Name: mapping the structure-function relationships of disordered oncogenic transcription factors using transcriptomic analysis
Uploaded: 2020-06-27T15:00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis at JoVE.com

Это исследование было поддержано Высокопроизводительным вычислительным центром в Научно-исследовательском институте Эбигейл Векснер в Национальной детской больнице. Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения Национального института рака [U54 CA231641 to SLL, R01 CA183776 to SLL]; Alex's Lemonade Stand Foundation [Премия молодого исследователя ERT]; Пелотония [Стипендия ERT]; и Национальный совет по здравоохранению и медицинским исследованиям CJ Martin Overseas Biomedical Fellowship [APP1111032 to KIP].

<ol>
	<li>Miettinen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fusion+sarcomas:+histopathology+and+clinical+significance+of+selected+entities.">New fusion sarcomas: histopathology and clinical significance of selected entities.</a> Human Pathology. 86, 57-65 (2019).</li><li>Knott, M. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+undruggable:+exploiting+neomorphic+features+of+fusion+oncoproteins+in+childhood+sarcomas+for+innovative+therapies.">Targeting the undruggable: exploiting neomorphic features of fusion oncoproteins in childhood sarcomas for innovative therapies.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 38, 625-642 (2019).</li><li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+and+therapeutic+relevance+of+cancer-associated+transcript+fusions.">The landscape and therapeutic relevance of cancer-associated transcript fusions.</a> Oncogene. 34, 4845-4854 (2015).</li><li>Duesberg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+genes+generated+by+rare+chromosomal+rearrangements+rather+than+activation+of+oncogenes.">Cancer genes generated by rare chromosomal rearrangements rather than activation of oncogenes.</a> Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 4, 163-175 (1987).</li><li>Dupain, C., Harttrampf, A. C., Urbinati, G., Geoerger, B., Massaad-Massade, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+Fusion+Genes+in+Pediatric+Cancers:+Toward+Precision+Medicine.">Relevance of Fusion Genes in Pediatric Cancers: Toward Precision Medicine.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 315-326 (2017).</li><li>Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+translocations+and+gene+fusions+on+cancer+causation.">The impact of translocations and gene fusions on cancer causation.</a> Nature Reviews Cancer. 7, 233-245 (2007).</li><li>Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+of+EWS/FLI+identifies+NKX2.2+as+a+critical+target+gene+in+Ewing's+sarcoma.">Expression profiling of EWS/FLI identifies NKX2.2 as a critical target gene in Ewing's sarcoma.</a> Cancer Cell. 9, 405-416 (2006).</li><li>Davicioni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+PAX-FKHR+gene+expression+signature+that+defines+molecular+classes+and+determines+the+prognosis+of+alveolar+rhabdomyosarcomas.">Identification of a PAX-FKHR gene expression signature that defines molecular classes and determines the prognosis of alveolar rhabdomyosarcomas.</a> Cancer Research. 66, 6936-6946 (2006).</li><li>Gr&#246;bner, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+genomic+alterations+across+childhood+cancers.">The landscape of genomic alterations across childhood cancers.</a> Nature. 555, 321-327 (2018).</li><li>Kim, J., Pelletier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+chromosome+translocations+involving+EWS+and+related+family+members.">Molecular genetics of chromosome translocations involving EWS and related family members.</a> Physiological Genomics. 1, 127-138 (1999).</li><li>Boulay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-Specific+Retargeting+of+BAF+Complexes+by+a+Prion-like+Domain.">Cancer-Specific Retargeting of BAF Complexes by a Prion-like Domain.</a> Cell. 171, 163-178 (2017).</li><li>Lessnick, S. L., Braun, B. S., Denny, C. T., May, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+domains+mediate+transformation+by+the+Ewing&#8217;s+sarcoma+EWS/FLI-1+fusion+gene.">Multiple domains mediate transformation by the Ewing&#8217;s sarcoma EWS/FLI-1 fusion gene.</a> Oncogene. 10, 423-431 (1995).</li><li>Leach, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia+fusion+target+AF9+is+an+intrinsically+disordered+transcriptional+regulator+that+recruits+multiple+partners+via+coupled+folding+and+binding.">Leukemia fusion target AF9 is an intrinsically disordered transcriptional regulator that recruits multiple partners via coupled folding and binding.</a> Structure. 21, 176-183 (2013).</li><li>Ng, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+aromatic+side+chains+within+a+disordered+structure+are+critical+for+transcription+and+transforming+activity+of+EWS+family+oncoproteins.">Multiple aromatic side chains within a disordered structure are critical for transcription and transforming activity of EWS family oncoproteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 104, 479-484 (2007).</li><li>Riggi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EWS-FLI1+Divergent+Chromatin+Remodeling+Mechanisms+to+Directly+Activate+or+Repress+Enhancer+Elements+in+Ewing+Sarcoma.">EWS-FLI1 Divergent Chromatin Remodeling Mechanisms to Directly Activate or Repress Enhancer Elements in Ewing Sarcoma.</a> Cancer Cell. 26, 668-681 (2014).</li><li>Tomazou, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenome+Mapping+Reveals+Distinct+Modes+of+Gene+Regulation+and+Widespread+Enhancer+Reprogramming+by+the+Oncogenic+Fusion+Protein+EWS-FLI1.">Epigenome Mapping Reveals Distinct Modes of Gene Regulation and Widespread Enhancer Reprogramming by the Oncogenic Fusion Protein EWS-FLI1.</a> Cell Reports. 10, 1082-1095 (2015).</li><li>Sankar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+relevance+of+EWS/FLI-mediated+transcriptional+repression+in+Ewing+sarcoma.">Mechanism and relevance of EWS/FLI-mediated transcriptional repression in Ewing sarcoma.</a> Oncogene. 32, 5089-5100 (2013).</li><li>Gangwal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsatellites+as+EWS/FLI+response+elements+in+Ewing's+sarcoma.">Microsatellites as EWS/FLI response elements in Ewing's sarcoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105, 10149-10154 (2008).</li><li>Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+Properties+of+EWS/FLI+Regulation+via+GGAA+Microsatellites+in+Ewing's+Sarcoma.">Emergent Properties of EWS/FLI Regulation via GGAA Microsatellites in Ewing's Sarcoma.</a> Genes &amp; Cancer. 1, 177-187 (2010).</li><li>Guillon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Oncogenic+EWS-FLI1+Protein+Binds+In+Vivo+GGAA+Microsatellite+Sequences+with+Potential+Transcriptional+Activation+Function.">The Oncogenic EWS-FLI1 Protein Binds In Vivo GGAA Microsatellite Sequences with Potential Transcriptional Activation Function.</a> PLoS One. 4, 4932 (2009).</li><li>Chong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+and+selective+low-complexity+domain+interactions+that+control+gene+transcription.">Imaging dynamic and selective low-complexity domain interactions that control gene transcription.</a> Science. 361, (2018).</li><li>Johnson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+EWS+domain+of+EWS/FLI+in+binding+GGAA-microsatellites+required+for+Ewing+sarcoma+anchorage+independent+growth.">Role for the EWS domain of EWS/FLI in binding GGAA-microsatellites required for Ewing sarcoma anchorage independent growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114, 9870-9875 (2017).</li><li>Theisen, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+functionally+maps+the+intrinsically+disordered+domain+of+EWS/FLI+and+reveals+novel+transcriptional+dependencies+for+oncogenesis.">Transcriptomic analysis functionally maps the intrinsically disordered domain of EWS/FLI and reveals novel transcriptional dependencies for oncogenesis.</a> Genes &amp; Cancer. 10, 21-38 (2019).</li><li>Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToppGene+Suite+for+gene+list+enrichment+analysis+and+candidate+gene+prioritization.">ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization.</a> Nucleic Acids Research. 37, 305-311 (2009).</li><li>Johnson, K. M., Taslim, C., Saund, R. S., Lessnick, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+types+of+GGAA-microsatellites+and+their+roles+in+EWS/FLI+binding+and+gene+regulation+in+Ewing+sarcoma.">Identification of two types of GGAA-microsatellites and their roles in EWS/FLI binding and gene regulation in Ewing sarcoma.</a> PLOS One. 12, 0186275 (2017).</li><li>Kim, P., Ballester, L. Y., Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+retention+in+transcription+factor+fusion+genes+and+its+biological+and+clinical+implications:+a+pan-cancer+study.">Domain retention in transcription factor fusion genes and its biological and clinical implications: a pan-cancer study.</a> Oncotarget. 8, 110103-110117 (2017).</li><li>de Mend&#237;bil, I. O., Vizmanos, J. L., Novo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+Selection+in+Fusion+Transcripts+Resulting+from+Chromosomal+Translocations+in+Human+Cancer.">Signatures of Selection in Fusion Transcripts Resulting from Chromosomal Translocations in Human Cancer.</a> PLOS One. 4, 4805 (2009).</li><li>Frenkel-Morgenstern, M., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+domain+combinations+in+proteins+encoded+by+chimeric+transcripts.">Novel domain combinations in proteins encoded by chimeric transcripts.</a> Bioinformatics. 28, 67-74 (2012).</li><li>Hegyi, H., Buday, L., Tompa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Structural+Disorder+Confers+Cellular+Viability+on+Oncogenic+Fusion+Proteins.">Intrinsic Structural Disorder Confers Cellular Viability on Oncogenic Fusion Proteins.</a> PLoS Computational Biology. 5, 1000552 (2009).</li><li>Latysheva, N. S., Babu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+and+understanding+oncogenic+gene+fusions+through+data+intensive+computational+approaches.">Discovering and understanding oncogenic gene fusions through data intensive computational approaches.</a> Nucleic Acids Research. 44, 4487-4503 (2016).</li><li>Deneen, B., Denny, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+p16+pathways+stabilizes+EWS/FLI1+expression+and+complements+EWS/FLI1+mediated+transformation.">Loss of p16 pathways stabilizes EWS/FLI1 expression and complements EWS/FLI1 mediated transformation.</a> Oncogene. 20, 6731-6741 (2001).</li><li>Kendall, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX3-FOXO1+transgenic+zebrafish+models+identify+HES3+as+a+mediator+of+rhabdomyosarcoma+tumorigenesis.">PAX3-FOXO1 transgenic zebrafish models identify HES3 as a mediator of rhabdomyosarcoma tumorigenesis.</a> eLife. 7, 33800 (2018).</li></ol>

SLL заявляет о конфликте интересов в качестве члена консультативного совета и акционера Salarius Pharmaceuticals. SLL также включена в список изобретателей по патентам США No. US 7,393,253 B2, «Методы и композиции для диагностики и лечения саркомы Юинга», и US 8,557,532, «Диагностика и лечение лекарственно-устойчивой саркомы Юинга». Это не меняет нашей приверженности политике JoVE в отношении обмена данными и материалами.

Изучение биохимических механизмов онкогенных факторов транскрипции критически важно для понимания заболеваний, которые они вызывают, и разработки новых терапевтических стратегий. Это особенно верно при злокачественных новообразованиях, характеризующихся хромосомными транслокациями, приводящими к слиянию факторов транскрипции. Домены, включенные в эти химерные белки, могут не иметь значимых взаимодействий с регуляторными доменами, присутствующими в белках дикого типа, что усложняет способность интерпретировать информацию о структуре-функции в контексте слияния26,27,28. Более того, многие из этих онкогенных синтезов характеризуются низкой сложностью внутренне неупорядоченных доменов10,13,29,30.
Домен EWS является примером такого внутренне неупорядоченного домена, который участвует в различных онкогенных слияниях10. Внутренне неупорядоченная и повторяющаяся природа препятствует усилиям по пониманию молекулярных механизмов, используемых областью EWS. Предыдущие усилия по исследованию структуры-функции в значительной степени прибегали к использованию различных мутантов в контексте репортерных генных анализов или в клеточных фонах, которые не могут повторить соответствующий клеточный контекст или не имеют каких-либо структурных вариаций, которые производят значимую частичную функцию11,17,25. Метод, представленный здесь, решает эти проблемы. Картирование структуры-функции выполняется в контексте клеток, связанных с заболеванием, а секвенирование следующего поколения позволяет транскриптомному профилированию оценивать функцию транскрипционного фактора в условиях нативного хроматина. В конкретном случае мутанта DAF EWS/FLI DAF, как сообщалось, проявлял небольшую активность в репортерных анализах с использованием изолированных элементов ответа, но проявлял активность в контексте полного промотора гена, либо в репортерном анализе, либо в нативном хроматине, предполагая интересный фенотип23. Использование метода, описанного здесь, более непосредственно решает вопрос о том, какой тип регуляторных элементов в геноме наиболее отзывчив в условиях заболевания. Тестируя все гены-мишени-кандидаты в их нативном контексте хроматина одновременно, транскриптомный подход с большей вероятностью идентифицирует конструкции с частичной функцией.
Неотъемлемая сила использования клеточного фона, связанного с заболеванием, является, пожалуй, самым большим ограничением этого метода. Одним из наиболее важных факторов является выбор подходящей клеточной системы для этих экспериментов. Многие клеточные линии, полученные от злокачественных новообразований с патогномоничными факторами транскрипции, не переносят сбивание этого фактора транскрипции, и во многих случаях, особенно для детского рака, истинная клетка происхождения остается спорной, а экспрессия онкогена в других клеточных фонах непомерно токсична31,32 . В этих случаях может быть полезно проводить эксперименты на другом клеточном фоне, если исследователь проявляет осторожность в интерпретации результатов и надлежащим образом подтверждает любые соответствующие результаты в более релевантном типе клеток.
Критически важно тщательно проверять стабильность и фенотипические последствия экспрессии онкогена и представлять для секвенирования только образцы, отвечающие строгим критериям. Здесь это включало вестерн-блот для подтверждения нокдауна и спасения, а также qRT-PCR небольшого числа известных генов-мишеней для проверки положительного контроля(рисунок 2). Также крайне важно уменьшить как можно большую вариабельность партии, тщательно выполняя клеточные и РНК-препараты как можно более похожим образом через каждую партию.
Метод, описанный здесь, становится особенно мощным в сочетании с другими типами геномных данных, которые говорят об общегеномной функции изучаемого фактора транскрипции. Будущие направления для этого типа структурно-функционального анализа будут расширены, чтобы включить ChIP-seq и ATAC-seq для определения связывания фактора транскрипции и любых индуцированных изменений доступности хроматина. Как набор, этот тип данных может указывать на то, где различные структурные компоненты онкогенного транскрипционного фактора способствуют различным аспектам функции (например, связывание ДНК против модификации хроматина против набора коконгуляторов). В целом, использование подходов на основе NGS для картирования структурно-функциональных отношений факторов транскрипции слияния может выявить новые идеи в биохимических детерминантах онкогенной функции этих белков. Это важно для углубления нашего понимания заболеваний, которые они вызывают, и для разработки новых терапевтических стратегий.

Подмножество раковых заболеваний, включая многие злокачественные новообразования в детском и подростковом возрасте, характеризуется хромосомными транслокациями, которые генерируют новые онкогены слияния1,2,3,4,5,6. Полученные в результате слияния белки часто функционируют как онкогенные факторы транскрипции, организуя широко распространенные изменения в транскрипционной регуляции для содействия опухолевомугенезу 7,8. Раковые заболевания с этими транслокациями обычно обладают спокойным мутационным ландшафтом, с небольшим количеством повторяющихся геномных аберраций, кроме патогномонального слияния4,9. Таким образом, непосредственное нацеливание на слитый белок является привлекательной терапевтической стратегией при этих заболеваниях. Однако эти онкогенные факторы транскрипции обычно состоят из низкосложного, внутренне неупорядоченного, транскрипционно активирующего домена, слитого с ДНК-связывающимдоменом (DBD)10,11,12,13,14. Как внутренне неупорядоченные домены (IDD), так и DBD этих белков оказались трудными для нацеливания с помощью обычных фармакологических подходов. Поэтому разработка новых терапевтических подходов требует более детального молекулярного понимания механизмов, используемых этими слияниями для аберрантного регулирования экспрессии генов.
N-концевая часть IDD EWSR1 обычно сливается с DBD при раке, включая EWS / FLI в саркоме Юинга, EWS / WT1 в диффузной мелкоклеточной опухоли и EWS / ATF1 в прозрачной клеточной саркоме мягких частей10. Механистическая роль EWS IDD в каждом из этих слияний не до конца понятна. Семейство слияний EWS/ETS, в частности EWS/FLI, является наиболее функционально охарактеризованным на сегодняшний день. EWS/FLI координирует общегенетные эпигенетические и транскрипционные изменения, приводящие к активации и подавлению тысяч генов7,11,15,16. Исследования показали, что IDD важен для набора как транскрипционных коактиваторов (таких как p300, WDR5 и комплекс BAF), так и ко-репрессоров (таких как комплекс NuRD)11,15,17. Слияние EWS IDD с C-концевой частью FLI1 придает новую ДНК-специфичность ETS DBD FLI1, так что слияние онкопротеина (EWS / FLI) связывается с повторяющимися GGAA-микросателлитными областями генома в дополнение к консенсусному мотиву ETS18,19,20. В сочетании с функцией рекрутирования коактиваторов эта возникающая ДНК-связывающая активность EWS/FLI способствует образованию de novo энхансеров в GGAA-микроспутниках дистальнее к стартовым участкам транскрипции (TSS) («энхансероподобные» микроспутники) и рекрутирует РНК-полимеразу II для содействия транскрипции на GGAA-микроспутниках, расположенных проксимально к TSS («промотороподобные» микроспутники)11,15,16,21.
Взятые вместе, эти данные привели нас к гипотезе о том, что дискретные элементы в области EWS способствуют набору различных сорегуляторов к различным типам сайтов связывания EWS / FLI. Тем не менее, распознавание этих элементов в части EWS EWS / FLI и то, как они функционируют, было затруднено очень повторяющимся и неупорядоченным характером области. Здесь мы используем ранее опубликованную систему спасения нокдауна в клетках саркомы Юинга для функционального отображения этих элементов в EWS IDD. В этой системе EWS/FLI истощается с помощью шРНК, нацеленной на 3'UTR гена FLI1, и экспрессия спасается с помощью различных конструкций МУТАНТНОЙ кДНК EWS/FLI, в которых отсутствуют 3'UTR7,17,22. Эти эксперименты были сосредоточены на конструкциях с различными делециями для отображения структурно-функциональной взаимосвязи между EWS IDD и важными онкогенными фенотипами, включая активацию репортерной конструкции GGAA-микросателлита, анализы формирования колоний и целевую валидацию EWS/FLI-активированных и -репрессированных генов7,17,22 . Однако эти исследования не смогли найти дискретные поддомены в EWS IDD в EWS / FLI, которые уникально важны либо для активации, либо для подавления. Все протестированные конструкции были либо способны активировать и подавлять специфические гены-мишени, что приводит к эффективному формированию колоний, либо не могли регулировать ни один из генов-мишеней EWS / FLI, что приводило к потере колониеобразования7,17,22.
Транскриптомный анализ, обеспечиваемый широким внедрением секвенирования следующего поколения, обычно используется для сравнения сигнатур экспрессии генов в двух условиях, часто в контексте скрининга или описательных исследований. Вместо этого мы хотели использовать возможность захвата данных экспрессии всего генома с использованием РНК-секвенирования (RNA-seq) для характеристики вклада IDD в функцию транскрипционного фактора. В этом случае RNA-seq сопряжен с системой нокдауна-спасения для изучения структурно-функциональной взаимосвязи домена EWS. Этот подход применим к другим факторам транскрипции слияния, включая другие слияния EWS или факторы транскрипции дикого типа с плохо изученной функцией, и имеет множество преимуществ по сравнению с другими анализами, используемыми для исследований функционального картирования, такими как репортерные анализы или целевая qRT-ПЦР. К ним относятся тестирование структурных детерминант функции в соответствующем контексте хроматина, способность тестировать несколько типов элементов ответа в одном анализе (т.е. активированные и репрессированные, GGAA-микросателлит и немироспутник и т.д.) и результирующая способность лучше обнаруживать частичную функцию.
Успешная реализация этого подхода зависит от клеточной системы, которая захватывает интересующие фенотипы (в данном случае клетки A673 с shRNA-опосредованным истощением EWS/FLI), и панели мутантных конструкций в векторе экспрессии, подходящем для клеточной системы (в данном случае pMSCV-гигро с различными мутантами EWS/FLI с тегами 3x-FLAG, которые будут доставлены ретровирусной трансдукцией). Вирусная трансдукция либо конструкций истощения на основе CRISPR, либо конструкций истощения на основе шРНК и конструкций экспрессии кДНК с соответствующим отбором для генерации стабильных клеточных линий, рекомендуется по сравнению с транзиторной трансфекцией. Последующая интерпретация результатов усиливается, когда транскриптомные данные могут быть сопряжены с другими данными, связанными с локализацией транскрипционного фактора и другими фенотипическими показаниями, если таковые имеются.
В данной работе мы применяем данный подход для характеристики активности мутанта DAF EWS/FLI14. Мутант DAF имеет 17 мутаций тирозина в аланин в повторяющихся областях EWS IDD EWS / FLI14. Этот конкретный мутант EWS был ранее зарегистрирован и не может активировать экспрессию репортерного гена при слиянии с ATF1 DBD14. Однако предварительные данные qRT-PCR свидетельствуют о том, что этот мутант смог активировать транскрипцию мишени EWS/FLI NR0B123. Описанный здесь транскриптомический подход позволил успешно обнаружить частичную функцию мутанта DAF. Связывая эти транскриптомные данные с информацией о мотивах связывания и распознавания EWS/FLI, мы также показываем, что мутант DAF сохраняет функцию при GGAA-микроспутниковых повторах. Эти результаты идентифицируют DAF как первый частично функциональный мутант EWS/FLI и выделяют функцию в немироспутниковых генах как важную для онкогенеза (как сообщалось23). Это демонстрирует силу этого транскриптомного подхода к картированию структуры и функции для обеспечения понимания функции онкогенных факторов транскрипции.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wet Lab Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FLI rabbit pAb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15289</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-lamin B1 rabbit pAb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16048</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-based system for introduction of mutant constructs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Determined by cell system used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For viral aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10131027</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293-EBNAs</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-10852</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 anti-FLAG mouse mAb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3165</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near IR-secondary antibodies</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985062</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>For viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8833</td>
			<td>Stored at 2 mg/mL stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74136</td>
			<td>Has gDNA removal columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>As dictated by cell system used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Determined by cell system used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-LT1</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>MIR 2304</td>
			<td>For viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Access to HPC environment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnnotationDbi</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.38.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cairo</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.5-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DESeq2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.16.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genefilter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.58.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggbiplot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>org.Hs.eg.db</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pheatmap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.0.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PuTTY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.4.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RColorBrewer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.1-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reshape2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rgl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.100.19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-studio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Version 2.6 or later</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sva</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.24.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrimGalore!</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinSCP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping the structure-function relationships of disordered oncogenic transcription factors using transcriptomic analysis

Многие виды рака характеризуются хромосомными транслокациями, которые приводят к экспрессии онкогенных факторов транскрипции слияния. Как правило, эти белки содержат внутренне неупорядоченный домен (IDD), слитый с ДНК-связывающим доменом (DBD) другого белка, и организуют широко распространенные транскрипционные изменения для содействия злокачественности. Эти слияния часто являются единственной повторяющейся геномной аберрацией в раковых заболеваниях, которые они вызывают, что делает их привлекательными терапевтическими мишенями. Тем не менее, нацеливание на онкогенные факторы транскрипции требует лучшего понимания механистической роли, которую низкосложные IDD играют в их функции. N-концевой домен EWSR1 представляет собой IDD, участвующий в различных факторах транскрипции онкогенного синтеза, включая EWS / FLI, EWS / ATF и EWS / WT1. Здесь мы используем РНК-секвенирование для исследования структурных особенностей домена EWS, важного для транскрипционной функции EWS/FLI в саркоме Юинга. Впервые выполнено шРНК-опосредованное истощение эндогенного слияния из клеток саркомы Юинга в паре с эктопической экспрессией различных EWS-мутантных конструкций. Затем РНК-секвенирование используется для анализа транскриптомов клеток, экспрессирующих эти конструкции, для характеристики функционального дефицита, связанного с мутациями в домене EWS. Интегрируя транскриптомный анализ с ранее опубликованной информацией о мотивах связывания ДНК EWS / FLI и геномной локализации, а также функциональными анализами на трансформирующую способность, мы смогли идентифицировать структурные особенности EWS / FLI, важные для онкогенеза, и определить новый набор генов-мишеней EWS / FLI, критически важных для саркомы Юинга. В данной работе демонстрируется использование РНК-секвенирования в качестве метода картирования структурно-функциональных отношений внутренне неупорядоченного домена онкогенных факторов транскрипции.

Watch this Scientific Journal Video about Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis at JoVE.com

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Внутренне неупорядоченные домены важны для функции фактора транскрипции онкогенного слияния. Чтобы терапевтически нацелиться на эти белки, требуется более подробное понимание регуляторных механизмов, используемых этими доменами. Здесь мы используем транскриптомику для отображения важных структурных особенностей внутренне неупорядоченного домена EWS в саркоме Юинга.

Отображение структурно-функциональных отношений неупорядоченных онкогенных факторов транскрипции с использованием транскриптомного анализа

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Определение и характеристика метастатическим факторов путем переноса генов в романе RIP-тег; РИП tva мышиных модель

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

С помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена, редактирования для изучения онкогенных активность мутантов Calreticulin в зависимых Cytokine гемопоэтических клеток

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Простой и быстрый метод для получения высокого качества опухоли ДНК от клинических патологических образцов с помощью касания отпечаток цитологии

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Интегрированная платформа для картирования генома общесистемной Chromatin государств с использованием высокопроизводительный чип последовательности в тканях опухоли

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

Двойное воздействие на дифференциации адипоциты костного факторов клеток меланомы

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

An Oncogenic Hepatocyte-Induced Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Cancer Arising in the Setting of Hepatic Inflammation and Fibrosis

Онкогенный гепатоцит индуцированной ортотопической мыши Модель гепатоцеллюлярного рака, возникающих в настройке воспаления печеночного и фиброза

The absence of a clinically relevant animal model addressing the typical immune characteristics of hepatocellular cancer (HCC) has significantly impeded ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Онкогенный ген Fusion Обнаружение Использование якорный мультиплекс полимеразы Цепная реакция после следующего поколения секвенирования

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Analyzing Tumor Gene Expression Factors with the CorExplorer Web Portal

Анализ факторов экспрессии генов опухоли с веб-порталом CorExplorer

Differential gene expression analysis is an important technique for understanding disease states. The machine learning algorithm CorEx has shown utility ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Идентификация регуляторов транскрипционных факторов с использованием средне-пролимчатого скрининга архиерейных библиотек и репортера на основе двойной люциферазы

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Оценка гибели клеток с использованием бесклеточного супернатанта пробиотиков в трехмерных сфероидных культурах колоректальных раковых клеток

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...