Name: super-resolution live cell imaging of subcellular structures
Uploaded: 2021-01-13T13:00:00
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Os autores gostariam de agradecer às instalações do Núcleo Integrado de Imagens da Universidade Johns Hopkins por microscópios e software de análise de dados. Agradecemos a J. Snedeker e Q. E. Yu por revisarem e sugestões, e aos membros do laboratório X.C. por discussões e sugestões úteis. Apoiados pelo NIGMS/NIH R35GM127075, o Howard Hughes Medical Institute, a Fundação David e Lucile Packard e os fundos de startup da Universidade Johns Hopkins (X.C.).

1. Preparação de coquetel de imagem celular ao vivo (mídia celular ao vivo)
<ol><li>Suplemento O meio Drosophila de Schneider com 15% de soro bovino fetal (FBS) e penicilina/estreptomicina de 0,6x. Ajuste o pH para aproximadamente 7,0.</li>
	<li>Pouco antes de usar o meio, adicione insulina a uma concentração final de 200 μg/mL. NOTA: Esta mídia é fundamental para manter a divisão celular normal e o desenvolvimento da testíase Drosophila durante a imagem de lapso de tempo<sup class="xref"...

<ol>
	<li>Breedijk, R. M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live-cell+super-resolution+technique+demonstrated+by+imaging+germinosomes+in+wild-type+bacterial+spores.">A live-cell super-resolution technique demonstrated by imaging germinosomes in wild-type bacterial spores.</a> Scientific Reports. 10 (1), 5312 (2020).</li><li>Maddox, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+mitotic+spindle.">Imaging the mitotic spindle.</a> Methods in Enzymology. 505, 81-103 (2012).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM):+A+method+for+super+resolution+fluorescence+imaging.">Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): A method for super resolution fluorescence imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (6), 075143 (2013).</li><li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics.">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nature Methods. 5 (5), 417-423 (2008).</li><li>Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+super-resolved+microscopy.">STED super-resolved microscopy.</a> Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).</li><li>Huff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Airyscan+detector+from+ZEISS:+confocal+imaging+with+improved+signal-to-noise+ratio+and+super-resolution.">The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution.</a> Nature Methods. 12 (12), (2015).</li><li>Huff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+2D+superresolution+mode+for+ZEISS+Airyscan.">The new 2D superresolution mode for ZEISS Airyscan.</a> Nature Methods. 14 (12), 1223 (2017).</li><li>Korobchevskaya, K., Lagerholm, B., Colin-York, H., Fritzsche, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+potential+of+Airyscan+microscopy+for+live+cell+imaging.">Exploring the potential of Airyscan microscopy for live cell imaging.</a> Photonics. 4 (4), 41 (2017).</li><li>Ranjan, R., Snedeker, J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+centromeres+differentially+coordinate+with+mitotic+machinery+to+ensure+biased+sister+chromatid+segregation+in+germline+stem+cells.">Asymmetric centromeres differentially coordinate with mitotic machinery to ensure biased sister chromatid segregation in germline stem cells.</a> Cell Stem Cell. 25 (5), 666-681 (2019).</li><li>Kahney, E. W., Ranjan, R., Gleason, R. J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+from+asymmetry+or+asymmetry+from+symmetry.">Symmetry from asymmetry or asymmetry from symmetry.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 82, 305-318 (2017).</li><li>Wooten, M., Ranjan, R., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+histone+inheritance+in+asymmetrically+dividing+stem+cells.">Asymmetric histone inheritance in asymmetrically dividing stem cells.</a> Trends in Genetics. 36 (1), 30-43 (2020).</li><li>Wooten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+histone+inheritance+via+strand-specific+incorporation+and+biased+replication+fork+movement.">Asymmetric histone inheritance via strand-specific incorporation and biased replication fork movement.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (8), 732-743 (2019).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Sivaguru, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+performance+of+airyscan+and+structured+illumination+superresolution+microscopy+in+the+study+of+the+surface+texture+and+3D+shape+of+pollen.">Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen.</a> Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).</li></ol>

Métodos de microscopia de super resolução fornecem resolução espacial de até 10s de nanômetros4,5,6. Os métodos de microscopia STORM e PALM permitem resolução de até 20 a 50 nm (resolução XY), enquanto a microscopia STED oferece resolução de 20 a 100 nm (resolução XY). A resolução espacial da microscopia SIM é limitada a 100 a 130 nm15. No entanto, devido à sua alta densidade de fótons e ao longo...

Visualizar estruturas subcelulares e dinâmicas proteicas em células vivas com resolução além do limite de difração de luz é tipicamente muito desafiador1-3. Enquanto várias técnicas de super-resolução como A Microscopia Estocástica-Óptica-Reconstrução (STORM), Foto-Ativada-Localização-Microscopia (PALM) e Esgotamento de Emissões Estimuladas (STED)4,5,6 microscopia foram desenvolvidas, complicações na preparação de amostras ao vivo, limitando o uso de microscopia de super resolução convencional para imagens ao vivo. A microscopia confocal convencional não pode alcançar a resolução espacial além da resolução XY de ~230 nm e muitas vezes é insuficiente para observar subestruturas celulares intrincadas5,6. No entanto, um desenvolvimento recente em microscopia confocal, imagem de super-resolução airyscan, é capaz de alcançar aproximadamente 140 nm (resolução XY)7,8 e tem uma preparação amostral relativamente simples que é compatível com imagens vivas. Uma vez que este sistema de detecção de imagens requer um longo tempo de aquisição, sua alta resolução espacial vem ao custo da resolução temporal9. Portanto, é necessário um método para garantir que a imagem de células vivas seja estendida com alta resolução espacial.
Aqui, desenvolvemos um método para observar células vivas em tecido intacto em sua resolução ideal para decifrar estruturas subcelulares com informações espaciais detalhadas. Este método é projetado como tal para que as amostras possam ser montadas de forma estável por um longo período de tempo (~ 10 h) sem se mover ou degenerar. A mídia de células vivas usada nesta técnica pode suportar a função celular e evitar fotobleaching por até 10 horas sob um microscópio de super resolução. Finalmente, este protocolo minimiza a maioria das tensões causadas pela iluminação constante de lasers ao longo de longos períodos de tempo, como hipóxia, mudanças na umidade e temperatura, bem como exaustão de nutrientes.
Utilizando este protocolo para imagem de células-tronco germinais machos Drosophila (GSCs), pudemos observar como a atividade assimétrica dos microtúbulos permite a interação preferencial com cromátides irmãs epigenéticamente distintas10,11,12,13. Esses tipos de eventos celulares são altamente dinâmicos e são muito difíceis de visualizar em células vivas usando outros métodos de imagem de super-resolução, como STORM, PALM ou STED. Prevemos que esse método se tornará altamente útil para os biólogos celulares, pois eles visam entender as estruturas subcelulares dinâmicas das células vivas residentes em tecidos. Existem muitas áreas em que esse método pode ser aplicado, como estudar a dinâmica das proteínas; compreender o movimento das células; e rastreamento de linhagem e processos de diferenciação celular, entre outras possíveis aplicações.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator CS6 (figure making software)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane</td>
			<td>Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane</td>
			<td>Cat No. 08-67121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat. no. 26140079</td>
			<td>15% (V/V)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (analysis software)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image fluorescence intensity quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom cell culture dishes (FluroDish)</td>
			<td>World Precision Instrument, Inc.</td>
			<td>FD35PDL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris (image reconstruction software)</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>3D image reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imerssion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Immersol 518F/30 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. No. 15550</td>
			<td>200 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat No. - 15140-122</td>
			<td>0.6x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider Drosophila media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat No. - 11720-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue paper</td>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Wet to form humid chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN (imaging software)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution live cell imaging of subcellular structures

Há muito tempo há uma troca crucial entre a resolução espacial e temporal na imagem. Imagens além do limite de difração de luz têm sido tradicionalmente restritas a serem usadas apenas em amostras fixas ou células vivas fora do tecido rotulado com forte sinal fluorescente. As técnicas atuais de imagem de células vivas de super-resolução exigem o uso de sondas especiais de fluorescência, alta iluminação, múltiplas aquisições de imagens com processamento pós-aquisição ou muitas vezes uma combinação desses processos. Esses pré-requisitos limitam significativamente as amostras biológicas e contextos aos os que essa técnica pode ser aplicada.
Aqui descrevemos um método para executar a super-resolução (~140 nm XY-resolução) fluorescência de fluorescência de fluorescência ao vivo de imagem em si. Esta técnica também é compatível com baixa intensidade fluorescente, por exemplo, EGFP ou mCherry etiquetada em genes humildemente expressos. Como prova de princípio, usamos este método para visualizar múltiplas estruturas subcelulares no teste de Drosophila. Durante a preparação tecidual, tanto a estrutura celular quanto a morfologia tecidual são mantidas dentro dos testíficos dissecados. Aqui, usamos essa técnica para a dinâmica dos microtúbulos de imagem, as interações entre microtúbulos e a membrana nuclear, bem como a fixação de microtúbulos aos centromeres.
Esta técnica requer procedimentos especiais na preparação da amostra, montagem de amostras e imobilização de amostras. Além disso, os espécimes devem ser mantidos por várias horas após a dissecção sem comprometer a função e a atividade celular. Embora tenhamos otimizado as condições para imagens de super resolução viva especificamente em células-tronco germinais machos Drosophila (GSCs) e células germinativas progenitoras em tecido de testíase dissecado, esta técnica é amplamente aplicável a uma variedade de diferentes tipos de células. A capacidade de observar células sob suas condições fisiológicas sem sacrificar resolução espacial ou temporal servirá como uma ferramenta inestimável para pesquisadores que buscam abordar questões cruciais na biologia celular.

Imagens de células vivas além do limite de difração no tecido Drosophila, especialmente para GSCs, fornecem uma oportunidade para investigar a dinâmica dos eventos subcelulares no contexto da progressão do ciclo celular. Recentemente, um estudo utilizando esse protocolo mostrou que as atividades de microtúbulos no centro da mãe versus a filha são temporalmente assimétricas em GSCs10. O centro-casal materno emana microtúbulos aproximadamente 4 horas antes da entrada mitótica, e...

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Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

Apresentado aqui é um protocolo para imagens de células vivas de super-resolução em tecido intacto. Nós padronizamos as condições para a imagem de uma população de células-tronco adultas altamente sensíveis em seu ambiente de tecido nativo. Esta técnica envolve o equilíbrio da resolução temporal e espacial para permitir a observação direta de fenômenos biológicos no tecido vivo.

Imagem celular ao vivo super-resolução de estruturas subcelulares

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Nosso protocolo usa sondas fluoróforas regulares e técnicas simples de preparação de espécimes que mantêm a célula imagem em condições fisiológicas para estudar processos celulares altamente dinâmicos e estruturas subcelulares detalhadas. Essa técnica nos permite investigar processos celulares em uma super resolução e em condições fisiológicas por um período prolongado sem sacrificar a resolução especial ou temporária. Comece cortando uma membrana de diálise de corte de peso molecular de 12 a 14 kilodalton em pequenos pedaços e absorvendo as peças com 100 microliters de meio de célula viva por cerca de cinco minutos.Enquanto as membranas estão encharcadas, corte o anel externo de um tubo de 50 mililitros em pequenos pedaços e esterilize as peças em 70% de etanol. Para dissecção e montagem de testes, transfira dez de dois a três dias de idade anesthetizado moscas machos em um prato de dissecção sob um microscópio dissecando e usar fórceps finos para remover os testículos. Quando todos os testículos tiverem sido coletados, lave os testículos duas vezes no meio da célula viva e use uma ponta de pipeta para espalhar de 100 a 150 microliters de meio de célula viva para o prato de fundo de vidro preparado.Use fórceps finos para transferir os testículos de mosca para o centro do prato e remova todos, exceto cerca de 10 microliters do meio. Rapidamente, coloque a membrana pré-molhada sobre os testículos e coloque de dois a três pequenos pesos plásticos na membrana. Imediatamente, adicione 100 a 150 microliters de meio de célula viva fresca e coloque o anel de volta no lado elevado do prato.Coloque a tampa deslize de volta para o anel e gire um pedaço de papel de tecido na água antes de colocar o papel no deslizamento da tampa. Em seguida, cubra o prato com uma tampa e fixe o prato no palco de um microscópio de super resolução. Para imagens de células-tronco germinativas, abra o software de imagem e ligue a luz transmitida.Use o objetivo 63X para focar no tecido de testículos e ligar os lasers. Clique em Live"para localizar células-tronco germinais. Ajuste o foco e clique em Tamanho do Quadro", para definir o tamanho do quadro entre 512 por 512 e 1024 por 1024 pixels, e média"para definir a média do quadro para um ou dois.Clique em Master Gain"para definir o ganho de multiplicação de elétrons para menos de 800, e lasers"para definir a potência laser para 1%a 2% Zoom na região ou célula de interesse para reduzir o tempo de aquisição da imagem e reduzir o branqueamento de fotos, e confirmar que a imagem foi configurada de forma ideal antes de clicar em Iniciar Experimento"para iniciar a captura de imagem de lapso de tempo. Se a Aquisição airyscan não estiver configurada de forma ideal" será exibida, clique em Optimal"nas seções tamanho do quadro, Z-Stack e Área de varredura, e otimize o intervalo de tempo, o número de fatias Z e a duração da imagem de lapso de tempo, de acordo com o design experimental e o tipo de amostra. Após a imagem, selecione Processamento, Batch"e Processamento Airyscan e selecione as imagens a serem processadas.Em seguida, clique em Executar processo"para obter as imagens de super resolução. A imagem celular viva de testículos de drosophila expressando gfp de tubulina alfa em células germinativas em estágio inicial usando um microscópio confocal de disco giratório, permite a visualização da intensidade assimétrica dos sinais de GFP em dois centrossomos, como um sinal mais brilhante no centro-mãe e um sinal relativamente mais fraco nos centrossos da filha. A diferença de brilho é provavelmente refletida pela assimetria temporal da nucleação do microtúbulo, mas a morfologia detalhada e a quantidade dos microtúbulos não podem ser resolvidas usando microscopia confocal de disco giratório.Em contraste, a super resolução de células vivas permite a visualização e quantificação da morfologia e números de microtúbulos. Essa resolução melhorada também revela padrões de nucleação assimétrica de microtúbulos, alongamento e aumento da interação com a membrana nuclear. A imagem celular viva também permite a visualização da invaginação da membrana nuclear assimétrica, mas não de microtúbulos individuais que entram diretamente no núcleo.Em contraste, esta técnica de super resolução de células vivas permite a observação direta desses eventos por imagens simultâneas de microtúbulos e da lâmina nuclear. Durante a metafase, ambos os centrosmers irmãs podem ser detectados como um sinal usando microscopia de disco giratório, embora o acessório central de microtúbulo não possa ser observado. Em contraste, a imagem viva de super resolução permite a visualização do acessório de centromero microtúbulo em prophase precoce.Certifique-se de colocar uma membrana sobre os testículos para garantir que eles não se movam ou flutuem durante a imagem e para otimizar as configurações do microscópio para evitar branqueamento de fotos e toxicidade fotográfica. Existem muitas maneiras de aplicar esse método, como investigar a dinâmica das proteínas, o estresse linear ou as defesas e processos celulares.

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