Name: mapping the structure-function relationships of disordered oncogenic transcription factors using transcriptomic analysis
Uploaded: 2020-06-27T15:00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av High Performance Computing Facility ved Abigail Wexner Research Institute ved Nationwide Children's Hospital. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health National Cancer Institute [U54 CA231641 til SLL, R01 CA183776 til SLL]; Alex's Lemonade Stand Foundation [Young Investigator Award til ERT]; Pelotonia [Fellesskap til ERT]; og National Health and Medical Research Council CJ Martin Overseas Biomedical Fellowship [APP1111032 til KIP].

<ol>
	<li>Miettinen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fusion+sarcomas:+histopathology+and+clinical+significance+of+selected+entities.">New fusion sarcomas: histopathology and clinical significance of selected entities.</a> Human Pathology. 86, 57-65 (2019).</li><li>Knott, M. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+undruggable:+exploiting+neomorphic+features+of+fusion+oncoproteins+in+childhood+sarcomas+for+innovative+therapies.">Targeting the undruggable: exploiting neomorphic features of fusion oncoproteins in childhood sarcomas for innovative therapies.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 38, 625-642 (2019).</li><li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+and+therapeutic+relevance+of+cancer-associated+transcript+fusions.">The landscape and therapeutic relevance of cancer-associated transcript fusions.</a> Oncogene. 34, 4845-4854 (2015).</li><li>Duesberg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+genes+generated+by+rare+chromosomal+rearrangements+rather+than+activation+of+oncogenes.">Cancer genes generated by rare chromosomal rearrangements rather than activation of oncogenes.</a> Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 4, 163-175 (1987).</li><li>Dupain, C., Harttrampf, A. C., Urbinati, G., Geoerger, B., Massaad-Massade, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+Fusion+Genes+in+Pediatric+Cancers:+Toward+Precision+Medicine.">Relevance of Fusion Genes in Pediatric Cancers: Toward Precision Medicine.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 315-326 (2017).</li><li>Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+translocations+and+gene+fusions+on+cancer+causation.">The impact of translocations and gene fusions on cancer causation.</a> Nature Reviews Cancer. 7, 233-245 (2007).</li><li>Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+of+EWS/FLI+identifies+NKX2.2+as+a+critical+target+gene+in+Ewing's+sarcoma.">Expression profiling of EWS/FLI identifies NKX2.2 as a critical target gene in Ewing's sarcoma.</a> Cancer Cell. 9, 405-416 (2006).</li><li>Davicioni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+PAX-FKHR+gene+expression+signature+that+defines+molecular+classes+and+determines+the+prognosis+of+alveolar+rhabdomyosarcomas.">Identification of a PAX-FKHR gene expression signature that defines molecular classes and determines the prognosis of alveolar rhabdomyosarcomas.</a> Cancer Research. 66, 6936-6946 (2006).</li><li>Gr&#246;bner, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+genomic+alterations+across+childhood+cancers.">The landscape of genomic alterations across childhood cancers.</a> Nature. 555, 321-327 (2018).</li><li>Kim, J., Pelletier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+chromosome+translocations+involving+EWS+and+related+family+members.">Molecular genetics of chromosome translocations involving EWS and related family members.</a> Physiological Genomics. 1, 127-138 (1999).</li><li>Boulay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-Specific+Retargeting+of+BAF+Complexes+by+a+Prion-like+Domain.">Cancer-Specific Retargeting of BAF Complexes by a Prion-like Domain.</a> Cell. 171, 163-178 (2017).</li><li>Lessnick, S. L., Braun, B. S., Denny, C. T., May, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+domains+mediate+transformation+by+the+Ewing&#8217;s+sarcoma+EWS/FLI-1+fusion+gene.">Multiple domains mediate transformation by the Ewing&#8217;s sarcoma EWS/FLI-1 fusion gene.</a> Oncogene. 10, 423-431 (1995).</li><li>Leach, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia+fusion+target+AF9+is+an+intrinsically+disordered+transcriptional+regulator+that+recruits+multiple+partners+via+coupled+folding+and+binding.">Leukemia fusion target AF9 is an intrinsically disordered transcriptional regulator that recruits multiple partners via coupled folding and binding.</a> Structure. 21, 176-183 (2013).</li><li>Ng, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+aromatic+side+chains+within+a+disordered+structure+are+critical+for+transcription+and+transforming+activity+of+EWS+family+oncoproteins.">Multiple aromatic side chains within a disordered structure are critical for transcription and transforming activity of EWS family oncoproteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 104, 479-484 (2007).</li><li>Riggi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EWS-FLI1+Divergent+Chromatin+Remodeling+Mechanisms+to+Directly+Activate+or+Repress+Enhancer+Elements+in+Ewing+Sarcoma.">EWS-FLI1 Divergent Chromatin Remodeling Mechanisms to Directly Activate or Repress Enhancer Elements in Ewing Sarcoma.</a> Cancer Cell. 26, 668-681 (2014).</li><li>Tomazou, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenome+Mapping+Reveals+Distinct+Modes+of+Gene+Regulation+and+Widespread+Enhancer+Reprogramming+by+the+Oncogenic+Fusion+Protein+EWS-FLI1.">Epigenome Mapping Reveals Distinct Modes of Gene Regulation and Widespread Enhancer Reprogramming by the Oncogenic Fusion Protein EWS-FLI1.</a> Cell Reports. 10, 1082-1095 (2015).</li><li>Sankar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+relevance+of+EWS/FLI-mediated+transcriptional+repression+in+Ewing+sarcoma.">Mechanism and relevance of EWS/FLI-mediated transcriptional repression in Ewing sarcoma.</a> Oncogene. 32, 5089-5100 (2013).</li><li>Gangwal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsatellites+as+EWS/FLI+response+elements+in+Ewing's+sarcoma.">Microsatellites as EWS/FLI response elements in Ewing's sarcoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105, 10149-10154 (2008).</li><li>Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+Properties+of+EWS/FLI+Regulation+via+GGAA+Microsatellites+in+Ewing's+Sarcoma.">Emergent Properties of EWS/FLI Regulation via GGAA Microsatellites in Ewing's Sarcoma.</a> Genes &amp; Cancer. 1, 177-187 (2010).</li><li>Guillon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Oncogenic+EWS-FLI1+Protein+Binds+In+Vivo+GGAA+Microsatellite+Sequences+with+Potential+Transcriptional+Activation+Function.">The Oncogenic EWS-FLI1 Protein Binds In Vivo GGAA Microsatellite Sequences with Potential Transcriptional Activation Function.</a> PLoS One. 4, 4932 (2009).</li><li>Chong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+and+selective+low-complexity+domain+interactions+that+control+gene+transcription.">Imaging dynamic and selective low-complexity domain interactions that control gene transcription.</a> Science. 361, (2018).</li><li>Johnson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+EWS+domain+of+EWS/FLI+in+binding+GGAA-microsatellites+required+for+Ewing+sarcoma+anchorage+independent+growth.">Role for the EWS domain of EWS/FLI in binding GGAA-microsatellites required for Ewing sarcoma anchorage independent growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114, 9870-9875 (2017).</li><li>Theisen, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+functionally+maps+the+intrinsically+disordered+domain+of+EWS/FLI+and+reveals+novel+transcriptional+dependencies+for+oncogenesis.">Transcriptomic analysis functionally maps the intrinsically disordered domain of EWS/FLI and reveals novel transcriptional dependencies for oncogenesis.</a> Genes &amp; Cancer. 10, 21-38 (2019).</li><li>Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToppGene+Suite+for+gene+list+enrichment+analysis+and+candidate+gene+prioritization.">ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization.</a> Nucleic Acids Research. 37, 305-311 (2009).</li><li>Johnson, K. M., Taslim, C., Saund, R. S., Lessnick, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+types+of+GGAA-microsatellites+and+their+roles+in+EWS/FLI+binding+and+gene+regulation+in+Ewing+sarcoma.">Identification of two types of GGAA-microsatellites and their roles in EWS/FLI binding and gene regulation in Ewing sarcoma.</a> PLOS One. 12, 0186275 (2017).</li><li>Kim, P., Ballester, L. Y., Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+retention+in+transcription+factor+fusion+genes+and+its+biological+and+clinical+implications:+a+pan-cancer+study.">Domain retention in transcription factor fusion genes and its biological and clinical implications: a pan-cancer study.</a> Oncotarget. 8, 110103-110117 (2017).</li><li>de Mend&#237;bil, I. O., Vizmanos, J. L., Novo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+Selection+in+Fusion+Transcripts+Resulting+from+Chromosomal+Translocations+in+Human+Cancer.">Signatures of Selection in Fusion Transcripts Resulting from Chromosomal Translocations in Human Cancer.</a> PLOS One. 4, 4805 (2009).</li><li>Frenkel-Morgenstern, M., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+domain+combinations+in+proteins+encoded+by+chimeric+transcripts.">Novel domain combinations in proteins encoded by chimeric transcripts.</a> Bioinformatics. 28, 67-74 (2012).</li><li>Hegyi, H., Buday, L., Tompa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Structural+Disorder+Confers+Cellular+Viability+on+Oncogenic+Fusion+Proteins.">Intrinsic Structural Disorder Confers Cellular Viability on Oncogenic Fusion Proteins.</a> PLoS Computational Biology. 5, 1000552 (2009).</li><li>Latysheva, N. S., Babu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+and+understanding+oncogenic+gene+fusions+through+data+intensive+computational+approaches.">Discovering and understanding oncogenic gene fusions through data intensive computational approaches.</a> Nucleic Acids Research. 44, 4487-4503 (2016).</li><li>Deneen, B., Denny, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+p16+pathways+stabilizes+EWS/FLI1+expression+and+complements+EWS/FLI1+mediated+transformation.">Loss of p16 pathways stabilizes EWS/FLI1 expression and complements EWS/FLI1 mediated transformation.</a> Oncogene. 20, 6731-6741 (2001).</li><li>Kendall, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX3-FOXO1+transgenic+zebrafish+models+identify+HES3+as+a+mediator+of+rhabdomyosarcoma+tumorigenesis.">PAX3-FOXO1 transgenic zebrafish models identify HES3 as a mediator of rhabdomyosarcoma tumorigenesis.</a> eLife. 7, 33800 (2018).</li></ol>

SLL erklærer en interessekonflikt som medlem av rådgivende styre for og en aksjeeier av Salarius Pharmaceuticals. SLL er også en børsnotert oppfinner på United States Patents No. US 7,393,253 B2, "Metoder og komposisjoner for diagnostisering og behandling av Ewings Sarcoma," og US 8,557,532, "Diagnose og behandling av legemiddelresistent Ewings sarkom." Dette endrer ikke vår overholdelse av JoVE sine retningslinjer for deling av data og materialer.

Å studere de biokjemiske mekanismene til onkogene transkripsjonsfaktorer er kritisk viktig for å forstå sykdommene de forårsaker og å designe nye terapeutiske strategier. Dette gjelder spesielt i maligniteter preget av kromosomale translokasjoner som resulterer i fusjonstranskripsjonsfaktorer. Domenene som inngår i disse chimeriske proteinene kan mangle meningsfulle interaksjoner med regulatoriske domener som finnes i de ville proteinene, noe som kompliserer evnen til å tolke strukturfunksjonsinformasjon i sammenheng medfusjonen 26,27,28. Videre er mange av disse onkogene fusjoner preget av lav kompleksitet i iboende uordnede domener10,13,29,30.
EWS-domenet er et eksempel på et slikt iboende uorden domene som er involvert i en rekke onkogene fusjoner10. Den iboende uordnede og repeterende naturen har hindret arbeidet med å forstå molekylære mekanismer som brukes av EWS-domenet. Tidligere forsøk på å undersøke strukturfunksjonen har i stor grad tydd til å bruke forskjellige mutanter i sammenheng med reportergenanalyser eller i cellebakgrunner som ikke klarer å rekapitulere den relevante cellulære konteksten, eller mangler strukturelle variasjoner som gir meningsfull delvis funksjon11,17,25. Metoden som presenteres her, løser disse problemene. Strukturfunksjonskartlegging utføres i en sykdoms-relevant cellekontekst, og neste generasjons sekvensering gjør det mulig for transkripsjonsprofilering å evaluere transkripsjonsfaktorfunksjon i innstillingen av innfødt kromatin. I det spesifikke tilfellet av DAF-mutanten til EWS / FLI ble DAF rapportert å vise liten aktivitet i reporteranalyser ved hjelp av isolerte responselementer, men for å vise aktivitet i sammenheng med full genpromotor, enten i en reporteranalyse eller i innfødt kromatin, noe som tyder på en interessant fenotype23. Ved hjelp av metoden som er beskrevet her, løser mer direkte spørsmålet om hvilken type regulatoriske elementer på tvers av genomet som er mest responsive i sykdomsinnstillingen. Ved å teste alle kandidatmålgener i sin opprinnelige kromatinkontekst samtidig, er det mer sannsynlig at en transkripsjonsmetode identifiserer konstruksjoner med delvis funksjon.
Den iboende styrken ved å bruke en sykdoms-relevant cellebakgrunn er kanskje den største begrensningen i denne teknikken. En av de viktigste faktorene er å velge riktig cellesystem for disse eksperimentene. Mange cellelinjer avledet fra maligniteter med patognomiske transkripsjonsfaktorer tolererer ikke lett knockdown av den transkripsjonsfaktoren, og i mange tilfeller, spesielt for barnekreft, forblir den sanne opprinnelsescellen kontroversiell og uttrykket av oncogene i andre cellebakgrunner er uoverkommelig giftig31,32 . I disse tilfellene kan det være nyttig å utføre eksperimenter i en annen cellebakgrunn, så lenge forskeren utviser forsiktighet i tolkningen av resultatene og validerer relevante funn i en mer sykdomsrelevant celletype.
Det er kritisk viktig å nøye validere stabiliteten og fenotypiske konsekvenser av uttrykk for oncogene og bare sende inn prøver for sekvensering som oppfyller strenge kriterier. Her inkluderte dette vestlig blott for å bekrefte knockdown og redning, og qRT-PCR av et lite antall kjente målgener for å validere den positive kontrollen (Figur 2). Det er også viktig å redusere så mye batchvariabilitet som mulig ved å nøye utføre cellen og RNA-preparatene så likt som mulig gjennom hver batch.
Metoden beskrevet her blir spesielt kraftig når den er parret med andre typer genomiske data som snakker til den genomomfattende funksjonen til transkripsjonsfaktoren som studeres. Fremtidige retninger for denne typen strukturfunksjonsanalyse vil utvides til å omfatte ChIP-seq og ATAC-seq for å bestemme bindingen av transkripsjonsfaktoren og eventuelle induserte endringer i kromatintilgjengelighet. Som en pakke kan denne typen data peke på hvor forskjellige strukturelle komponenter i en onkogen transkripsjonsfaktor bidrar til ulike aspekter av funksjonen (dvs. DNA-binding vs. kromatinmodifisering vs. co-regulator rekruttering). Totalt sett kan bruk av NGS-baserte tilnærminger for å kartlegge strukturfunksjonsrelasjonene til fusjonstranskripsjonsfaktorer avsløre ny innsikt i de biokjemiske determinantene til den onkogene funksjonen til disse proteinene. Dette er viktig for å fremme vår forståelse av sykdommene de forårsaker og for å muliggjøre utvikling av nye terapeutiske strategier.

En undergruppe av kreft, inkludert mange maligniteter i barndommen og ungdomsårene, er preget av kromosomale translokasjoner som genererer nyfusjononcogenes 1,2,3,4,5,6. De resulterende fusjonsproteinene fungerer ofte som onkogene transkripsjonsfaktorer, og orkestrerer utbredte endringer i transkripsjonsregulering for å fremme tumorigenesis7,8. Kreft med disse translokasjonene har vanligvis et ellers stille mutasjonslandskap, med få tilbakevendende genomiske avvik bortsett fra den patognomiskefusjonen 4,9. Som sådan er direkte målretting av fusjonsproteinet en attraktiv terapeutisk strategi i disse sykdommene. Imidlertid består disse onkogene transkripsjonsfaktorene vanligvis av en lav kompleksitet, iboende uorden, transkripsjonelt aktiverende domene smeltet sammen med et DNA-bindende domene (DBD)10,11,12,13,14. Både de iboende uordnede domenene (IDDene) og DBDene til disse proteinene har vist seg vanskelig å målrette mot konvensjonelle farmakologiske tilnærminger. Utvikling av nye terapeutiske tilnærminger krever derfor en mer detaljert molekylær forståelse av mekanismene som brukes av disse fusjonene for å regulere genuttrykket.
Den N-terminale IDD-delen av EWSR1 smeltes vanligvis sammen til en DBD i kreft, inkludert EWS/FLI i Ewing sarkom, EWS/WT1 i diffus liten rundcelletumor og EWS/ATF1 i klarcellet sarkom av myke deler10. Den mekanistiske rollen til EWS IDD i hver av disse fusjonene er ufullstendig forstått. EWS/ETS-familien av fusjoner, spesielt EWS/FLI, er den mest funksjonelt karakteriserte til dags dato. EWS/FLI koordinerer genomomfattende epigenetiske og transkripsjonelle endringer som fører til aktivering og undertrykkelse av tusenvis av gener7,11,15,16. Studier har vist at IDD er viktig for rekruttering av både transkripsjonelle medaktivatorer (som p300, WDR5 og BAF-komplekset), samt medundertrykkere (for eksempel NuRD-komplekset)11,15,17. Sammensmeltingen av EWS IDD til C-terminaldelen av FLI1 gir ny DNA-bindende spesifisitet til ETS DBD av FLI1, slik at fusjons-onkoproteinet (EWS/FLI) binder seg til repeterende GGAA-mikrosalittregioner av genomet i tillegg til konsensus ETS-motivet18,19,20. Kombinert med rekrutteringsfunksjonen for medaktivator, denne nye DNA-bindende aktiviteten til EWS/FLI fremmer de novo enhancerformasjon ved GGAA-mikrosatellitter som er distale for transkripsjonsstartsteder (TSS) ("enhancer-lignende" mikrosatellitter) og rekrutterer RNA polymerase II for å fremme transkripsjon ved GGAA-mikrosatellitter proksimalt til TSS ("promotorlignende" mikrosatellitter)11,15,16,21.
Samlet sett førte disse dataene oss til å hypotese at diskrete elementer i EWS-domenet bidrar til rekruttering av distinkte medregulatorer til forskjellige typer EWS / FLI-bindingssteder. Imidlertid har det å skjelne disse elementene i EWS-delen av EWS / FLI, og hvordan de fungerer, blitt hindret av domenets svært repeterende og uordnede natur. Her bruker vi et tidligere publisert knockdown-redningssystem i Ewing sarkomceller for å kartlegge disse elementene i EWS IDD funksjonelt. I dette systemet EWS/FLI er utarmet ved hjelp av en shRNA rettet mot 3'UTR av FLI1 genet, og uttrykket er reddet med varierende EWS / FLI mutant cDNA konstruksjoner mangler 3'UTR7,17,22. Disse eksperimentene fokuserte på konstruksjoner med ulike slettinger for å kartlegge strukturfunksjonsforholdet mellom EWS IDD og viktige onkogene fenotyper, inkludert aktivering av en GGAA-mikrosalittreporterkonstruksjon, koloniformasjonsanalyser og målrettet validering av EWS / FLI-aktiverte og -undertrykte gener7,17,22 . Disse studiene fant imidlertid ikke atskilte underdomener i EWS IDD i EWS/FLI som er unikt viktige for enten aktivering eller undertrykkelse. Alle testede konstruksjoner var enten i stand til både å aktivere og undertrykke spesifikke målgener, noe som førte til effektiv kolonidannelse, eller ute av stand til å regulere noen av EWS / FLI-målgenene, noe som førte til tap av kolonidannelse7,17,22.
Transkripsjonsanalyser som aktiveres av den utbredte adopsjonen av neste generasjons sekvensering, brukes ofte til å sammenligne genuttrykkssignaturer under to forhold, ofte i sammenheng med screening eller beskrivende studier. Vi ønsket i stedet å utnytte evnen til å fange opp genomomfattende uttrykksdata ved hjelp av RNA-sekvensering (RNA-seq) for å karakterisere bidragene fra IDD-er til transkripsjonsfaktorfunksjon. I dette tilfellet er RNA-seq forbundet med knockdown-redningssystemet for å utforske strukturfunksjonsforholdet til EWS-domenet. Denne tilnærmingen gjelder for andre fusjonstranskripsjonsfaktorer, inkludert andre EWS-fusjoner eller wildtype transkripsjonsfaktorer med dårlig forstått funksjon, og har flere fordeler i forhold til de andre analysene som brukes til funksjonelle kartstudier, for eksempel reporteranalyser eller målrettet qRT-PCR. Disse inkluderer testing av strukturelle determinanter av funksjon i relevant kromatinkontekst, evnen til å teste flere typer responselementer i en analyse (dvs. aktivert og undertrykt, GGAA-mikrosalat og ikke-mikrosalat, etc.), og den resulterende evnen til bedre å oppdage delvis funksjon.
Vellykket implementering av denne tilnærmingen avhenger av et cellebasert system som fanger opp fenotypene av interesse (i dette tilfellet A673-celler med shRNA-mediert EWS / FLI-uttømming), og et panel av mutantkonstruksjoner i en uttrykksvektor som passer for det cellebaserte systemet (i dette tilfellet pMSCV-hygro med forskjellige 3x-FLAG-taggede EWS / FLI-mutanter som skal leveres av retroviral transduksjon). Viral transduksjon av enten CRISPR-baserte uttømmingskonstruksjoner, shRNA-baserte uttømmingskonstruksjoner og cDNA-uttrykkskonstruksjoner med passende valg for å generere stabile cellelinjer anbefales over forbigående transfeksjon. Nedstrøms tolkningen av resultatene styrkes når de transkripsjonsmessige dataene kan kobles sammen med andre data relatert til lokalisering av transkripsjonsfaktoren og andre fenotypiske avlesninger der det er tilgjengelig.
I dette dokumentet bruker vi denne tilnærmingen til å karakterisere aktiviteten til DAF-mutanten til EWS / FLI14. DAF-mutanten har 17 tyrosin til alaninmutasjoner i de repeterende områdene i EWS IDD for EWS/FLI14. Denne spesielle EWS-mutanten hadde tidligere blitt rapportert og kan ikke aktivere reportergenuttrykk når den ble smeltet sammen til ATF1 DBD14. Foreløpige qRT-PCR-data antydet imidlertid at denne mutanten var i stand til å aktivere transkripsjon av EWS / FLI-målet NR0B123. Den transkripsjonsomiske tilnærmingen som er beskrevet her, gjorde det mulig å oppdage delvis funksjon av DAF-mutanten. Ved å parre disse transkripsjonsdataene med informasjon om EWS/FLI-bindings- og anerkjennelsesmotiver viser vi videre at DAF-mutanten beholder funksjonen ved GGAA-mikrosalat repetisjoner. Disse resultatene identifiserer DAF som den første delvis funksjonelle EWS/FLI mutant og fremhever funksjon ved ikke-mikrosatellittgener som viktige for onkogenese (som rapportert23). Dette viser kraften i denne transkripsjonsstrukturfunksjonskartleggingsmetoden for å gi innsikt i funksjonen til onkogene transkripsjonsfaktorer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wet Lab Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FLI rabbit pAb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15289</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-lamin B1 rabbit pAb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16048</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-based system for introduction of mutant constructs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Determined by cell system used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For viral aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10131027</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293-EBNAs</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-10852</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 anti-FLAG mouse mAb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3165</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near IR-secondary antibodies</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985062</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>For viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8833</td>
			<td>Stored at 2 mg/mL stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74136</td>
			<td>Has gDNA removal columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>As dictated by cell system used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Determined by cell system used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-LT1</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>MIR 2304</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Access to HPC environment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnnotationDbi</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.38.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cairo</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.5-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DESeq2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.16.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genefilter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.58.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggbiplot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>org.Hs.eg.db</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pheatmap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.0.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PuTTY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.4.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RColorBrewer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.1-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reshape2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rgl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.100.19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-studio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Version 2.6 or later</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sva</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.24.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrimGalore!</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinSCP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping the structure-function relationships of disordered oncogenic transcription factors using transcriptomic analysis

Mange kreftformer er preget av kromosomale translokasjoner som resulterer i uttrykk for onkogene fusjonstranskripsjonsfaktorer. Vanligvis inneholder disse proteinene et iboende uorden domene (IDD) smeltet sammen med DNA-bindende domene (DBD) av et annet protein og orkestrerer utbredte transkripsjonsendringer for å fremme malignitet. Disse fusjonene er ofte den eneste tilbakevendende genomiske avviket i kreften de forårsaker, noe som gjør dem attraktive terapeutiske mål. Imidlertid krever målretting av onkogen transkripsjonsfaktorer en bedre forståelse av den mekanistiske rollen som lav kompleksitet, IDD-er spiller i deres funksjon. N-terminaldomenet til EWSR1 er en IDD involvert i en rekke onkogene fusjonstranskripsjonsfaktorer, inkludert EWS / FLI, EWS / ATF og EWS / WT1. Her bruker vi RNA-sekvensering for å undersøke de strukturelle egenskapene til EWS-domenet som er viktig for transkripsjonsfunksjonen til EWS / FLI i Ewing sarkom. Første shRNA-medierte uttømming av den endogene fusjonen fra Ewing sarkomceller sammen med ektopisk uttrykk for en rekke EWS-mutantkonstruksjoner utføres. Deretter brukes RNA-sekvensering til å analysere transkripsjonen av celler som uttrykker disse konstruksjonene for å karakterisere de funksjonelle underskuddene forbundet med mutasjoner i EWS-domenet. Ved å integrere de transkripsjonsanalysene med tidligere publisert informasjon om EWS/FLI DNA-bindende motiver, og genomisk lokalisering, samt funksjonelle analyser for transformeringsevne, kunne vi identifisere strukturelle trekk ved EWS/FLI som er viktige for onkogenese og definere et nytt sett med EWS/FLI-målgener som er kritiske for Ewing sarkom. Dette dokumentet demonstrerer bruken av RNA-sekvensering som en metode for å kartlegge strukturfunksjonsforholdet til det iboende uordnede domenet til onkogene transkripsjonsfaktorer.

Foreløpige qRT-PCR-data antydet at en EWS/FLI-mutant kalt DAF, med spesifikk tyrosin til alaninmutasjoner i den repeterende og uordnede regionen EWS, opprettholdt evnen til å aktivere EWS/FLI-målgener, men klarte ikke å undertrykke kritiske målgener23. For bedre å forstå forholdet mellom disse rester i EWS-domenet og EWS/FLI-funksjonen, ble protokollen beskrevet ovenfor og skissert i figur 1 brukt. A673 Ewing sarkomceller ble viralt transdusert med en shRNA rettet mot 3'UTR av FLI1, noe som resulterte i uttømming av endogen EWS / FLI. Etter fire dagers utvelgelse ble EWS/FLI-funksjonen reddet med viral transduksjon av forskjellige 3XFLAG-merkede EWS/FLI mutantkonstruksjoner, med tom vektor som kontroll for ingen redning. En ikke-funksjonell mutant som mangler EWS-domenet, kalt Δ22, ble brukt som en negativ kontroll, og wild-type EWS/FLI, kalt wtEF, ble brukt som en positiv kontroll (Figur 2A). DAF ble brukt som testkonstruksjon, selv om mer enn én testkonstruksjon kan brukes om ønskelig. Celler ble valgt i ytterligere 10 dager for å tillate konstruksjonsuttrykk å stabilisere seg og deretter samlet inn for RNA (med et gDNA-fjerningstrinn), protein- og kolonidannende analyser. Fire replikeringer ble samlet inn og representative qRT-PCR og vestlige flekker som viser effektiv knockdown og redning er vist i figur 2B-D. Det skal bemerkes at DAF-reddet celler ikke klarte å danne kolonier som vist i figur 2E, noe som tyder på nedsatt onkogen transformasjon.
Etter å ha fullført replikeringsvalideringen og fenotypiske analyser, ble RNA sendt til Institute for Genomic Medicine ved Nationwide Children's Hospital for bibliotekforberedelse og neste generasjons sekvensering med ~ 50 millioner 150-bp parede leseoperasjoner samlet inn. Dataene ble returnert som fastq.gz filer. Leseoperasjoner av lav kvalitet ble trimmet fra disse filene med TrimGalore og STAR ble brukt til å justere lesninger til det menneskelige genomet hg19 og telle lesningene per gen. hg19 ble brukt til kompatibilitet med de andre kuraterte datasettene for EWS/FLI som brukes i nedstrømsanalyse. Disse lesetallene ble kombinert til én matrise for ett antall for alle utvalg, hvorav de første 6 radene vises i figur 3.
Antall ble opprinnelig kjørt gjennom DESeq2 uten batch-normalisering, men visuell inspeksjon av utvalg-til-prøve-avstanden viste potensielle forvirrende batcheffekter som vist uthevet med røde piler i figur 4A. Dette oppsto sannsynligvis på grunn av biologisk variasjon introdusert ved passasje av celler i kultur og forskjeller i behandlingen av hvert parti. Normalisering for satsvise effekter ble utført med ComBat og anbefales vanligvis. Utvalg-til-prøve-avstandene for de satsvise normaliserte dataene vises i Figur 4B. Etter batch-normalisering ble DESeq2 brukt til å generere transkripsjonsprofiler for de tre konstruksjonene (wtEF, Δ22 og DAF) i forhold til grunnlinjen. Merk at mens "foreldre" A673-celler (mock knockdown og mock rescue, kalt "iLuc" her) ble inkludert i differensialanalysen, er referansen for dette eksperimentet cellene med EWS / FLI-utarmede, kalt iEF-celler. Transkripsjonsprofilen kan genereres for det endogene proteinet her ved å sammenligne iLuc-prøven med iEF, og dette kan være av interesse for å forstå hvordan redningssystemet fungerer, men det er ikke målet med denne analysen. Transkripsjonsprofilene som genereres for mutantene inkluderer positive (wtEF) og negative (Δ22) kontroller, med hensyn til iEF, slik at disse skal fungere som målestokker for andre mutanter. Dette er viktig, da den positive kontrollen i dette eksemplet ikke fullstendig rekapitulerte funksjonen til endogen EWS / FLI som diskutert andre steder7,23.
Hovedkomponentanalysen (PCA) i figur 5 antyder at transkripsjonsprofilen til DAF er mellomliggende mellom wtEF og Δ22, noe som bekrefter delvis funksjon. Videre viste hierarkisk klynge av de 1000 mest variable genene på tvers av prøver at DAF ikke klarte å undertrykke EWS / FLI-målgener, og bare delvis beholdt genaktiveringsaktivitet som vist i figur 6A og figur S5. ToppGene-analysen antydet at genklassene som DAF aktiverer, er funksjonelt forskjellige fra de EWS/FLI-aktiverte målene der DAF ikke er funksjonelle (figur 6B). Interessant nok synes funksjonen til aktiverte gener reddet av wtEF, men ikke av DAF, å være relatert til transkripsjonskontroll og kromatinregulering. Basert på resultatene fra koloniformasjonsanalysene bør genene fra denne kjernegensignaturen analyseres nærmere for sin rolle i EWS/FLI-mediert onkogenese. Betydningen av EWS/FLI-mediert genundertrykkelse har tidligere blitt beskrevet17.
Det er kjent at EWS/FLI har en unik bindingsaffinitet for GGAA-mikrosaatellittre gjentatte elementer19,22, og at binding ved disse elementene driver nedstrøms genregulering11,15,18,20,22. Disse mikrosatellittene har blitt karakterisert som enten forbundet med aktivering eller undertrykkelse, og enten proksimal til (< 5 kb) TSS eller distal til (> 5 kb) TSS25. I tillegg er det EWS / FLI-regulerte gener med høy affinitet (HA) ETS motiver proksimalt til TSS23. For å analysere egenskapene til DAF-funksjonen ytterligere og hvilke typer EWS/FLI-aktiverte gener DAF var i stand til å redde, ble differensialuttrykk av gener forbundet med disse forskjellige klassene analysert. Interessant nok var DAF mest i stand til å redde GGAA-mikrosalataktiverte gener, men ute av stand til å redde aktiverte gener nær et HA-sted som vist i figur 7. Sett med hierarkisk klynger klarer ikke DAF å redde EWS/FLI-mediert undertrykkelse på tvers av motivklasser. Disse dataene antyder at DAF beholder tilstrekkelige strukturelle egenskaper ved EWS til å binde seg til og aktivere fra GGAA-mikrosatellitter, både proksimale og distale til TSS. Dette oppstår sannsynligvis fra det intakte SYGQ-domenet som antas å være viktig for EWS / FLI-aktivitet ved GGAA gjentar11. Disse dataene tyder også på at de spesifikke tyrosinene mutert i DAF spiller viktige, men dårlig forståtte, roller i EWS /FLI-mediert genregulering fra HA-nettsteder, samt i genundertrykkelse, og fremhever et viktig område for videre undersøkelser.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig01.jpg"> Figur 1: Arbeidsflyt. Skildring av den trinnvise prosedyren for å utføre strukturfunksjonskartlegging ved hjelp av transkripsjon. Celler ble først forberedt på å uttrykke pakken med konstruksjoner som kreves for strukturfunksjonskartlegging. Etter uttrykk ble celler høstet for RNA og protein og analysert for korrelative fenotyper. Uttrykk for konstruksjonene ble validert, og denne prosessen ble gjentatt 3-4 ganger for å samle uavhengige biologiske replikeringer. RNA ble deretter sendt inn til neste generasjons sekvensering (NGS). Da data ble mottatt, ble data trimmet for kvalitet, justert og antall per transkripsjon ble beregnet. Batcheffekter ble kontrollert for og transkripsjonssignaturer og differensialuttrykk ble bestemt ved hjelp av DESeq2. Hierarkisk klynge- og nedstrømsanalyse som integrerer andre -omics-datasett og ulike bane- eller funksjonsanalyser kan innlemmes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig02.jpg"> Figur 2: Validering av konstruksjonsuttrykk og korrelative analyser. (A) Skjematisk som viser konstruksjonene som er testet i dette eksemplet. (B) Validering av nedslag av endogen EWS/FLI og uttrykk for 3X-FLAGG-merkede konstruksjoner av immunoblot. (C,D) Validering av konstruksjonsaktivitet ved et EWS/FLI(C) aktivert målgen, NR0B1og (D) undertrykt målgen, TGFBR2, av qRT-PCR. Data presenteres som gjennomsnittlig +/- standardavvik. P-verdier ble beregnet med en Tukeys ærlige signifikanstest. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,005 (E) Koloni teller fra myke agaranalyser utført for å vurdere transformerende konstruksjonsaktivitet. P-verdier ble beregnet med en Tukeys ærlige signifikanstest. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,005. Dette tallet er tilpasset fra Theisen, et al.23<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig03.jpg"> Figur 3: Endelige sorterte telledata for analyse. Skjermbilde av de første 6 radene i tellefilen med genantall for alle prøvene som skal batch normaliseres og analyseres. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig04v3.jpg"> Figur 4: Varmekart for avstand fra prøve til prøve. (A) Eksempel-til-eksempel-avstandstegning som viser eksempelklyngen for råtellingsdataene. Eksempler som grupperes både etter bunke og etter prøve, er merket med røde piler. (B) Eksempel-til-prøve avstandsplott etter batch normalisering med ComBat. Her replikerer prøver fra alle klynger sammen, uavhengig av batch. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig05.jpg"> Figur 5: Resultater av differensialuttrykksanalyse. (A) PCA-plott (Principle Component Analysis) for de transkripsjonssignaturene som genereres for alle prøvene, viser sterk intra-sample-klynge og viser at DAF er mellomliggende mellom de positive (wtEF) og negative (Δ22) kontrollene. (B) Vulkanplott som viser -log(p-verdien) plottet mot log2FoldChange for gener i hver konstruksjon. Gener med justert p-verdi < 0,05 og en |log2(FoldChange)-| > 1 anses som signifikante og vises i rødt. Panel 5B er tilpasset fra Theisen, et al.23<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig06.jpg"> Figur 6: Hierarkisk klynging for å identifisere genklasser. (A) Hierarkisk klynging av de 1000 mest variable genene på tvers av alle konstruksjoner, og grunnlinjen, iEF, viser at DAF delvis redder EWS/FLI-mediert genaktivering. (B) Gen ontologi (molekylær funksjon) resultater fra ToppGene viser funksjonell berikelse av EWS / FLI-aktiverte gener som enten reddes eller ikke reddes av DAF. Panel 6B er tilpasset fra Theisen, et al.23<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig07.jpg"> Figur 7: Detaljert analyse av ulike transkripsjonsfaktorresponselementer til forskjellige konstruksjoner: (A) Skjematisk som viser databehandlingen som brukes til å generere paneler (B) og (C) ved å inkorporere andre tilgjengelige datasett med de transomiske profilene her. (B,C) Kompilering som viser redning av forskjellige klasser av direkte EWS/ FLI- (B) aktivert og (C) undertrykte mål. Gener inkludert var bare de genene med påviselig differensialuttrykk av endogen EWS / FLI. I hvert sektordiagram viser grått den delen av gener som ikke reddes av konstruksjonen. Rød skildrer den delen av gener som er differensialaktivert, og blå skildrer den delen av gener som er differensialt undertrykt. Dette tallet er tilpasset fra Theisen, et al.23<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig07large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Figur S1: Laste inn fastq.gz-filene i HPC-miljøet, trimming og justering. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig01.jpg" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne figuren.</a>
Figur S2: Sortering av leseantall på tvers av prøver og kjøring av batchnormalisering med ComBat. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig02.jpg" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne figuren.</a>
Figur S3: Kjøre DESeq2 og trekke ut resultater fra differensialuttrykksanalyse. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig03.jpg" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne figuren.</a>
Figur S4: Analysere utdata. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig04.jpg" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne figuren.</a>
Figur S5: Hierarkisk klynging for å identifisere genklasser: Hierarkisk klynging av de 1000 mest variable genene på tvers av alle konstruksjoner og grunnlinjen, iEF, sortert i k-klynger. I dette tilfellet k=7, men denne parameteren angis av brukeren som vist i Figur S4D. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig05.jpg" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne figuren.</a>
Tabell S1: Liste over gener (Ensembl gen-ID) med klyngemerknad. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/Table_S1.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis at JoVE.com

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Iboende uordnede domener er viktige for onkogen fusjonstranskripsjonsfaktorfunksjon. For å terapeutisk målrette disse proteinene, er det nødvendig med en mer detaljert forståelse av reguleringsmekanismene som brukes av disse domenene. Her bruker vi transkripsjon for å kartlegge viktige strukturelle egenskaper ved det iboende uordnede EWS-domenet i Ewing sarkom.

Kartlegging av strukturfunksjonsrelasjoner av uordnede onkogene transkripsjonsfaktorer ved hjelp av transkripsjonsanalyse

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identifikasjon og karakterisering av metastatisk faktorer av genoverføring i romanen RIP-Tag; RIP-LiveTV murint modell

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Bruker CRISPR/Cas9 Gene redigering for å undersøke kreftfremkallende aktiviteten av muterte Calreticulin i cytokin avhengige blodkreft cellene

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Enkel og rask metode å få høy kvalitet svulst DNA fra klinisk-patologisk prøver bruker Touch forlaget cytologi

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

En integrert plattform for genomet hele kartlegging av Chromatin stater med høy gjennomstrømming ChIP-sekvensering Tumor vev

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

To effekter av melanom Cell-derived faktorer på benmarg adipocytter differensiering

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

An Oncogenic Hepatocyte-Induced Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Cancer Arising in the Setting of Hepatic Inflammation and Fibrosis

En kreftfremkallende hepatocytter-indusert Orthotopic Mouse modell av lever Cancer som oppstår i innstillingen av hepatic betennelse og fibrose

The absence of a clinically relevant animal model addressing the typical immune characteristics of hepatocellular cancer (HCC) has significantly impeded ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Kreftfremkallende Gene Fusion Detection bruke forankret multiplex polymerase Kjedere reaksjon etterfulgt av neste generasjon sekvensering

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Analyzing Tumor Gene Expression Factors with the CorExplorer Web Portal

Analysere tumor Gene Expression faktorer med CorExplorer Web portal

Differential gene expression analysis is an important technique for understanding disease states. The machine learning algorithm CorEx has shown utility ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Identifikasjon av transkripsjonsfaktorregulatorer ved hjelp av middels gjennomstrømningsscreening av arrayed biblioteker og en Dual-Luciferase-basert reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluering av celledød ved hjelp av cellefri supernatant av probiotika i tredimensjonale sfæroidkulturer av kolorektale kreftceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...