Name: mapping the structure-function relationships of disordered oncogenic transcription factors using transcriptomic analysis
Uploaded: 2020-06-27T15:00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada pelo Centro de Computação de Alto Desempenho do Instituto de Pesquisa Abigail Wexner do Nationalwide Children's Hospital. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde Instituto Nacional de Câncer [U54 CA231641 para SLL, R01 CA183776 para SLL]; Alex's Lemonade Stand Foundation [Prêmio Jovem Investigador para ERT]; Pelotonia [Bolsa para ERT]; e o Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica CJ Martin Overseas Biomedical Fellowship [APP1111032 to KIP].

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+functionally+maps+the+intrinsically+disordered+domain+of+EWS/FLI+and+reveals+novel+transcriptional+dependencies+for+oncogenesis.">Transcriptomic analysis functionally maps the intrinsically disordered domain of EWS/FLI and reveals novel transcriptional dependencies for oncogenesis.</a> Genes &amp; Cancer. 10, 21-38 (2019).</li><li>Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToppGene+Suite+for+gene+list+enrichment+analysis+and+candidate+gene+prioritization.">ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization.</a> Nucleic Acids Research. 37, 305-311 (2009).</li><li>Johnson, K. M., Taslim, C., Saund, R. S., Lessnick, S. 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A SLL declara um conflito de interesses como membro do conselho consultivo e detentor de capital da Salarius Pharmaceuticals. SLL também é um inventor listado em Patentes dos Estados Unidos No. EUA 7.393.253 B2, "Métodos e composições para o diagnóstico e tratamento do Sarcoma de Ewing", e US 8.557.532, "Diagnóstico e tratamento do sarcoma resistente a medicamentos Ewing". Isso não altera nossa adesão às políticas da JoVE no compartilhamento de dados e materiais.

Estudar os mecanismos bioquímicos dos fatores de transcrição oncogênica é extremamente importante para entender as doenças que causam e projetar novas estratégias terapêuticas. Isso é especialmente verdade em malignidades caracterizadas por translocações cromossômicas que resultam em fatores de transcrição de fusão. Os domínios incluídos nessas proteínas quimricas podem não ter interações significativas com domínios regulatórios presentes nas proteínas do tipo selvagem, complicando a capacidade de interpretar informações estruturais-funções no contexto da fusão26,27,28. Além disso, muitas dessas fusões oncogênicas são caracterizadas por domínios intrinsecamente desordenados de baixa complexidade10,13,29,30.
O domínio EWS é um exemplo de um domínio tão intrinsecamente desordenado que está envolvido em uma variedade de fusões oncogênicas10. A natureza intrinsecamente desordenada e repetitiva tem dificultado os esforços para entender os mecanismos moleculares empregados pelo domínio EWS. Esforços anteriores para investigar a estrutura-função têm recorrido em grande parte ao uso de diferentes mutantes no contexto de ensaios genéticos de repórteres ou em fundos celulares que não conseguem recapitular o contexto celular relevante, ou não possuem variações estruturais que produzam uma função parcial significativa11,17,25. O método aqui apresentado aborda essas questões. O mapeamento estrutura-função é realizado em um contexto celular relevante para a doença e o sequenciamento de próxima geração permite que o perfil transcriômico avalie a função do fator de transcrição na configuração da cromatina nativa. No caso específico do mutante DAF da EWS/FLI, daf foi relatado para mostrar pouca atividade em ensaios de repórteres usando elementos de resposta isolados, mas para mostrar atividade no contexto do promotor genético completo, seja em um ensaio repórter ou em cromatina nativa, sugerindo um fenótipointeressante 23. O uso do método aqui descrito resolve mais diretamente a questão de qual tipo de elementos regulatórios em todo o genoma são mais responsivos no cenário da doença. Ao testar todos os genes-alvo do candidato em seu contexto nativo de cromatina simultaneamente, uma abordagem transcriômica é mais provável para identificar construções com função parcial.
A força inerente do uso de um fundo celular relevante para a doença é talvez a maior limitação dessa técnica. Um dos fatores mais importantes é a escolha do sistema celular adequado para esses experimentos. Muitas linhas celulares derivadas de malignidades com fatores de transcrição pathognomônica não toleram prontamente o knockdown desse fator de transcrição, e em muitos casos, particularmente para cânceres pediátricos, a verdadeira célula de origem permanece controversa e a expressão do oncogene em outras origens celulares é proibitivamente tóxica31,32 . Nesses casos, pode ser útil realizar experimentos em um fundo celular diferente, desde que o pesquisador exerça cautela na interpretação dos resultados e valide adequadamente quaisquer achados relevantes em um tipo celular mais relevante para a doença.
É extremamente importante validar cuidadosamente a estabilidade e as consequências fenotípicas da expressão do oncogene e submeter apenas amostras para sequenciamento que atendam a critérios rigorosos. Aqui, isso incluiu a mancha ocidental para confirmar o knockdown e o resgate, e qRT-PCR de um pequeno número de genes alvo conhecidos para validar o controle positivo(Figura 2). Da mesma forma, é crucial diminuir o máximo de variabilidade de lote possível, realizando cuidadosamente as preparações de célula e RNA da forma mais semelhante possível através de cada lote.
O método aqui descrito torna-se especialmente poderoso quando emparelhado com outros tipos de dados genômicos que falam da função genoma do fator de transcrição em estudo. As direções futuras para este tipo de análise estrutura-função se expandiriam para incluir ChIP-seq e ATAC-seq para determinar a vinculação do fator de transcrição e quaisquer alterações induzidas na acessibilidade da cromatina. Como um conjunto, esse tipo de dados pode apontar para onde diferentes componentes estruturais de um fator de transcrição oncogênica contribuem para diferentes aspectos da função (ou seja, vinculação de DNA vs. modificação de cromatina versus recrutamento co-regulador). No geral, o uso de abordagens baseadas em NGS para mapear as relações estrutura-função dos fatores de transcrição de fusão pode revelar novos insights nos determinantes bioquímicos da função oncogênica dessas proteínas. Isso é importante para aprofundar nossa compreensão das doenças que causam e possibilitar o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.

Um subconjunto de cânceres, incluindo muitas malignidades da infância e adolescência, são caracterizados por translocações cromossômicas que geram nova fusão oncogenes1,2,3,4,5,6. As proteínas de fusão resultantes frequentemente funcionam como fatores de transcrição oncogênica, orquestrando mudanças generalizadas na regulação transcricional para promover a tumorigênese7,8. Os cânceres com essas translocações geralmente possuem uma paisagem mutacional silenciosa, com poucas aberrações genômicas recorrentes além da fusão pathognomônica4,9. Como tal, direcionar diretamente a proteína de fusão é uma estratégia terapêutica atraente nessas doenças. No entanto, esses fatores de transcrição oncogênica consistem comumente em um domínio de baixa complexidade, intrinsecamente desordenado, transcriptionalmente ativado fundido com um domínio de vinculação de DNA (DBD)10,11,12,13,14. Tanto os domínios intrinsecamente desordenados (IDDs) quanto os DBDs dessas proteínas têm se mostrado difíceis de atingir com abordagens farmacológicas convencionais. O desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas, portanto, requer uma compreensão molecular mais detalhada dos mecanismos empregados por essas fusões para regular aberrantemente a expressão genética.
A porção de IDD N-terminal de EWSR1 é comumente fundida a um DBD em câncer, incluindo EWS/FLI em sarcoma Ewing, EWS/WT1 em tumor de células pequenas e difusas pequenas células redondas, e EWS/ATF1 em sarcoma de células claras de partes macias10. O papel mecanicista do IDD EWS em cada uma dessas fusões é incompletamente compreendido. A família de fusões EWS/ETS, especificamente EWS/FLI, é a mais caracterizada funcionalmente até o momento. O EWS/FLI coordena alterações epigenéticas e transcricionais em todo o genoma que levam à ativação e repressão de milhares de genes7,11,15,16. Estudos têm demonstrado que o IDD é importante para o recrutamento de co-ativadores transcricionais (como p300, WDR5 e o complexo BAF), bem como co-repressores (como o complexo NuRD)11,15,17. A fusão do IDD EWS à porção terminal C do FLI1 confere nova especificidade de vinculação de DNA ao ETS DBD de FLI1, de tal forma que a oncoproteína de fusão (EWS/FLI) se liga a regiões repetitivas GGAA-microsatélites do genoma, além do consenso ETS motivo18,19,20. Combinado com a função de recrutamento do co-ativador, esta atividade emergente de ligação de DNA do EWS/FLI promove a formação de novo melhorador em GGAA-microsatélites distal para locais de início de transcrição (TSS) (microsatélites "melhorador" RNA polymerase II para promover transcrição em GGAA-microsatélites proximal para TSS (microsatélites "promotores")11,15,16,21.
Juntos, esses dados nos levaram a supor que elementos discretos dentro do domínio EWS contribuem para o recrutamento de co-reguladores distintos para diferentes tipos de sites de vinculação EWS/FLI. No entanto, discernir esses elementos dentro da porção EWS do EWS/FLI, e como eles funcionam, tem sido dificultado pela natureza altamente repetitiva e desordenada do domínio. Aqui utilizamos um sistema de resgate de knockdown publicado anteriormente em células de sarcoma Ewing para mapear funcionalmente esses elementos no IDD EWS. Neste sistema, o EWS/FLI é esgotado usando um shRNA direcionado ao 3'UTR do gene FLI1, e a expressão é resgatada com diferentes construções de CDNA mutantes EWS/FLI sem o 3'UTR7,17,22. Esses experimentos se concentraram em construções com várias exclusões para mapear a relação estrutura-função entre o IDD EWS e os importantes fenótipos oncogênicos, incluindo a ativação de uma construção de repórter GGAA-microsatélite, ensaios de formação de colônias e validação direcionada de genes ativados pelo EWS/FLI7,17,22 . No entanto, esses estudos não conseguiram encontrar sub-domínios discretos dentro do IDD EWS em EWS/FLI que são exclusivamente importantes para ativação ou repressão. Todos os construtos testados foram capazes de ativar e reprimir genes-alvo específicos, levando à formação eficiente de colônias, ou incapazes de regular qualquer um dos genes alvo EWS/FLI, levando à perda da formação decolônias 7,17,22.
Análises transcriômicas habilitadas pela adoção generalizada do sequenciamento da próxima geração são comumente utilizadas para comparar assinaturas de expressão genética em duas condições, frequentemente no contexto de triagem ou estudos descritivos. Em vez disso, queríamos aproveitar a capacidade de capturar dados de expressão em todo o genoma usando RNA-sequencincing (RNA-seq) para caracterizar as contribuições dos IDDs para a função do fator de transcrição. Neste caso, o RNA-seq é emparelhado com o sistema knockdown-rescue para explorar a relação estrutura-função do domínio EWS. Essa abordagem é aplicável a outros fatores de transcrição de fusão, incluindo outras fusões EWS ou fatores de transcrição do tipo selvagem com função mal compreendida, e tem múltiplas vantagens sobre os outros ensaios usados para estudos de mapeamento funcional, como ensaios de repórter ou qRT-PCR direcionado. Estes incluem testar determinantes estruturais de função no contexto de cromatina relevante, a capacidade de testar vários tipos de elementos de resposta em um ensaio (ou seja, ativado e reprimido, GGAA-microsatélite e não-microsatélite, etc.), e a capacidade resultante de detectar melhor a função parcial.
A implementação bem-sucedida dessa abordagem depende de um sistema baseado em células que captura os fenótipos de interesse (neste caso, células A673 com esgotamento EWS/FLI mediado por shRNA) e um painel de construções mutantes em um vetor de expressão apropriado para o sistema baseado em células (neste caso, pMSCV-hygro com vários mutantes EWS/FLI marcados por 3x-FLAG a serem entregues por transdução retroviral). A transdução viral de construções de esgotamento baseadas em CRISPR, construções de esgotamento baseadas em shRNA e construtos de expressão cDNA com seleção apropriada para gerar linhas de células estáveis é recomendada sobre transfecção transitória. A interpretação a jusante dos resultados é reforçada quando os dados transcriômicos podem ser emparelhados com outros dados relacionados à localização do fator de transcrição e outras leituras fenotípicas quando disponíveis.
Neste artigo, aplicamos esta abordagem para caracterizar a atividade do mutante DAF da EWS/FLI14. O mutante DAF tem 17 mutações de tyrosina para alanina nas regiões repetitivas do EWS IDD de EWS/FLI14. Este mutante EWS em particular havia sido relatado anteriormente e é incapaz de ativar a expressão genética do repórter quando fundido ao ATF1 DBD14. No entanto, dados preliminares do QRT-PCR sugeriram que este mutante foi capaz de ativar a transcrição do alvo EWS/FLI NR0B123. A abordagem transcriômica descrita aqui permitiu a detecção bem sucedida da função parcial do mutante DAF. Ao emparelhar esses dados transcriômicos com informações sobre os motivos de vinculação e reconhecimento EWS/FLI, mostramos ainda que o mutante DAF mantém a função em repetições de microsatélites GGAA. Esses resultados identificam o DAF como o primeiro mutante EWS/FLI parcialmente funcional e destacam a função em genes não microsatélites tão importantes para a oncogênese (como relatado23). Isso demonstra o poder desta abordagem de mapeamento de estrutura-função transcriptômica para fornecer insights sobre a função dos fatores de transcrição oncogênica.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wet Lab Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FLI rabbit pAb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15289</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-lamin B1 rabbit pAb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16048</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-based system for introduction of mutant constructs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Determined by cell system used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For viral aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10131027</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293-EBNAs</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-10852</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 anti-FLAG mouse mAb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3165</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near IR-secondary antibodies</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985062</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>For viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8833</td>
			<td>Stored at 2 mg/mL stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74136</td>
			<td>Has gDNA removal columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>As dictated by cell system used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Determined by cell system used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-LT1</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>MIR 2304</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Access to HPC environment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnnotationDbi</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.38.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cairo</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.5-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DESeq2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.16.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genefilter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.58.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggbiplot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>org.Hs.eg.db</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pheatmap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.0.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PuTTY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.4.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RColorBrewer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.1-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reshape2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rgl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.100.19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-studio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Version 2.6 or later</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sva</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.24.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrimGalore!</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinSCP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping the structure-function relationships of disordered oncogenic transcription factors using transcriptomic analysis

Muitos cânceres são caracterizados por translocações cromossômicas que resultam na expressão de fatores de transcrição da fusão oncogênica. Tipicamente, essas proteínas contêm um domínio intrinsecamente desordenado (IDD) fundido com o domínio de vinculação de DNA (DBD) de outra proteína e orquestram mudanças transcricionais generalizadas para promover a malignidade. Essas fusões são muitas vezes a única aberração genômica recorrente nos cânceres que causam, tornando-os alvos terapêuticos atraentes. No entanto, direcionar fatores de transcrição oncogênica requer uma melhor compreensão do papel mecanicista que as IDDs de baixa complexidade desempenham em sua função. O domínio n-terminal do EWSR1 é um IDD envolvido em uma variedade de fatores de transcrição de fusão oncogênica, incluindo EWS/FLI, EWS/ATF e EWS/WT1. Aqui, usamos o sequenciamento de RNA para investigar as características estruturais do domínio EWS importante para a função transcricional do EWS/FLI no sarcoma Ewing. Primeiro esgotamento mediado por shRNA da fusão endógena das células de sarcoma de Ewing emparelhadas com expressão ectópica de uma variedade de construções mutantes EWS é realizada. Em seguida, o sequenciamento de RNA é usado para analisar os transcriptomes de células expressando esses construtos para caracterizar os déficits funcionais associados a mutações no domínio EWS. Ao integrar as análises transcriômicas com informações publicadas anteriormente sobre motivos de ligação de DNA EWS/FLI e localização genômica, bem como ensaios funcionais para a transformação da capacidade de transformação, conseguimos identificar características estruturais do EWS/FLI importantes para a oncogênese e definir um novo conjunto de genes-alvo EWS/FLI críticos para sarcoma Ewing. Este artigo demonstra o uso do sequenciamento de RNA como método para mapear a relação estrutura-função do domínio intrinsecamente desordenado de fatores de transcrição oncogênica.

Dados preliminares de qRT-PCR sugeriram que um mutante EWS/FLI chamado DAF, com mutações específicas de tyrosina para alanina na região repetitiva e desordenada do EWS, manteve a capacidade de ativar genes de alvo EWS/FLI, mas não conseguiu reprimir genes-alvo críticos23. Para compreender melhor a relação entre esses resíduos no domínio EWS e na função EWS/FLI, utilizou-se o protocolo descrito acima e descrito na Figura 1. As células de sarcoma A673 Ewing foram viralmente transduzidas com um shRNA direcionado ao 3'UTR de FLI1, resultando no esgotamento do EWS/FLI endógeno. Após quatro dias de seleção, a função EWS/FLI foi resgatada com transdução viral de diferentes construções mutantes EWS/FLI marcadas por 3XFLAG, com vetor vazio como controle para nenhum resgate. Um mutante não funcional sem o domínio EWS, chamado Δ22, foi usado como controle negativo e o EWS/FLI do tipo selvagem, chamado wtEF, foi usado como um controle positivo(Figura 2A). O DAF foi usado como construção de teste, embora mais de uma construção de teste possa ser usada se desejar. As células foram selecionadas por mais 10 dias para permitir que a expressão de construção se estabilize e depois coletada para RNA (com uma etapa de remoção de gDNA), proteína e ensaios de formação de colônias. Quatro réplicas foram coletadas e as manchas representativas qRT-PCR e ocidentais que mostram knockdown e resgate eficazes são mostradas na Figura 2B-D. Deve-se notar que as células resgatadas pelo DAF não conseguiram formar colônias como mostrado na Figura 2E,sugerindo a transformação oncogênica prejudicada.
Após a conclusão da validação da réplica e ensaios fenotípicos, o RNA foi submetido ao Instituto de Medicina Genômica do Hospital Infantil Nacional para preparação da biblioteca e sequenciamento de próxima geração com ~50 milhões de leituras de fim de ano de 150 bp coletadas. Os dados foram devolvidos como arquivos .gz Fastq. Leituras de baixa qualidade foram aparadas desses arquivos com TrimGalore e STAR foi usada para alinhar leituras ao genoma humano hg19 e contar as leituras por gene. hg19 foi utilizado para fins de compatibilidade com os outros conjuntos de dados curados para EWS/FLI utilizados na análise a jusante. Estas contagens de leitura foram combinadas em uma matriz de contagem única para todas as amostras, as primeiras 6 linhas das quais são mostradas na Figura 3.
As contagens foram inicialmente executadas através do DESeq2 sem a normalização em lote, no entanto, a inspeção visual da distância amostra-a-amostra mostrou potenciais efeitos de lote de confusão, como mostrado destacado com setas vermelhas na Figura 4A. Isso provavelmente surgiu devido à variabilidade biológica introduzida pela passagem de células na cultura e diferenças no processamento de cada lote. A normalização dos efeitos em lote foi realizada com o ComBat e é geralmente recomendada. As distâncias amostra-a-amostra dos dados normalizados em lote são mostradas na Figura 4B. Após a normalização do lote, o DESeq2 foi usado para gerar perfis transcricionais para os três construtos (wtEF, Δ22 e DAF) relativos à linha de base. Note que enquanto as células A673 "parentais" (knockdown simulado e resgate simulado, chamado "iLuc" aqui) foram incluídas na análise diferencial, a referência para este experimento são as células com EWS/FLI-esgotado, chamados células iEF. O perfil transcricional pode ser gerado para a proteína endógena aqui, comparando a amostra iLuc com iEF, e isso pode interessar em entender como funciona o sistema de resgate, mas esse não é o objetivo desta análise em particular. Os perfis transcricionais gerados para os mutantes incluem controles positivos (wtEF) e negativos (Δ22), com relação ao iEF, de tal forma que estes devem funcionar como referência para outros mutantes. Isso é importante, pois o controle positivo neste exemplo não recapitulava completamente a função do Endógeno EWS/FLI como discutido em outros lugares7,23.
A análise dos componentes principais (PCA) na Figura 5 sugere que o perfil transcricional do DAF é intermediário entre wtEF e Δ22, confirmando a função parcial. Além disso, o agrupamento hierárquico dos 1000 genes mais variáveis entre as amostras mostrou que o DAF falhou em reprimir genes alvo EWS/FLI, e apenas reteve parcialmente a atividade de ativação genética, como mostrado na Figura 6A e Figura S5. A análise do ToppGene sugeriu que as classes de genes que o DAF ativa são funcionalmente distintas daqueles alvos ativados pelo EWS/FLI, onde o DAF não é funcional(Figura 6B). Curiosamente, a função de genes ativados resgatados pelo wtEF, mas não pelo DAF, parecem estar relacionadas ao controle transcricional e à regulação da cromatina. Com base nos resultados dos ensaios de formação da colônia, os genes desta assinatura genética central devem ser analisados por seu papel na oncogênese mediada pelo EWS/FLI. A importância da repressão genética mediada pelo EWS/FLI foi descrita anteriormente17.
Sabe-se que o EWS/FLI possui uma afinidade vinculante única para os elementos de repetição GGAA-microsatélite19,22, e que a vinculação a esses elementos impulsiona a regulação genética a jusante11,15,18,20,22. Esses microsatélites têm sido caracterizados como associados à ativação ou repressão, e ou proximal a (< 5 kb) TSS ou distal (> 5 kb) TSS25. Além disso, existem genes regulados por EWS/FLI com alto afinidade (HA) ETS, motivos proximais ao TSS23. A fim de analisar melhor as características da função DAF e quais tipos de genes ativados por EWS/FLI, o DAF foi capaz de resgatar, foi analisada a expressão diferencial dos genes associados a essas diferentes classes. Curiosamente, o DAF foi mais capaz de resgatar genes ativados ggaa-microsatélites, mas incapaz de resgatar genes ativados perto de um local ha como visto na Figura 7. Como visto com o agrupamento hierárquico, o DAF falha em resgatar a repressão mediada pelo EWS/FLI em todas as classes de motivos. Esses dados sugerem que o DAF retém características estruturais suficientes do EWS para se ligar e ativar a partir de microsatélites GGAA, tanto proximal quanto distal ao TSS. Isso provavelmente surge do domínio SYGQ intacto considerado importante para a atividade EWS/FLI na GGAA repete11. Esses dados também sugerem que as tyrosinas específicas mutadas no DAF desempenham papéis importantes, mas mal compreendidos, na regulação genética mediada pelo EWS/FLI a partir de sites ha, bem como na repressão genética, destacando uma área importante de investigação mais aprofundada.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig01.jpg"> Figura 1: Fluxo de trabalho. Representação do procedimento passo-a-passo para realizar o mapeamento de função estrutura por transcriômica. As células foram preparadas para expressar o conjunto de construções necessárias para o mapeamento estrutura-função. Seguindo a expressão, as células foram colhidas para RNA e proteína e avaliadas para fenótipos correlativos. A expressão dos construtos foi validada, e esse processo foi repetido 3-4 vezes para coletar réplicas biológicas independentes. O RNA foi então submetido ao sequenciamento de próxima geração (NGS). Quando os dados foram recebidos, os dados foram aparados para qualidade, alinhados e as contagens por transcrição foram calculadas. Os efeitos em lote foram controlados e as assinaturas transcriômicas e a expressão diferencial foram determinadas por meio do DESeq2. O clusteramento hierárquico e a análise a jusante integrando outros conjuntos de dados -omics e diferentes caminhos ou análises funcionais podem ser incorporados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig02.jpg"> Figura 2: Validação da expressão de construção e ensaios correlativos. (A) Esquema representando os construtos testados neste exemplo. (B) Validação do knockdown do EWS/FLI endógeno e expressão de construções marcadas por 3X-FLAG por imunoblot. (C,D) Validação da atividade de construção em um gene alvo ativado EWS/FLI (C), NR0B1, e(D) gene alvo reprimido, TGFBR2, por qRT-PCR. Os dados são apresentados como desvio médio +/- padrão. Os valores P foram calculados com um teste de significância honesto de Tukey. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,005 (E) Colônia conta a partir de ensaios de ágar macio realizados para avaliar a atividade transformadora de construções. Os valores P foram calculados com um teste de significância honesto de Tukey. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,005. Esta figura é adaptada de Theisen, et al.23<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig03.jpg"> Figura 3: Dados finais de contagem de colhidos para análise. Captura de tela das 6 primeiras linhas do arquivo de contagem com contagem de genes para que todas as amostras sejam normalizadas e analisadas em lote. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig04v3.jpg"> Figura 4: Mapas de distância de amostra para amostra. (A) Gráfico de distância amostra-a-amostra mostrando o agrupamento amostral dos dados de contagem bruta. As amostras que estão agrupando tanto por lote quanto por amostra são denotadas com setas vermelhas. (B) Parcela de distância amostra-a-amostra após a normalização do lote com o ComBat. Aqui, amostras de todas as réplicas agrupam-se, independente do lote. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig05.jpg"> Figura 5: Resultados da análise de expressão diferencial. (A) O gráfico de análise de componentes de princípio (PCA) das assinaturas transcriômicas geradas para todas as amostras mostra um forte agrupamento intra-amostra e demonstra que o DAF é intermediado entre os controles positivo (wtEF) e negativo (Δ22). (B) Gráficos vulcânis mostrando o -log(p-value) plotado contra o log2FoldChange para genes em cada construção. Genes com valor p ajustado < 0,05 e |log2(FoldChange)| > 1 são considerados significativos e são mostrados em vermelho. Painel 5B é adaptado de Theisen, et al.23<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig06.jpg"> Figura 6: Agrupamento hierárquico para identificar classes genéticas. ( A )Oagrupamento hierárquico dos 1000 genes mais variáveis em todas as construções e a linha de base, iEF, mostra que o DAF resgata parcialmente a ativação genética mediada por EWS/FLI. (B) A ontologia genética (função molecular) resulta do ToppGene mostrando o enriquecimento funcional de genes ativados por EWS/FLI que são resgatados ou não pelo DAF. Painel 6B é adaptado de Theisen, et al.23<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig07.jpg"> Figura 7: Análise detalhada de diferentes elementos de resposta ao fator de transcrição para diferentes construções: (A) Esquema que retrata o processamento de dados usado para gerar painéis (B) e (C) incorporando outros conjuntos de dados disponíveis com os perfis transcriômicos aqui. (B,C) Compilação mostrando o resgate de diferentes classes de alvos diretos EWS/FLI- (B) ativados e(C) alvos reprimidos. Os genes incluídos foram apenas aqueles genes com expressão diferencial detectável por EWS/FLI endógeno. Em cada gráfico de tortas, o cinza retrata a porção de genes que não são resgatados pela construção. O vermelho retrata a porção de genes que são ativados diferencialmente, e o azul retrata a porção de genes que são diferencialmente reprimidos. Esta figura é adaptada de Theisen, et al.23<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura S1: Carregando os arquivos fastq.gz para o ambiente HPC, aparando e alinhamento. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig01.jpg" target="_blank">Clique aqui para baixar este número.</a>
Figura S2: A leitura de collating conta entre amostras e a normalização do lote em execução com o ComBat. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig02.jpg" target="_blank">Clique aqui para baixar este número.</a>
Figura S3: Executando o DESeq2 e extraindo resultados de análise de expressão diferencial. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig03.jpg" target="_blank">Clique aqui para baixar este número.</a>
Figura S4: Analisando a saída. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig04.jpg" target="_blank">Clique aqui para baixar este número.</a>
Figura S5: Agrupamento hierárquico para identificar classes genéticas: Agrupamento hierárquico dos 1000 genes mais variáveis em todos os construtos e na linha de base, iEF, classificados em aglomerados k. Neste caso k=7, mas este parâmetro é definido pelo usuário como mostrado na Figura S4D. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig05.jpg" target="_blank">Clique aqui para baixar este número.</a>
Tabela S1: Lista de genes (Ensembl gene ID) com anotação de cluster. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/Table_S1.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis at JoVE.com

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Domínios intrinsecamente desordenados são importantes para a função do fator de transcrição de fusão oncogênica. Para atingir terapeuticamente essas proteínas, é necessário uma compreensão mais detalhada dos mecanismos regulatórios utilizados por esses domínios. Aqui, usamos transcrição para mapear características estruturais importantes do domínio EWS intrinsecamente desordenado no sarcoma Ewing.

Mapeando as Relações Estrutura-Função de Fatores de Transcrição Oncogênica Desordenados usando análise transcriômica

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