Name: super-resolution live cell imaging of subcellular structures
Uploaded: 2021-01-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures at JoVE.com

Yazarlar, mikroskoplar ve veri analizi yazılımları için Johns Hopkins Üniversitesi'ndeki Entegre Görüntüleme Çekirdeği tesisine teşekkür eder. Düzeltme ve öneriler için J. Snedeker ve Q. E. Yu'ya ve yardımcı tartışmalar ve öneriler için X.C. laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz. NIGMS/NIH R35GM127075, Howard Hughes Tıp Enstitüsü, David ve Lucile Packard Vakfı ve Johns Hopkins Üniversitesi başlangıç fonları (X.C.

1. Canlı hücre görüntüleme kokteylinin hazırlanması (canlı hücre ortamı)
<ol><li>Schneider'ın Drosophila ortamını %15 fetal sığır serumu (FBS) ve 0.6x penisilin/streptomisin ile destekleyin. pH'ı yaklaşık 7,0 olarak ayarlayın.</li>
	<li>Ortamı kullanmadan hemen önce, 200 μg / mL'lik son konsantrasyona insülin ekleyin. NOT: Bu ortam, zaman atlamalı görüntüleme sırasında Drosophila testislerinin normal hücre bölünmesini ve gelişimini korumak için kritik öneme sahip...

<ol>
	<li>Breedijk, R. M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live-cell+super-resolution+technique+demonstrated+by+imaging+germinosomes+in+wild-type+bacterial+spores.">A live-cell super-resolution technique demonstrated by imaging germinosomes in wild-type bacterial spores.</a> Scientific Reports. 10 (1), 5312 (2020).</li><li>Maddox, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+mitotic+spindle.">Imaging the mitotic spindle.</a> Methods in Enzymology. 505, 81-103 (2012).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM):+A+method+for+super+resolution+fluorescence+imaging.">Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): A method for super resolution fluorescence imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (6), 075143 (2013).</li><li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics.">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nature Methods. 5 (5), 417-423 (2008).</li><li>Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+super-resolved+microscopy.">STED super-resolved microscopy.</a> Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).</li><li>Huff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Airyscan+detector+from+ZEISS:+confocal+imaging+with+improved+signal-to-noise+ratio+and+super-resolution.">The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution.</a> Nature Methods. 12 (12), (2015).</li><li>Huff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+2D+superresolution+mode+for+ZEISS+Airyscan.">The new 2D superresolution mode for ZEISS Airyscan.</a> Nature Methods. 14 (12), 1223 (2017).</li><li>Korobchevskaya, K., Lagerholm, B., Colin-York, H., Fritzsche, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+potential+of+Airyscan+microscopy+for+live+cell+imaging.">Exploring the potential of Airyscan microscopy for live cell imaging.</a> Photonics. 4 (4), 41 (2017).</li><li>Ranjan, R., Snedeker, J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+centromeres+differentially+coordinate+with+mitotic+machinery+to+ensure+biased+sister+chromatid+segregation+in+germline+stem+cells.">Asymmetric centromeres differentially coordinate with mitotic machinery to ensure biased sister chromatid segregation in germline stem cells.</a> Cell Stem Cell. 25 (5), 666-681 (2019).</li><li>Kahney, E. W., Ranjan, R., Gleason, R. J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+from+asymmetry+or+asymmetry+from+symmetry.">Symmetry from asymmetry or asymmetry from symmetry.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 82, 305-318 (2017).</li><li>Wooten, M., Ranjan, R., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+histone+inheritance+in+asymmetrically+dividing+stem+cells.">Asymmetric histone inheritance in asymmetrically dividing stem cells.</a> Trends in Genetics. 36 (1), 30-43 (2020).</li><li>Wooten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+histone+inheritance+via+strand-specific+incorporation+and+biased+replication+fork+movement.">Asymmetric histone inheritance via strand-specific incorporation and biased replication fork movement.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (8), 732-743 (2019).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Sivaguru, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+performance+of+airyscan+and+structured+illumination+superresolution+microscopy+in+the+study+of+the+surface+texture+and+3D+shape+of+pollen.">Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen.</a> Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).</li></ol>

Süper çözünürlüklü mikroskopi yöntemleri 10s nanometre4, 5,6kadar yüksek uzamsal çözünürlük sağlar. STORM ve PALM mikroskopi yöntemleri 20 ila 50 nm (XY çözünürlüğü) çözünürlüğe izin verirken, STED mikroskopisi 20 ila 100 nm (XY çözünürlüğü) çözünürlük sunar. SIM mikroskopinin mekansal çözünürlüğü 100 ila 130 nm15ile sınırlıdır. Ancak yüksek foton yoğunluğu ve uzu...

Canlı hücrelerdeki hücre altı yapıları ve protein dinamiklerini ışığın kırınım sınırının ötesinde çözünürlükle görselleştirmek genellikle çok zordur1-3. Stokastik-Optik Rekonstrüksiyon-Mikroskopi (STORM), Foto-Aktif-Lokalizasyon-Mikroskopi (PALM) ve Uyarılmış Emisyon-Tükenme (STED)4, 5,6mikroskopisi gibi birden fazla süper çözünürlüklü teknik geliştirilirken, numune hazırlamada komplikasyonların yanı sıra canlılık ve aktivite ex vivo'nun korunması ihtiyacı, canlı örneklerin görüntülenmesi için geleneksel süper çözünürlüklü mikroskopi kullanımını sınırlar. Konvansiyonel konfokal mikroskopi ~ 230 nm XY çözünürlüğünün ötesinde uzamsal çözünürlüğe ulaşamaz ve genellikle karmaşık hücresel alt yapıları gözlemlemek için yetersizdir5,6. Bununla birlikte, konfokal mikroskopide yeni bir gelişme olan Airyscan süper çözünürlüklü görüntüleme, yaklaşık 140 nm (XY çözünürlüklü)7,8 elde edebilir ve canlı görüntüleme ile uyumlu nispeten basit bir örnek preparata sahiptir. Bu görüntüleme algılama sistemi uzun bir alım süresi gerektirdiğinden, yüksek uzamsal çözünürlüğü zamansal çözünürlük9maliyetine gelir. Bu nedenle, canlı hücre görüntülemenin yüksek uzamsal çözünürlükle genişletilmesini sağlamak için bir yönteme ihtiyaç vardır.
Burada, ayrıntılı mekansal bilgilerle hücre altı yapıları deşifre etmek için canlı hücreleri sağlam dokuda en uygun çözünürlükte gözlemlemek için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, numunelerin hareket etmeden veya dejenere olmadan uzun bir süre (~ 10 saat) bıçaklanabilmesi için tasarlanmıştır. Bu teknikte kullanılan canlı hücre ortamı hücresel işlevi destekleyebilir ve süper çözünürlüklü bir mikroskop altında 10 saate kadar fotobleachingden kaçınabilir. Son olarak, bu protokol, lazerlerin hipoksi, nem ve sıcaklıktaki değişiklikler ve besin tükenmesi gibi uzun süre boyunca sürekli aydınlatılmasından kaynaklanan çoğu stresi en aza indirir.
Drosophila erkek germline kök hücrelerini (GSC) görüntülemek için bu protokolü kullanarak, mikrotübüllerin asimetrik aktivitesinin epigenetik olarak farklı kardeş kromatizatörleri10 , 11,12,13ile tercihli etkileşime nasıl izin verdiğini gözlemleyebildik. Bu tür hücresel olaylar son derece dinamiktir ve STORM, PALM veya STED gibi diğer süper çözünürlüklü görüntüleme yöntemlerini kullanarak canlı hücrelerde görselleştirmek çok zordur. Dokularda bulunan canlı hücrelerin dinamik hücre altı yapılarını anlamayı amaçlayan bu yöntemin hücre biyologları için oldukça yararlı hale geleceğini öngörüyoruz. Proteinlerin dinamiklerini incelemek gibi bu yöntemin uygulanabileceği birçok alan vardır; hücrelerin hareketini anlamak; ve diğer olası uygulamaların yanı sıra soy izleme ve hücresel farklılaşma süreçleri.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator CS6 (figure making software)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane</td>
			<td>Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane</td>
			<td>Cat No. 08-67121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat. no. 26140079</td>
			<td>15% (V/V)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (analysis software)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image fluorescence intensity quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom cell culture dishes (FluroDish)</td>
			<td>World Precision Instrument, Inc.</td>
			<td>FD35PDL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris (image reconstruction software)</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>3D image reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imerssion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Immersol 518F/30 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. No. 15550</td>
			<td>200 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat No. - 15140-122</td>
			<td>0.6x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider Drosophila media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat No. - 11720-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue paper</td>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Wet to form humid chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN (imaging software)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution live cell imaging of subcellular structures

Görüntülemede mekansal ve zamansal çözünürlük arasında uzun zamandır önemli bir denge vardır. Işığın kırınım sınırının ötesinde görüntüleme, geleneksel olarak sadece sabit numunelerde veya güçlü floresan sinyalle etiketlenmiş doku dışındaki canlı hücrelerde kullanılmak üzere kısıtlanmıştır. Mevcut süper çözünürlüklü canlı hücre görüntüleme teknikleri, özel floresan problarının, yüksek aydınlatmanın, alım sonrası işlemle birden fazla görüntü alımının veya genellikle bu süreçlerin bir kombinasyonunun kullanılmasını gerektirir. Bu önkoşullar, bu tekniğin uygulanabileceği biyolojik örnekleri ve bağlamları önemli ölçüde sınırlar.
Burada süper çözünürlüklü (~140 nm XY çözünürlüklü) zaman atlamalı floresan canlı hücre görüntüleme in situ gerçekleştirmek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu teknik aynı zamanda düşük floresan yoğunluğu ile de uyumludur, örneğin EGFP veya mCherry düşük eksprese genlerde endojen olarak etiketlenmiştir. İlke kanıtı olarak, Drosophila testislerindeki birden fazla hücre altı yapıyı görselleştirmek için bu yöntemi kullandık. Doku hazırlama sırasında, incelenmiş testisler içinde hem hücresel yapı hem de doku morfolojisi korunur. Burada, mikrotübül dinamiklerini, mikrotübüller ve nükleer membran arasındaki etkileşimleri ve mikrotübüllerin merkezkantlara bağlanmasını görüntülemek için bu tekniği kullanıyoruz.
Bu teknik, numune hazırlama, numune montajı ve numunelerin hareketsiz hale alınmasında özel prosedürler gerektirir. Ek olarak, numuneler diseksiyondan sonra hücresel işlevden ve aktiviteden ödün vermeden birkaç saat boyunca tutulmalıdır. Özellikle Drosophila erkek germline kök hücrelerinde (GSC' ler) ve diseksiyonlu testis dokusundaki progenitor mikrop hücrelerinde canlı süper çözünürlüklü görüntüleme koşullarını optimize etmiş olsak da, bu teknik çeşitli hücre tipleri için yaygın olarak geçerlidir. Hücreleri mekansal veya zamansal çözünürlüklerden ödün vermeden fizyolojik koşulları altında gözlemleyebilmeleri, hücre biyolojisinde önemli soruları ele almak isteyen araştırmacılar için paha biçilmez bir araç olarak hizmet edecektir.

Drosophila dokusunda, özellikle GSC'ler için kırınım sınırının ötesinde canlı hücre görüntüleme, hücre döngüsünün ilerlemesi bağlamında hücre altı olayların dinamiklerini araştırma fırsatı sağlar. Son zamanlarda, bu protokolü kullanan bir çalışma, anne centrozomunda ve kız centrozomunda mikrotübül faaliyetlerinin GSCs10'dazamansal asimetrik olduğunu göstermiştir. Anne merkezkantları mitotik girişe yaklaşık 4 saat kala mikrotübüller yaydırır,...

Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures at JoVE.com

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

Burada, bozulmamış dokuda süper çözünürlüklü canlı hücre görüntüleme için bir protokol sunulmaktadır. Son derece hassas bir erişkin kök hücre popülasyonunu doğal doku ortamında görüntüleme koşullarını standartlaştırdık. Bu teknik, biyolojik olayların canlı dokuda doğrudan gözlemlenmesine izin vermek için zamansal ve mekansal çözünürlüğü dengelemeyi içerir.

Hücre Altı Yapıların Süper Çözünürlüklü Canlı Hücre Görüntülemesi

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Protokolümüz, son derece dinamik hücresel süreci ve ayrıntılı alt hücresel yapıları incelemek için görüntülenmiş hücreyi fizyolojik durumda tutan düzenli florofor probları ve basit numune hazırlama teknikleri kullanır. Bu teknik, hücresel süreçleri süper çözünürlükte ve fizyolojik koşullar altında, özel veya geçici çözünürlükten ödün vermeden uzun bir süre boyunca araştırmamızı sağlar. 12 ila 14 kilodalton moleküler ağırlık kesme diyaliz zarını küçük parçalara ayırarak ve parçaları yaklaşık beş dakika boyunca 100 mikrolitre canlı hücre ortamı ile ıslatarak başlayın.Zarlar ıslanırken, 50 mililitrelik bir tüpün dış halkasını küçük parçalar halinde kesin ve parçaları% 70 etanolde sterilize edin. Testis diseksiyonu ve montajı için, on iki ila üç günlük uyuşturulma erkek sineklerini bir diseksiyon mikroskobu altında bir diseksiyon kabına aktarın ve testisleri çıkarmak için ince forseps kullanın. Tüm testisler toplandığında, testisleri canlı hücre ortamında iki kez yıkayın ve hazırlanan cam alt tabağa 100 ila 150 mikrolitre canlı hücre ortamı yaymak için bir pipet ucu kullanın.Sinek testlerini yemeğin ortasına aktarmak ve ortamın yaklaşık 10 mikrolitresi hariç hepsini çıkarmak için ince tokalar kullanın. Hızlı bir şekilde, önceden ıslatılanmış membranı testislerin üzerine yerleştirin ve membranın üzerine iki ila üç küçük plastik ağırlık yerleştirin. Hemen, 100 ila 150 mikrolitre taze canlı hücre ortamı ekleyin ve halkayı yemeğin yükseltilmiş tarafına geri yerleştirin.Kapak fişini halkaya geri yerleştirin ve kağıdı kapak fişine yerleştirmeden önce bir kağıt parçasını suda döndürün. Ardından, kabı bir kapakla örtün ve kabı süper çözünürlüklü bir mikroskop sahnesinde sabitleyin. Germline kök hücre görüntüleme için görüntüleme yazılımını açın ve iletilen ışığı açın.Testis dokusuna odaklanmak ve lazerleri açmak için 63X hedefini kullanın. Germinal kök hücreleri bulmak için Live"ı tıklatın. Odağı ayarlayın ve kare boyutunu 512 x 512 ve 1024 arasında 1024 piksel olarak ayarlamak için Kare Boyutu"nu ve kare ortalamasını bir veya iki olarak ayarlamak için Ortalama"yı tıklatın.Elektron çarpma kazancını 800'ün altına ayarlamak için Master Gain"i ve lazer gücünü ayarlamak için "görüntü alma süresini azaltmak ve fotoğraf ağartma süresini azaltmak için lazer gücünü bölgeye veya ilgi hücresine yakınlaştırmak ve zaman atlamalı görüntü yakalamayı başlatmak için Denemeyi Başlat'a tıklamadan önce görüntünün en iyi şekilde yapılandırıldığını onaylamak için" tıklayın. Airyscan Acquisition en iyi şekilde yapılandırılmamışsa" görüntülenirse, çerçeve boyutu, Z-Stack ve Tarama Alanı"bölümlerinde Optimal"i tıklatın ve deneysel tasarıma ve numune türüne göre zaman aralığını, Z dilimlerinin sayısını ve zaman atlamalı görüntüleme süresini optimize edin. Görüntülemeden sonra İşleme, Toplu İşleme ve Klima İşleme'yi seçin ve işlenecek görüntüleri seçin.Ardından, süper çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için İşlemi Çalıştır"ı tıklayın. Dönen disk konfokal mikroskop kullanarak erken evre mikrop hücrelerinde alfa tübulin GFP'yi ifade eden drosophila testislerinin canlı hücre görüntülemesi, anne merkezli daha parlak bir sinyal ve kız santigomlarında nispeten daha zayıf bir sinyal olarak GFP sinyallerinin asimetrik yoğunluğunun iki centrosomes'ta görselleştirilmesini sağlar. Parlaklık farkı muhtemelen mikrotübül çekirdeğinin zamansal asimetrisi tarafından yansıtılır, ancak mikrotübüllerin ayrıntılı morfolojisi ve miktarı dönen disk konfokal mikroskopisi kullanılarak çözülemez.Buna karşılık, canlı hücre süper çözünürlüklü görüntüleme, mikrotübül morfolojisinin ve sayılarının görselleştirilmesine ve nicelleştirilmesine izin verir. Bu geliştirilmiş çözünürlük aynı zamanda asimetrik mikrotübül çekirdeklenme, uzama ve nükleer membranla artan etkileşim kalıplarını da ortaya koymaktadır. Canlı hücre görüntüleme ayrıca asimetrik nükleer membran invaginasyonunun görselleştirilmesine izin verir, ancak çekirdeğe doğrudan giren bireysel mikrotübüllerin görselleştirilmesine izin verir.Buna karşılık, bu canlı hücre süper çözünürlük tekniği, hem mikrotübüllerin hem de nükleer laminanın eşzamanlı olarak görüntülenmesi ile bu olayların doğrudan gözlemlenmesine izin verir. Metafaz sırasında, her iki kardeş centromeres, dönen disk mikroskopisi kullanılarak tek bir sinyal olarak tespit edilebilir, ancak mikrotübül merkezi ataşmanı gözlenemez. Buna karşılık, süper çözünürlüklü canlı görüntüleme, mikrotübül santromer ataşmanının erken profazda görselleştirilmesini sağlar.Görüntüleme sırasında hareket etmediklerinden veya yüzdüğünden emin olmak ve fotoğraf ağartma ve fotoğraf toksisitesini önlemek için mikroskop ayarlarını optimize etmek için testislerin üzerine bir zar yerleştirin. Protein dinamiklerini, doğrusal stresi veya hücresel savunma ve süreçleri araştırmak gibi bu yöntemin uygulanabileceği birçok yol vardır.

Research

JoVE Journal

Biology

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bakteriyel Bölümü Makine Super çözünürlüklü Görüntüleme

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Optimize STORM Süper Çözünürlük Mikroskopi Testi Örnekleri

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

Görüntüleme Hücre Membran Hasarı ve Onarımı ilgilendim hücrealtı Süreçleri

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Hızlı 3D-Yapılandırılmış Aydınlatma mikroskopi ile Canlı Bakteri Cytokinetic Z Yüzük Süper çözünürlük Görüntüleme (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins

Canlı hücre görüntüleme modları giriş ve Antifungal bitki Defensins hücre altı yerelleştirme araştırmak için mantar hücrelerinin

Small cysteine-rich defensins are one of the largest groups of host defense peptides present in all plants. Many plant defensins exhibit potent in vitro ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Memeli hücrelerinde devlet tükenmesi süper kararlılık düşsel yer

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

Yüksek hızlı süper çözünürlük hızı mikroskobu canlı birincil Cilium içinde uygulanması

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...