Name: super-resolution live cell imaging of subcellular structures
Uploaded: 2021-01-13T13:00:00
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A los autores les gustaría agradecer a las instalaciones de Integrated Imaging Core de la Universidad Johns Hopkins por los microscopios y el software de análisis de datos. Agradecemos a J. Snedeker y Q. E. Yu por la corrección de pruebas y sugerencias, y a los miembros del laboratorio X.C. por sus útiles discusiones y sugerencias. Con el apoyo de NIGMS/NIH R35GM127075, el Instituto Médico Howard Hughes, la Fundación David y Lucile Packard y los fondos de inicio de la Universidad Johns Hopkins (X.C.).

1. Preparación de cóctel de imágenes de células vivas (medios celulares vivos)
<ol><li>Complemente el medio Drosophila de Schneider con suero fetal bovino al 15% (FBS) y 0,6 veces penicilina/estreptomicina. Ajuste el pH a aproximadamente 7.0.</li>
	<li>Justo antes de usar el medio, agregue insulina a una concentración final de 200 μg/mL. NOTA: Este medio es crítico para mantener la división celular normal y el desarrollo del testículo de Drosophila durante las imágenes de lapso de tiempo<...

<ol>
	<li>Breedijk, R. M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live-cell+super-resolution+technique+demonstrated+by+imaging+germinosomes+in+wild-type+bacterial+spores.">A live-cell super-resolution technique demonstrated by imaging germinosomes in wild-type bacterial spores.</a> Scientific Reports. 10 (1), 5312 (2020).</li><li>Maddox, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+mitotic+spindle.">Imaging the mitotic spindle.</a> Methods in Enzymology. 505, 81-103 (2012).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM):+A+method+for+super+resolution+fluorescence+imaging.">Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): A method for super resolution fluorescence imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (6), 075143 (2013).</li><li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics.">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nature Methods. 5 (5), 417-423 (2008).</li><li>Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+super-resolved+microscopy.">STED super-resolved microscopy.</a> Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).</li><li>Huff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Airyscan+detector+from+ZEISS:+confocal+imaging+with+improved+signal-to-noise+ratio+and+super-resolution.">The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution.</a> Nature Methods. 12 (12), (2015).</li><li>Huff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+2D+superresolution+mode+for+ZEISS+Airyscan.">The new 2D superresolution mode for ZEISS Airyscan.</a> Nature Methods. 14 (12), 1223 (2017).</li><li>Korobchevskaya, K., Lagerholm, B., Colin-York, H., Fritzsche, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+potential+of+Airyscan+microscopy+for+live+cell+imaging.">Exploring the potential of Airyscan microscopy for live cell imaging.</a> Photonics. 4 (4), 41 (2017).</li><li>Ranjan, R., Snedeker, J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+centromeres+differentially+coordinate+with+mitotic+machinery+to+ensure+biased+sister+chromatid+segregation+in+germline+stem+cells.">Asymmetric centromeres differentially coordinate with mitotic machinery to ensure biased sister chromatid segregation in germline stem cells.</a> Cell Stem Cell. 25 (5), 666-681 (2019).</li><li>Kahney, E. W., Ranjan, R., Gleason, R. J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+from+asymmetry+or+asymmetry+from+symmetry.">Symmetry from asymmetry or asymmetry from symmetry.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 82, 305-318 (2017).</li><li>Wooten, M., Ranjan, R., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+histone+inheritance+in+asymmetrically+dividing+stem+cells.">Asymmetric histone inheritance in asymmetrically dividing stem cells.</a> Trends in Genetics. 36 (1), 30-43 (2020).</li><li>Wooten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+histone+inheritance+via+strand-specific+incorporation+and+biased+replication+fork+movement.">Asymmetric histone inheritance via strand-specific incorporation and biased replication fork movement.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (8), 732-743 (2019).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Sivaguru, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+performance+of+airyscan+and+structured+illumination+superresolution+microscopy+in+the+study+of+the+surface+texture+and+3D+shape+of+pollen.">Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen.</a> Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).</li></ol>

Los métodos de microscopía de súper resolución proporcionan una resolución espacial tan alta como 10s de nanómetros4,5,6. Los métodos de microscopía STORM y PALM permiten una resolución de hasta 20 a 50 nm (resolución XY), mientras que la microscopía STED ofrece una resolución de 20 a 100 nm (resolución XY). La resolución espacial de la microscopía SIM está limitada a 100 a 130 nm15. Sin embargo, debid...

Visualizar las estructuras subcelulares y la dinámica de proteínas en células vivas con resolución más allá del límite de difracción de la luz es típicamente muy difícil1-3. Mientras que se han desarrollado múltiples técnicas de súper resolución como microscopía estocástica-óptica-reconstrucción-microscopía (STORM), foto-activada-localización-microscopía (PALM) y estimulada-emisión-agotamiento (STED)4,5,6 microscopía, las complicaciones en la preparación de muestras, así como la necesidad de mantener la viabilidad y la actividad ex vivo, limitan el uso de la microscopía convencional de súper resolución para obtener imágenes de muestras vivas. La microscopía confocal convencional no puede alcanzar una resolución espacial más allá de ~ 230 nm de resolución XY y a menudo es insuficiente para observar subestructuras celulares intrincadas5,6. Sin embargo, un desarrollo reciente en microscopía confocal, airyscan super-resolución de imagen, es capaz de lograr aproximadamente 140 nm (resolución XY)7,8 y tiene una preparación de muestra relativamente simple que es compatible con imágenes en vivo. Dado que este sistema de detección de imágenes requiere un largo tiempo de adquisición, su alta resolución espacial viene a costa de la resolución temporal9. Por lo tanto, se necesita un método para garantizar que las imágenes de células vivas se amplíen con alta resolución espacial.
Aquí, hemos desarrollado un método para la observación de células vivas en tejido intacto en su resolución óptima para descifrar las estructuras subcelulares con información espacial detallada. Este método está diseñado como tal para que las muestras se puedan montar de forma estable durante un largo período de tiempo (~ 10 h) sin moverse ni degenerar. Los medios celulares vivos utilizados en esta técnica pueden apoyar la función celular y evitar el fotoblanqueo durante un hasta 10 horas bajo un microscopio de súper resolución. Finalmente, este protocolo minimiza la mayoría de las tensiones causadas por la iluminación constante de los láseres durante largos períodos de tiempo como la hipoxia, los cambios en la humedad y la temperatura, así como el agotamiento de nutrientes.
Utilizando este protocolo para obtener imágenes de células madre de línea germinal masculinas de Drosophila (GSCs), pudimos observar cómo la actividad asimétrica de los microtúbulos permite la interacción preferencial con cromátidas hermanas epigenéticamente distintas10,11,12,13. Estos tipos de eventos celulares son altamente dinámicos y son muy difíciles de visualizar en células vivas utilizando otros métodos de imágenes de súper resolución como STORM, PALM o STED. Anticipamos que este método llegará a ser altamente útil para los biólogos celulares, ya que tienen como objetivo comprender las estructuras subcelulares dinámicas de las células vivas que residen en los tejidos. Hay muchas áreas en las que se puede aplicar este método, como el estudio de la dinámica de las proteínas; comprender el movimiento de las células; y procesos de trazado de linaje y diferenciación celular, entre otras posibles aplicaciones.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator CS6 (figure making software)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane</td>
			<td>Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane</td>
			<td>Cat No. 08-67121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat. no. 26140079</td>
			<td>15% (V/V)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (analysis software)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image fluorescence intensity quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom cell culture dishes (FluroDish)</td>
			<td>World Precision Instrument, Inc.</td>
			<td>FD35PDL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris (image reconstruction software)</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>3D image reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imerssion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Immersol 518F/30 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. No. 15550</td>
			<td>200 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat No. - 15140-122</td>
			<td>0.6x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider Drosophila media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat No. - 11720-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue paper</td>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Wet to form humid chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN (imaging software)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution live cell imaging of subcellular structures

Durante mucho tiempo ha habido un equilibrio crucial entre la resolución espacial y temporal en las imágenes. Las imágenes más allá del límite de difracción de la luz se han restringido tradicionalmente para ser utilizadas solo en muestras fijas o células vivas fuera del tejido etiquetado con señal fluorescente fuerte. Las técnicas actuales de imagen de células vivas de súper resolución requieren el uso de sondas especiales de fluorescencia, alta iluminación, múltiples adquisiciones de imágenes con procesamiento posterior a la adquisición o, a menudo, una combinación de estos procesos. Estos requisitos previos limitan significativamente las muestras biológicas y los contextos a los que se puede aplicar esta técnica.
Aquí describimos un método para realizar super-resolución (~ 140 nm XY-resolución) tiempo de fluorescencia imágenes de células vivas in situ. Esta técnica también es compatible con baja intensidad fluorescente, por ejemplo, EGFP o mCherry endógenamente etiquetados en genes expresados humildemente. Como prueba de principio, hemos utilizado este método para visualizar múltiples estructuras subcelulares en el testículo de Drosophila. Durante la preparación del tejido, tanto la estructura celular como la morfología tisular se mantienen dentro del testículo diseccionado. Aquí, utilizamos esta técnica para obtener imágenes de la dinámica de los microtúbulos, las interacciones entre los microtúbulos y la membrana nuclear, así como la unión de los microtúbulos a los centrómeros.
Esta técnica requiere procedimientos especiales en la preparación de muestras, montaje de muestras e inmovilización de muestras. Además, los especímenes se deben mantener por varias horas después de la disección sin comprometer la función y la actividad celulares. Si bien hemos optimizado las condiciones para la obtención de imágenes de súper resolución en vivo específicamente en las células madre de la línea germinal masculina de Drosophila (GSCs) y las células germinales progenitoras en el tejido de testículo diseccionado, esta técnica es ampliamente aplicable a una variedad de diferentes tipos de células. La capacidad de observar las células bajo sus condiciones fisiológicas sin sacrificar la resolución espacial o temporal servirá como una herramienta invaluable para los investigadores que buscan abordar preguntas cruciales en biología celular.

La proyección de imagen viva de la célula más allá del límite de la difracción en tejido de Drosophila, especialmente para GSCs, proporciona una oportunidad de investigar la dinámica de eventos subcelulares en el contexto de la progresión del ciclo celular. Recientemente, un estudio que utiliza este protocolo ha mostrado que las actividades de los microtúbulos en el centrosoma de la madre contra el centrosoma de la hija son temporal asimétricas en GSCs10. El centrosoma de la mad...

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Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

Se presenta aquí un protocolo para la proyección de imagen de la vivir-célula de la super-resolución en tejido intacto. Hemos estandarizado las condiciones para la obtención de imágenes de una población de células madre adultas altamente sensibles en su entorno de tejido nativo. Esta técnica consiste en equilibrar la resolución temporal y espacial para permitir la observación directa de fenómenos biológicos en tejidos vivos.

Super-Resolución De Imágenes De Células Vivas De Estructuras Subcelulares

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Nuestro protocolo utiliza sondas de fluoróforo regulares y técnicas simples de preparación de muestras que mantienen la célula fotoda en condiciones fisiológicas para estudiar el proceso celular altamente dinámico y las estructuras subcelulares detalladas. Esta técnica nos permite investigar los procesos celulares a una súper resolución y en condiciones fisiológicas durante un período prolongado sin sacrificar la resolución especial o temporal. Comience cortando una membrana de diálisis de corte de peso molecular de 12 a 14 kilodalton en trozos pequeños y empapando los pedazos con 100 microlitros de medio celular vivo durante aproximadamente cinco minutos.Mientras las membranas están empapadas, corte el anillo exterior de un tubo de 50 mililitros en trozos pequeños y esterilice los trozos en etanol al 70%. Para la disección y el montaje de los testículos, transfiera diez moscas macho anestesiadas de dos a tres días de edad a un plato de disección bajo un microscopio de disección y use pórceps finos para eliminar los testículos. Cuando se hayan recogido todos los testículos, lave los testículos dos veces en medio de células vivas y use una punta de pipeta para extender de 100 a 150 microlitros de medio de células vivas al plato de fondo de vidrio preparado.Use pórceps finos para transferir los testículos de mosca al centro del plato y retire todos menos unos 10 microlitros del medio. Rápidamente, coloque la membrana pre-húmeda sobre los testículos y coloque de dos a tres pequeños pesos de plástico en la membrana. Inmediatamente, agregue de 100 a 150 microlitros de medio celular vivo fresco y coloque el anillo de nuevo en el lado elevado del plato.Coloque el resbalón de la cubierta de nuevo sobre el anillo y gire un pedazo de papel de seda en agua antes de colocar el papel en el resbalón de la cubierta. Luego, cubra el plato con una tapa y asegure el plato en el escenario de un microscopio de súper resolución. Para obtener imágenes de células madre de línea germinal, abra el software de imágenes y encienda la luz transmitida.Utilice el objetivo 63X para centrarse en el tejido de los testículos y encender los láseres. Haga clic en Vivo"para localizar las células madre germinales. Ajuste el enfoque y haga clic en Tamaño de fotograma"para establecer el tamaño de fotograma entre 512 por 512 y 1024 por 1024 píxeles, y Promediación"para establecer el promedio de fotogramas en uno o dos.Haga clic en Ganancia maestra"para establecer la ganancia de multiplicación de electrones en menos de 800, y láseres"para establecer la potencia del láser en 1%a 2%Zoom en la región o celda de interés para reducir el tiempo de adquisición de la imagen y para reducir el blanqueo de fotos, y confirme que la imagen se ha configurado de manera óptima antes de hacer clic en Iniciar experimento"para iniciar la captura de imagen de lapso de tiempo. Si Airyscan Acquisition no está configurado de forma óptima, haga clic en "Optimal" en las secciones de tamaño de fotograma, Z-Stack y Scan Area" y optimice el intervalo de tiempo, el número de Z slices y la duración de la proyección de imagen de lapso de tiempo, según el diseño experimental y el tipo de muestra. Después de la creación de imágenes, seleccione Procesamiento, Procesamiento por lotes y Procesamiento de Airyscan, y seleccione las imágenes que se van a procesar.A continuación, haga clic en Ejecutar proceso"para obtener las imágenes de super resolución. La proyección de imagen viva de la célula de los testículos del drosophila que expresan la tubulina alfa GFP en células de germen del primero tiempo usando un microscopio confocal del disco que gira, permite la visualización de la intensidad asimétrica de las señales de GFP en dos centrosomas, como señal más brillante en el centrosoma de la madre y una señal relativamente más débil en los centrosomas de la hija. La diferencia de brillo es probablemente reflejada por la asimetría temporal de la nucleación de los microtúbulos, pero la morfología detallada y la cantidad de los microtúbulos no se pueden resolver usando microscopía confocal de disco giratorio.Por el contrario, la proyección de imagen viva de la resolución estupenda de la célula permite la visualización y la cuantificación de la morfología y de los números del microtubule. Esta resolución mejorada también revela patrones de nucleación asimétrica de microtúbulos, elongación y aumento de la interacción con la membrana nuclear. La proyección de imagen viva de la célula también permite la visualización de la invaginación nuclear asimétrica de la membrana, pero no de los microtúbulos individuales que entran directamente en el núcleo.Por el contrario, esta técnica de súper resolución de células vivas permite la observación directa de estos eventos mediante imágenes simultáneas tanto de microtúbulos como de la lámina nuclear. Durante la metafase, ambos centrómeros hermanos pueden ser detectados como una sola señal usando microscopía de disco giratorio, aunque el accesorio central del microtúbulo no puede ser observado. En cambio, la proyección de imagen viva de la resolución estupenda permite la visualización del accesorio del centrómero del microtúbulo en la profase temprana.Asegúrese de colocar una membrana sobre los testículos para asegurarse de que no se muevan ni floten durante las imágenes y para optimizar la configuración del microscopio para evitar el fotoblanqueamiento y la toxicidad fotográfica. Hay muchas maneras en que este método se puede aplicar, como para investigar la dinámica de proteínas, el estrés lineal o las defensas y procesos celulares.

Research

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Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Las muestras de prueba para optimizar STORM Super-Resolución de Microscopía

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

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