%エタノールで滅菌します。精巣解剖と取り付けのために、10 2〜3日前の麻酔付きオスハエを解剖顕微鏡の下で解剖皿に移し、精巣を取り除くために細かい鉗子を使用する。すべての精巣を採取したら、精巣を生細胞培地で2回洗浄し、ピペットチップを使用して、調製したガラス底皿に100〜150マイクロリットルの生細胞培地を広げます。フライの精巣を皿の中央に移し、培地の約10マイクロリットルを除いてすべてを取り除くために細かい鉗子を使用してください。すぐに、精巣の上にプリウェット膜を置き、膜上に2〜3つの小さなプラスチックの重量を置きます。すぐに、新鮮な生きた細胞媒体の100〜150マイクロリットルを加え、リングを皿の高い側に戻します。カバースリップをリングに戻し、紙をカバースリップに置く前に、水にティッシュペーパーを回します。その後、蓋で皿をカバーし、超解像度顕微鏡のステージ上で皿を固定します。生殖細胞の幹細胞イメージングの場合は、イメージングソフトウェアを開き、透過光をオンにします。精巣組織に焦点を当て、レーザーをオンにするために、63Xの目的を使用してください。「ライブ」をクリックして、胚芽幹細胞を見つけます。フォーカスを調整して「フレームサイズ」をクリックして、512 x 512 x 1024 x 1024 ピクセルの間にフレームサイズを設定し、「平均」を使用してフレーム平均を 1 つまたは 2 つに設定します。「マスターゲイン」をクリックして電子乗算ゲインを800未満に設定し、レーザーを「レーザー」を使用して、画像取得時間を短縮し、写真の漂白を減らすために、目的の領域またはセルにレーザーパワーを1%から2%ズームに設定し、画像が「実験開始」をクリックする前に最適に設定されていることを確認します。Airyscan取得が最適に構成されていない場合は、フレームサイズ、Zスタック、スキャンエリアのセクションで「最適」をクリックし、実験計画と試料の種類に応じて、時間間隔、Zスライスの数およびタイムラプスイメージングの持続時間を最適化します。イメージング後、[処理]、[バッチ]、および [Airyscan 処理] を選択し、処理するイメージを選択します。次に、「プロセスを実行」をクリックして、スーパー解像度のイメージを取得します。ショウジョウバエの生細胞イメージングは、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて初期段階の生殖細胞でアルファ尿細管GFPを発現し、母中心体での明るい信号および娘セントロソームでの比較的弱い信号として、2つの中心体でのGFP信号の非対称強度の視覚化を可能にする。明るさの差は微小管核形成の時間的非対称性によって反映される可能性が高いが、微小管の詳細な形態および量は、スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して解決できない。対照的に、生細胞超解像度イメージングは、微小管形態および数の可視化と定量を可能にする。この改善された解像度はまた、非対称微小管核形成、伸びおよび核膜との相互作用の増加のパターンを明らかにする。生細胞イメージングはまた、非対称核膜の侵入の視覚化を可能にするが、核に直接入る個々の微小管の視覚化は可能ではない。対照的に、この生細胞超分解能技術は、微小管と核層の両方を同時にイメージングすることによって、これらの事象を直接観察することを可能にする。転移の間、両方の姉妹セントロメレは、マイクロチューブ中央の付着物を観察することはできませんが、回転ディスク顕微鏡を使用して1つの信号として検出することができます。対照的に、超解像度ライブイメージングは、初期のフェーズで微小管セントロメア付着の可視化を可能にする。精巣の上に膜を置いて、イメージング中に移動や浮動がないようにし、顕微鏡の設定を最適化して、写真の漂白や光の毒性を避けるようにしてください。この方法は、タンパク質のダイナミクス、線形応力、細胞防御やプロセスの調査など、さまざまな方法で適用できます。

Research

JoVE Journal

Biology

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