Name: mapping the structure-function relationships of disordered oncogenic transcription factors using transcriptomic analysis
Uploaded: 2020-06-27T15:00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis at JoVE.com

تم دعم هذا البحث من قبل مرفق الحوسبة عالية الأداء في معهد أبحاث أبيغيل ويكسنر في مستشفى الأطفال على مستوى البلاد. وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة [U54 CA231641 إلى SLL، R01 CA183776 إلى SLL]؛ مؤسسة أليكس موقف عصير الليمون [جائزة المحقق الشاب لERT]؛ بيلوتونيا [زمالة إلى ERT]؛ والمجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية CJ مارتن في الخارج زمالة الطب الحيوي [APP1111032 إلى KIP].

<ol>
	<li>Miettinen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fusion+sarcomas:+histopathology+and+clinical+significance+of+selected+entities.">New fusion sarcomas: histopathology and clinical significance of selected entities.</a> Human Pathology. 86, 57-65 (2019).</li><li>Knott, M. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+undruggable:+exploiting+neomorphic+features+of+fusion+oncoproteins+in+childhood+sarcomas+for+innovative+therapies.">Targeting the undruggable: exploiting neomorphic features of fusion oncoproteins in childhood sarcomas for innovative therapies.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 38, 625-642 (2019).</li><li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+and+therapeutic+relevance+of+cancer-associated+transcript+fusions.">The landscape and therapeutic relevance of cancer-associated transcript fusions.</a> Oncogene. 34, 4845-4854 (2015).</li><li>Duesberg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+genes+generated+by+rare+chromosomal+rearrangements+rather+than+activation+of+oncogenes.">Cancer genes generated by rare chromosomal rearrangements rather than activation of oncogenes.</a> Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 4, 163-175 (1987).</li><li>Dupain, C., Harttrampf, A. C., Urbinati, G., Geoerger, B., Massaad-Massade, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+Fusion+Genes+in+Pediatric+Cancers:+Toward+Precision+Medicine.">Relevance of Fusion Genes in Pediatric Cancers: Toward Precision Medicine.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 315-326 (2017).</li><li>Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+translocations+and+gene+fusions+on+cancer+causation.">The impact of translocations and gene fusions on cancer causation.</a> Nature Reviews Cancer. 7, 233-245 (2007).</li><li>Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+of+EWS/FLI+identifies+NKX2.2+as+a+critical+target+gene+in+Ewing's+sarcoma.">Expression profiling of EWS/FLI identifies NKX2.2 as a critical target gene in Ewing's sarcoma.</a> Cancer Cell. 9, 405-416 (2006).</li><li>Davicioni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+PAX-FKHR+gene+expression+signature+that+defines+molecular+classes+and+determines+the+prognosis+of+alveolar+rhabdomyosarcomas.">Identification of a PAX-FKHR gene expression signature that defines molecular classes and determines the prognosis of alveolar rhabdomyosarcomas.</a> Cancer Research. 66, 6936-6946 (2006).</li><li>Gr&#246;bner, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+genomic+alterations+across+childhood+cancers.">The landscape of genomic alterations across childhood cancers.</a> Nature. 555, 321-327 (2018).</li><li>Kim, J., Pelletier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+chromosome+translocations+involving+EWS+and+related+family+members.">Molecular genetics of chromosome translocations involving EWS and related family members.</a> Physiological Genomics. 1, 127-138 (1999).</li><li>Boulay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-Specific+Retargeting+of+BAF+Complexes+by+a+Prion-like+Domain.">Cancer-Specific Retargeting of BAF Complexes by a Prion-like Domain.</a> Cell. 171, 163-178 (2017).</li><li>Lessnick, S. L., Braun, B. S., Denny, C. T., May, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+domains+mediate+transformation+by+the+Ewing&#8217;s+sarcoma+EWS/FLI-1+fusion+gene.">Multiple domains mediate transformation by the Ewing&#8217;s sarcoma EWS/FLI-1 fusion gene.</a> Oncogene. 10, 423-431 (1995).</li><li>Leach, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia+fusion+target+AF9+is+an+intrinsically+disordered+transcriptional+regulator+that+recruits+multiple+partners+via+coupled+folding+and+binding.">Leukemia fusion target AF9 is an intrinsically disordered transcriptional regulator that recruits multiple partners via coupled folding and binding.</a> Structure. 21, 176-183 (2013).</li><li>Ng, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+aromatic+side+chains+within+a+disordered+structure+are+critical+for+transcription+and+transforming+activity+of+EWS+family+oncoproteins.">Multiple aromatic side chains within a disordered structure are critical for transcription and transforming activity of EWS family oncoproteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 104, 479-484 (2007).</li><li>Riggi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EWS-FLI1+Divergent+Chromatin+Remodeling+Mechanisms+to+Directly+Activate+or+Repress+Enhancer+Elements+in+Ewing+Sarcoma.">EWS-FLI1 Divergent Chromatin Remodeling Mechanisms to Directly Activate or Repress Enhancer Elements in Ewing Sarcoma.</a> Cancer Cell. 26, 668-681 (2014).</li><li>Tomazou, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenome+Mapping+Reveals+Distinct+Modes+of+Gene+Regulation+and+Widespread+Enhancer+Reprogramming+by+the+Oncogenic+Fusion+Protein+EWS-FLI1.">Epigenome Mapping Reveals Distinct Modes of Gene Regulation and Widespread Enhancer Reprogramming by the Oncogenic Fusion Protein EWS-FLI1.</a> Cell Reports. 10, 1082-1095 (2015).</li><li>Sankar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+relevance+of+EWS/FLI-mediated+transcriptional+repression+in+Ewing+sarcoma.">Mechanism and relevance of EWS/FLI-mediated transcriptional repression in Ewing sarcoma.</a> Oncogene. 32, 5089-5100 (2013).</li><li>Gangwal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsatellites+as+EWS/FLI+response+elements+in+Ewing's+sarcoma.">Microsatellites as EWS/FLI response elements in Ewing's sarcoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105, 10149-10154 (2008).</li><li>Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+Properties+of+EWS/FLI+Regulation+via+GGAA+Microsatellites+in+Ewing's+Sarcoma.">Emergent Properties of EWS/FLI Regulation via GGAA Microsatellites in Ewing's Sarcoma.</a> Genes &amp; Cancer. 1, 177-187 (2010).</li><li>Guillon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Oncogenic+EWS-FLI1+Protein+Binds+In+Vivo+GGAA+Microsatellite+Sequences+with+Potential+Transcriptional+Activation+Function.">The Oncogenic EWS-FLI1 Protein Binds In Vivo GGAA Microsatellite Sequences with Potential Transcriptional Activation Function.</a> PLoS One. 4, 4932 (2009).</li><li>Chong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+and+selective+low-complexity+domain+interactions+that+control+gene+transcription.">Imaging dynamic and selective low-complexity domain interactions that control gene transcription.</a> Science. 361, (2018).</li><li>Johnson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+EWS+domain+of+EWS/FLI+in+binding+GGAA-microsatellites+required+for+Ewing+sarcoma+anchorage+independent+growth.">Role for the EWS domain of EWS/FLI in binding GGAA-microsatellites required for Ewing sarcoma anchorage independent growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114, 9870-9875 (2017).</li><li>Theisen, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+functionally+maps+the+intrinsically+disordered+domain+of+EWS/FLI+and+reveals+novel+transcriptional+dependencies+for+oncogenesis.">Transcriptomic analysis functionally maps the intrinsically disordered domain of EWS/FLI and reveals novel transcriptional dependencies for oncogenesis.</a> Genes &amp; Cancer. 10, 21-38 (2019).</li><li>Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToppGene+Suite+for+gene+list+enrichment+analysis+and+candidate+gene+prioritization.">ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization.</a> Nucleic Acids Research. 37, 305-311 (2009).</li><li>Johnson, K. M., Taslim, C., Saund, R. S., Lessnick, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+types+of+GGAA-microsatellites+and+their+roles+in+EWS/FLI+binding+and+gene+regulation+in+Ewing+sarcoma.">Identification of two types of GGAA-microsatellites and their roles in EWS/FLI binding and gene regulation in Ewing sarcoma.</a> PLOS One. 12, 0186275 (2017).</li><li>Kim, P., Ballester, L. Y., Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+retention+in+transcription+factor+fusion+genes+and+its+biological+and+clinical+implications:+a+pan-cancer+study.">Domain retention in transcription factor fusion genes and its biological and clinical implications: a pan-cancer study.</a> Oncotarget. 8, 110103-110117 (2017).</li><li>de Mend&#237;bil, I. O., Vizmanos, J. L., Novo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+Selection+in+Fusion+Transcripts+Resulting+from+Chromosomal+Translocations+in+Human+Cancer.">Signatures of Selection in Fusion Transcripts Resulting from Chromosomal Translocations in Human Cancer.</a> PLOS One. 4, 4805 (2009).</li><li>Frenkel-Morgenstern, M., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+domain+combinations+in+proteins+encoded+by+chimeric+transcripts.">Novel domain combinations in proteins encoded by chimeric transcripts.</a> Bioinformatics. 28, 67-74 (2012).</li><li>Hegyi, H., Buday, L., Tompa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Structural+Disorder+Confers+Cellular+Viability+on+Oncogenic+Fusion+Proteins.">Intrinsic Structural Disorder Confers Cellular Viability on Oncogenic Fusion Proteins.</a> PLoS Computational Biology. 5, 1000552 (2009).</li><li>Latysheva, N. S., Babu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+and+understanding+oncogenic+gene+fusions+through+data+intensive+computational+approaches.">Discovering and understanding oncogenic gene fusions through data intensive computational approaches.</a> Nucleic Acids Research. 44, 4487-4503 (2016).</li><li>Deneen, B., Denny, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+p16+pathways+stabilizes+EWS/FLI1+expression+and+complements+EWS/FLI1+mediated+transformation.">Loss of p16 pathways stabilizes EWS/FLI1 expression and complements EWS/FLI1 mediated transformation.</a> Oncogene. 20, 6731-6741 (2001).</li><li>Kendall, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX3-FOXO1+transgenic+zebrafish+models+identify+HES3+as+a+mediator+of+rhabdomyosarcoma+tumorigenesis.">PAX3-FOXO1 transgenic zebrafish models identify HES3 as a mediator of rhabdomyosarcoma tumorigenesis.</a> eLife. 7, 33800 (2018).</li></ol>

تعلن شركة SLL عن تضارب في المصالح كعضو في المجلس الاستشاري لشركة سالاريوس للأدوية وصاحب أسهم فيها. SLL هو أيضا مخترع المدرجة على الولايات المتحدة براءات الاختراع رقم. الولايات المتحدة 7,393,253 B2, "طرق وتكوينات لتشخيص وعلاج ساركوما يوينغ," والولايات المتحدة 8,557,532, "تشخيص وعلاج ساركوما يوينغ المقاومة للأدوية." وهذا لا يغير من التزامنا بسياسات JoVE بشأن مشاركة البيانات والمواد.

دراسة الآليات الكيميائية الحيوية لعوامل النسخ الأورام من المهم للغاية لفهم الأمراض التي تسببها وتصميم استراتيجيات علاجية جديدة. ويصدق هذا بشكل خاص في الأورام الخبيثة التي تتميز بنقل الكروموسومات مما يؤدي إلى عوامل نسخ الانصهار. المجالات المدرجة في هذه البروتينات الشميريك قد تفتقر إلى تفاعلات ذات مغزى مع المجالات التنظيمية الموجودة في البروتينات البرية من نوع, تعقيد القدرة على تفسير المعلومات هيكل وظيفة في سياق الانصهار26,27,28. وعلاوة على ذلك، تتميز العديد من هذه الاندماجات oncogenic من قبل المجالات اضطراب في جوهرها منخفضة التعقيد10،13،29،30.
مجال EWS هو مثال على مثل هذا المجال المضطرب في جوهره الذي يشارك في مجموعة متنوعة من الاندماجات أونكوجينيك10. وقد أعاقت الطبيعة المضطربة والمتكررة في جوهرها الجهود الرامية إلى فهم الآليات الجزيئية المستخدمة في مجال EWS. وقد لجأت الجهود السابقة للتحقيق في وظيفة الهيكل إلى حد كبير إلى استخدام المسوخ المختلفة في سياق المقايسات الجينية المراسل أو في خلفيات الخلايا التي تفشل في تلخيص السياق الخلوي ذي الصلة ، أو تفتقر إلى أي اختلافات هيكلية تنتج وظيفة جزئية ذات مغزى11،17،25. الأسلوب المعروض هنا يعالج هذه المشكلات. يتم إجراء رسم خرائط وظيفة الهيكل في سياق الخلية ذات الصلة بالمرض ويمكن تسلسل الجيل التالي التنميط النسخي من تقييم وظيفة عامل النسخ في إعداد الكروماتين الأصلي. في الحالة المحددة للمتحول DAF من EWS / FLI ، أفيد DAF لإظهار القليل من النشاط في المقايسات مراسل باستخدام عناصر استجابة معزولة ، ولكن لإظهار النشاط في سياق المروج الجيني الكامل ، سواء في مقايسة مراسل أو في الكروماتين الأصلي ، مما يشير إلى النمط الظاهري مثيرة للاهتمام23. باستخدام الطريقة الموصوفة هنا بشكل مباشر أكثر يحل مسألة أي نوع من العناصر التنظيمية عبر الجينوم هي الأكثر استجابة في إعداد المرض. من خلال اختبار جميع الجينات المستهدفة المرشحة في سياق الكروماتين الأصلي في وقت واحد ، من المرجح أن يحدد النهج النسخي البنى ذات الوظيفة الجزئية.
القوة الكامنة في استخدام خلفية الخلية ذات الصلة بالمرض ربما يكون أكبر قيد على هذه التقنية. أحد أهم العوامل هو اختيار نظام الخلية المناسب لهذه التجارب. العديد من خطوط الخلايا المستمدة من الأورام الخبيثة مع عوامل النسخ pathognomonic لا تتسامح بسهولة ضربة قاضية من عامل النسخ هذا، وفي كثير من الحالات، وخاصة بالنسبة لسرطانات الأطفال، والخلية الحقيقية للأصل لا تزال مثيرة للجدل والتعبير عن oncogene في خلفيات الخلايا الأخرى سامة للغاية31،32 . في هذه الحالات، قد يكون من المفيد إجراء تجارب في خلفية خلية مختلفة، طالما أن الباحث يتوخى الحذر في تفسير النتائج ويتحقق بشكل مناسب من صحة أي نتائج ذات صلة في نوع خلية أكثر ملاءمة للمرض.
من المهم للغاية التحقق بعناية من الاستقرار والعواقب الظاهرية للتعبير عن oncogene وتقديم عينات فقط للتسلسل التي تلبي معايير صارمة. هنا، وهذا يشمل لطخة الغربية لتأكيد الضربة القاضية والإنقاذ، وqRT-PCR من عدد قليل من الجينات المستهدفة المعروفة للتحقق من صحة السيطرة الإيجابية(الشكل 2). وبالمثل من الأهمية بمكان تقليل أكبر قدر ممكن من التباين الدفعي من خلال إجراء استعدادات الخلية والجيش الملكي النيبالي بعناية على نحو مماثل قدر الإمكان من خلال كل دفعة.
تصبح الطريقة الموصوفة هنا قوية بشكل خاص عندما تقترن بأنواع أخرى من البيانات الجينومية التي تتحدث عن وظيفة عامل النسخ قيد الدراسة على نطاق الجينوم. وستتوسع الاتجاهات المستقبلية لهذا النوع من تحليل وظيفة الهيكل لتشمل ChIP-seq و ATAC-seq لتحديد ربط عامل النسخ وأي تغييرات مستحثة في إمكانية الوصول إلى الكروماتين. كجناح، يمكن أن يشير هذا النوع من البيانات إلى حيث المكونات الهيكلية المختلفة لعامل النسخ على نحو مركب تسهم في جوانب مختلفة من وظيفة (أي ربط الحمض النووي مقابل تعديل الكروماتين مقابل التوظيف المنظم المشترك). وعموما، فإن استخدام النهج القائمة على NGS لرسم خريطة للعلاقات بين الهيكل والوظيفة لعوامل نسخ الاندماج يمكن أن يكشف عن رؤى جديدة في المحددات الكيميائية الحيوية لوظيفة أونوجينيك لهذه البروتينات. وهذا أمر مهم لتعزيز فهمنا للأمراض التي تسببها وفي تمكين وضع استراتيجيات علاجية جديدة.

وتتميز مجموعة فرعية من السرطانات، بما في ذلك العديد من الأورام الخبيثة في مرحلة الطفولة والمراهقة، عن طريق نقل الكروموسومات التي تولد oncogenes الانصهار رواية1،2،3،4،5،6. بروتينات الانصهار الناتجة كثيرا ما تعمل كعوامل النسخ أونوجينيك، وتنظيم تغييرات واسعة النطاق في التنظيم النسخي لتعزيز الورم7،8. السرطانات مع هذه النقلات تمتلك عادة المناظر الطبيعية الطفرات هادئة خلاف ذلك، مع عدد قليل من الانحرافات الجينومية المتكررة جانبا من الانصهار pathognomonic4،9. على هذا النحو ، فإن استهداف بروتين الانصهار مباشرة هو استراتيجية علاجية جذابة في هذه الأمراض. ومع ذلك ، فإن عوامل النسخ أونكوجيني هذه تتكون عادة من نطاق منخفض التعقيد ، مضطرب في جوهره ، تنشيط نسخي تنصهر مع مجال الحمض النووي ملزمة (DBD)10،11،12،13،14. وقد ثبت أن كلا من المجالات المضطربة في جوهرها (IDDs) وDBDs من هذه البروتينات من الصعب استهدافها بالنهج الدوائية التقليدية. ولذلك، فإن تطوير نهج علاجية جديدة يتطلب فهما جزيئيا أكثر تفصيلا للآليات التي تستخدمها هذه الاندماجات لتنظيم التعبير الجيني بشكل شاذ.
ويندمج عادة جزء N-TERMINAL IDD من EWSR1 إلى DBD في السرطان ، بما في ذلك EWS / FLI في ساركوما Ewing ، EWS / WT1 في ورم الخلايا المستديرة الصغيرة المنتشرة ، وEWS / ATF1 في ساركوما الخلايا الواضحة من الأجزاء الناعمة10. الدور الآلي ل EWS IDD في كل من هذه الاندماجات غير مفهوم بشكل كامل. عائلة EWS / ETS من الانصهار ، وتحديدا EWS / FLI ، هي الأكثر تميزا وظيفيا حتى الآن. EWS / FLI ينسق الجينوم على نطاق التغيرات اللاجينية والنسخية مما يؤدي إلى تنشيط وقمع الآلاف من الجينات7،11،15،16. وقد أظهرت الدراسات أن معرف مهم لتوظيف كل من النسخ المشارك المنشط (مثل P300، WDR5، ومجمع BAF)، فضلا عن المكبوتين المشاركين (مثل مجمع NuRD)11،15،17. إن دمج معرف EWS إلى الجزء C-terminal من FLI1 يمنح خصوصية جديدة لربط الحمض النووي لETS DBD من FLI1 ، بحيث يرتبط بروتين الدمج (EWS / FLI) بالمناطق المتكررة من GGAA-microsatellite من الجينوم بالإضافة إلى توافق الآراء ETS motif18و19و20. جنبا إلى جنب مع وظيفة التوظيف المنشط المشارك، هذا النشاط الناشئة الحمض النووي ملزمة من EWS / FLI يعزز تشكيل محسن دي نوفو في GGAA-microsatellites distal إلى مواقع بدء النسخ (TSS) ("محسن مثل" الأقمار الصناعية الدقيقة) ويجند RNA بوليمراز الثاني لتعزيز النسخ في GGAA-microsatellites قريبة لSSS ("المروج مثل" الأقمار الصناعية الصغيرة)11،15،16،21.
وقد أدت هذه البيانات مجتمعة إلى افتراض أن العناصر المنفصلة داخل نطاق EWS تساهم في توظيف المنظمين المشاركين المتميزين في أنواع مختلفة من مواقع الربط EWS/FLI. ومع ذلك، فإن تمييز هذه العناصر داخل الجزء EWS من EWS/FLI، وكيفية عملها، قد أعاقته الطبيعة المتكررة والمضطربة للغاية للمجال. هنا نستخدم نظام إنقاذ بالضربة القاضية المنشور سابقا في خلايا ساركوما Ewing لرسم خريطة وظيفية لهذه العناصر في معرف EWS. في هذا النظام يتم استنفاد EWS / FLI باستخدام shRNA استهداف 3'UTR من الجين FLI1، ويتم إنقاذ التعبير مع متفاوتة EWS / FLI متحولة cDNA يبني تفتقر إلى 3'UTR7،17،22. ركزت هذه التجارب على البنى ذات الحذف المختلفة لرسم خريطة للعلاقة بين الهيكل والوظيفة بين معرف EWS والأنماط الظاهرية الهامة ، بما في ذلك تنشيط بناء مراسل GGAA-microsatellite ، ومقايسات تشكيل المستعمرة ، والتحقق المستهدف من EWS / FLI - تنشيط والجينات المكبوتة7،17،22 . ومع ذلك، فشلت هذه الدراسات في العثور على مجالات فرعية منفصلة داخل معرف EWS في EWS/FLI التي تعتبر مهمة بشكل فريد للتنشيط أو القمع. وكانت جميع البنى المختبرة إما قادرة على تنشيط وقمع جينات مستهدفة محددة ، مما يؤدي إلى تكوين مستعمرة فعالة ، أو غير قادرة على تنظيم أي من الجينات المستهدفة EWS / FLI ، مما يؤدي إلى فقدان تكوين المستعمرة7و17و22.
وتستخدم عادة التحليلات النسخية التي يتيحها اعتماد تسلسل الجيل التالي على نطاق واسع لمقارنة توقيعات التعبير الجيني في شرطين، في كثير من الأحيان في سياق الفحص أو الدراسات الوصفية. أردنا بدلا من ذلك الاستفادة من القدرة على التقاط بيانات التعبير على نطاق الجينوم باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) لتوصيف مساهمات ال IDDs في وظيفة عامل النسخ. في هذه الحالة يتم إقران RNA-seq مع نظام الإنقاذ بالضربة القاضية لاستكشاف العلاقة بين الهيكل والوظيفة في مجال EWS. ينطبق هذا النهج على عوامل النسخ الانصهار الأخرى ، بما في ذلك الانصهارات الأخرى EWS أو عوامل النسخ البرية ذات الوظيفة غير المفهومة جيدا ، ولها مزايا متعددة على المقايسات الأخرى المستخدمة لدراسات رسم الخرائط الوظيفية ، مثل مقايسات المراسل أو qRT-PCR المستهدفة. وتشمل هذه العوامل اختبار المحددات الهيكلية للوظيفة في سياق الكروماتين ذي الصلة، والقدرة على اختبار أنواع متعددة من عناصر الاستجابة في تقييم واحد (أي تنشيطها وقمعها، والسواتل الصغيرة GGAA وغير الصغيرة، وما إلى ذلك)، والقدرة الناتجة على الكشف بشكل أفضل عن الوظيفة الجزئية.
يعتمد التنفيذ الناجح لهذا النهج على نظام قائم على الخلايا يلتقط الأنماط الظاهرية للاهتمام (في هذه الحالة خلايا A673 مع استنفاد EWS /FLI بوساطة shRNA) ، ولوحة من البنى المتحولة في متجه تعبير مناسب للنظام القائم على الخلية (في هذه الحالة ، pMSCV-hygro مع مختلف المسوخ EWS / FLI الموسومة ب 3x-FLAG ليتم تسليمها عن طريق النقل التحديثي). يوصى بالانبعال الفيروسي إما لبنى الاستنفاد المستندة إلى CRISPR ، وبنى الاستنفاد المستندة إلى shRNA ، وبنى تعبير cDNA مع التحديد المناسب لتوليد خطوط خلايا مستقرة على العدوى العابرة. يتم تعزيز التفسير النهائي للنتائج عندما يمكن إقران البيانات النسخية ببيانات أخرى تتعلق بتوطين عامل النسخ وقراءات أخرى فينوتيبيك حيثما كان ذلك متاحا.
في هذه الورقة، ونحن نطبق هذا النهج لتوصيف نشاط متحولة DAF من EWS / FLI14. متحولة DAF لديه 17 التيروزين إلى الطفرات ألانين في المناطق المتكررة من معرف EWS من EWS / FLI14. وقد تم الإبلاغ عن هذا متحولة EWS خاصة سابقا وغير قادر على تنشيط التعبير الجيني مراسل عندما تنصهر إلى ATF1 DBD14. ومع ذلك، تشير البيانات الأولية qRT-PCR أن هذا متحولة كان قادرا على تفعيل النسخ من EWS / FLI الهدف NR0B123. مكن النهج النسخي الموصوف هنا من الكشف الناجح عن الوظيفة الجزئية لتحول DAF. من خلال إقران هذه البيانات النسخية بمعلومات حول زخارف الربط والتعرف على EWS / FLI ، فإننا نظهر أيضا أن متحولة DAF تحتفظ بوظيفة في تكرار GGAA-microsatellite. وتحدد هذه النتائج DAF كأول متحولة وظيفية جزئيا EWS /FLI وتسليط الضوء على وظيفة في الجينات غير الأقمار الصناعية الصغيرة مهمة ل oncogenesis (كما ورد23). وهذا يدل على قوة هذا النهج رسم الخرائط هيكل وظيفة النسخ لتوفير نظرة ثاقبة في وظيفة عوامل النسخ أونكولينيك.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wet Lab Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FLI rabbit pAb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15289</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-lamin B1 rabbit pAb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16048</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-based system for introduction of mutant constructs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Determined by cell system used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For viral aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10131027</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293-EBNAs</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-10852</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 anti-FLAG mouse mAb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3165</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near IR-secondary antibodies</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985062</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>For viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8833</td>
			<td>Stored at 2 mg/mL stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74136</td>
			<td>Has gDNA removal columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>As dictated by cell system used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Determined by cell system used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-LT1</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>MIR 2304</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Access to HPC environment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnnotationDbi</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.38.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cairo</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.5-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DESeq2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.16.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genefilter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.58.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggbiplot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>org.Hs.eg.db</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pheatmap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.0.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PuTTY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.4.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RColorBrewer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.1-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reshape2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rgl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.100.19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-studio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Version 2.6 or later</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sva</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.24.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrimGalore!</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinSCP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping the structure-function relationships of disordered oncogenic transcription factors using transcriptomic analysis

تتميز العديد من أنواع السرطان بنقل الكروموسومات مما يؤدي إلى التعبير عن عوامل النسخ الإنصهاري الأورام. عادة، تحتوي هذه البروتينات على مجال مضطرب في جوهره (IDD) تنصهر مع مجال الحمض النووي ملزمة (DBD) من بروتين آخر وتنسيق تغييرات النسخ على نطاق واسع لتعزيز الخبيثة. وغالبا ما تكون هذه الاندماجات الانحراف الجينومي المتكرر الوحيد في السرطانات التي تسببها، مما يجعلها أهدافا علاجية جذابة. ومع ذلك ، فإن استهداف عوامل النسخ على أساس المنشأ يتطلب فهما أفضل للدور الآلي الذي تلعبه معرفات ال IDDs منخفضة التعقيد في وظيفتها. المجال N-المحطة الطرفية من EWSR1 هو معرف تشارك في مجموعة متنوعة من عوامل النسخ الانصهار oncogenic، بما في ذلك EWS / FLI، EWS / ATF، وEWS/WT1. هنا ، نستخدم تسلسل الحمض النووي الريبي للتحقيق في السمات الهيكلية لنطاق EWS المهم للوظيفة النسخية ل EWS / FLI في Ewing sarcoma. يتم تنفيذ أول استنفاد بوساطة shRNA من الانصهار الداخلي من خلايا ساركوما Ewing مقترنة بتعبير خارج الرحم لمجموعة متنوعة من البنى المتحولة EWS. ثم يتم استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي لتحليل نسخ الخلايا التي تعبر عن هذه البنى لتوصيف العجز الوظيفي المرتبط بالطفرات في مجال EWS. من خلال دمج التحليلات النسخية مع المعلومات المنشورة سابقا حول زخارف ربط الحمض النووي EWS / FLI ، وتوطين الجينوم ، وكذلك المقايسات الوظيفية لتحويل القدرة ، تمكنا من تحديد السمات الهيكلية لEWS / FLI مهمة ل oncogenesis وتحديد مجموعة جديدة من الجينات المستهدفة EWS / FLI الحرجة لساركوما Ewing. توضح هذه الورقة استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي كوسيلة لرسم خريطة للعلاقة بين الهيكل والوظيفة للمجال المضطرب في جوهره لعوامل النسخ الجيني.

Watch this Scientific Journal Video about Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis at JoVE.com

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

المجالات المضطربة في جوهرها مهمة لوظيفة عامل النسخ الإنصهاري. لاستهداف هذه البروتينات علاجيا، هناك حاجة إلى فهم أكثر تفصيلا للآليات التنظيمية المستخدمة من قبل هذه المجالات. هنا ، نستخدم transcriptomics لرسم خريطة السمات الهيكلية الهامة للمجال EWS المضطربة في جوهرها في ساركوما يوينغ.

رسم خرائط للعلاقات بين الهيكل والوظيفة لعوامل النسخ غير المنضبطة باستخدام التحليل النسخي

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

تحديد وتوصيف العوامل المنتشر بنقل الجينات في رواية التمزق--الوسم؛ مزق--tva النموذجي مورين

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

كريسبر/Cas9 باستخدام الجينات للتحقيق في نشاط النمطان Calreticulin المسخ في الخلايا المكونة للدم سيتوكين تعتمد على تحرير

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

طريقة بسيطة وسريعة للحصول على جودة عالية الورم الحمض النووي من العينات السريرية المرضية باستخدام جهائز بصمة اللمس

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

برنامج متكامل لرسم خرائط الجينوم على نطاق الدول الكروماتين استخدام رقاقة الفائق-التسلسل في أنسجة الورم

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

آثار العوامل المشتقة من خلايا سرطان الجلد المزدوج على التمايز Adipocytes نخاع العظام

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

An Oncogenic Hepatocyte-Induced Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Cancer Arising in the Setting of Hepatic Inflammation and Fibrosis

نموذج ماوس متثّل بالكبد من سرطان الكبد الناشئ في إعداد التهاب الكبد والتليف

The absence of a clinically relevant animal model addressing the typical immune characteristics of hepatocellular cancer (HCC) has significantly impeded ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

الكشف عن الانصهار الجيني الأنسيوجيني باستخدام تفاعل سلسلة بوليميراز متعددة المضاعفات متبوعاً بتسلسل الجيل التالي

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Analyzing Tumor Gene Expression Factors with the CorExplorer Web Portal

تحليل الأورام الجينية عوامل التعبير مع البوابة الكترونيه CorExplorer

Differential gene expression analysis is an important technique for understanding disease states. The machine learning algorithm CorEx has shown utility ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

تحديد منظمي عوامل النسخ باستخدام فحص متوسط الإنتاجية للمكتبات المصصفوفة ومراسل ثنائي لوسيفراز القائم

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

تقييم موت الخلية باستخدام الخلايا الخالية من البروبيوتيك في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية القولون والمستقيم

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...