Name: flow cytometric characterization of murine b cell development
Uploaded: 2021-01-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development at JoVE.com

Wir danken Matthew Sleeman für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken auch den Kernabteilungen Vivarium Operations und Flow Cytometry bei Regeneron für die Unterstützung dieser Forschung.

Alle Mausstudien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Regeneron überwacht und genehmigt. Das Experiment wurde an Geweben von drei weiblichen C57BL/6J-Mäusen (17 Wochen) der Jackson Laboratories durchgeführt. Titrieren Sie alle Antikörper vor Beginn des Experiments, um die ideale Konzentration zu bestimmen. Wenn Sie Kompensationsperlen für die einfarbige Kompensation verwenden, stellen Sie sicher, dass sie so hell oder heller färben als Ihre Proben. Bewahren Sie alle Puffer, Antikörper...

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Die durchflusszytometrische Analyse von lymphatischem und nicht-lymphatischem Gewebe ermöglicht seit den 1980er Jahren die gleichzeitige Identifizierung und Zählung von B-Zell-Subpopulationen bei Mäusen und Menschen. Es wurde als Maß für die humorale Immunität verwendet und kann weiter angewendet werden, um die B-Zell-Funktionalität zu bewerten. Diese Methode nutzt die Verfügbarkeit von Reagenzien, um verschiedene Stadien der B-Zell-Reifung bei Mäusen und Menschen durch die gleichzeitige Analyse mehrerer Paramet...

Monoklonale Antikörper sind zunehmend zur bevorzugten Therapie für viele menschliche Krankheiten geworden, da sie Teil der Schulmedizin werden1,2. Wir haben zuvor gentechnisch veränderte Mäuse beschrieben, die effizient Antikörper produzieren, die vollständig menschliche variable Regionen mit Maus-IgH-Konstanten beherbergen3,4. Zuletzt haben wir gentechnisch veränderte Mäuse beschrieben, die antikörperähnliche Moleküle produzieren, die eine ausgeprägte Antigenbindung aufweisen5. Antikörper werden von B-Zellen sezerniert und bilden die Grundlage der adaptiven humoralen Immunität. Es gibt zwei verschiedene Arten von B-Zellen, B-1 und B-2. Bei Säugetieren stammen B-1-Zellen aus der fetalen Leber und sind nach der Geburt im Schleimhautgewebe und in der Pleura- und Peritonealhöhle angereichert, während B-2-Zellen vor der Geburt in der fetalen Leber und danach im Knochenmark (BM) entstehen. B-2-Zellen sind in sekundären lymphatischen Organen einschließlich Milz und Blut angereichert6,7,8. In der BM beginnen B-2 hämatopoetische Vorläuferzellen mit der Initiierung der Ig mu schweren Kettenumlagerung zu Pro-B-Zellen zu differenzieren9,10. Die erfolgreiche Umlagerung der schweren Ig-Kette und ihre Montage in den Prä-B-Zell-Rezeptor (Pre-BCR) führt zusammen mit der Signalgebung und proliferativen Expansion zu einer Differenzierung zu Prä-B-Zellen. Nachdem Prä-B-Zellen ihre Ig kappa (Igκ) oder, wenn unproduktiv, Ig lambda (Igλ) leichten Ketten neu angeordnet haben, paaren sie sich mit μ schweren Kette, was zu einer Oberflächen-IgM-BCR-Expression führt. Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass bekannt ist, dass die IgM-Oberflächenexpression unter Bedingungen der Autoreaktivität reduziert wird, was zur Selbsttoleranz in funktionell nicht reagierenden oder anergen B-Zellen beiträgt11,12. Unreife B-Zellen treten dann in ein Übergangsstadium ein, in dem sie beginnen, IgD mitzuexprimieren und vom BM in die Milz zu wandern. In der Milz nimmt die IgD-Expression weiter zu und die Zellen reifen zu einem zweiten Stadium von Übergangs-B-Zellen heran, gefolgt von der Vollendung ihres Reifungsstatus und der Entwicklung zu entweder marginalen Zonen( MZ) oder follikulären (Fol) Zellen13,14,15. Bei erwachsenen Mäusen bleibt die Anzahl der reifen B-Zellen in einer nicht erkrankten Umgebung konstant, obwohl täglich 10-20 Millionen unreife B-Zellen im BM erzeugt werden. Davon gelangen nur drei Prozent in den Pool der reifen B-Zellen. Die Größe des peripheren B-Zell-Kompartiments wird durch den Zelltod eingeschränkt, was zum Teil auf mehrere Faktoren zurückzuführen ist, darunter Selbstreaktivität und unvollständige Reifung16,17,18. Die durchflusszytometrische Analyse wurde umfassend eingesetzt, um viele Immunzellunterkompartimente bei Menschen und Mäusen zu charakterisieren und aufzuzählen. Während es einige Ähnlichkeiten zwischen menschlichen und murinen B-Zell-Kompartimenten gibt, gilt dieses Protokoll nur für die Analyse von murinen B-Zellen. Dieses Protokoll wurde mit dem Ziel entwickelt, gentechnisch veränderte Mäuse zu phänotypisieren, um festzustellen, ob genetische Manipulation die B-Zellentwicklung verändern würde. Die Durchflusszytometrie ist auch in vielen weiteren Anwendungen sehr beliebt, darunter bei der Messung von Zellaktivierung, Funktion, Proliferation, Zyklusanalyse, DNA-Gehaltsanalyse, Apoptose und Zellsortierung 19,20.
Die Durchflusszytometrie ist das Werkzeug der Wahl, um verschiedene Lymphozytenkompartimente bei Mäusen und Menschen zu charakterisieren, einschließlich komplexer Organe wie Milz, BM und Blut. Aufgrund der weit verbreiteten mausspezifischen Antikörperreagenzien für die Durchflusszytometrie kann mit dieser Technik nicht nur Zelloberflächenproteine, sondern auch intrazelluläre Phosphoproteine und Zytokine sowie funktionelle Auslesungen untersucht werden21. Hierin zeigen wir, wie Durchflusszytometrie-Reagenzien verwendet werden können, um B-Zell-Untergruppen zu identifizieren, wenn sie in sekundären lymphatischen Organen reifen und differenzieren. Nach der Optimierung der Färbebedingungen, der Probenhandhabung, der korrekten Geräteeinrichtung und Datenerfassung und schließlich der Datenanalyse kann ein Protokoll für die umfassende durchflusszytometrische Analyse des B-Zell-Kompartiments bei Mäusen verwendet werden. Eine solche umfassende Analyse basiert auf einer jahrzehntealten Nomenklatur, die von Hardy und Kollegen entwickelt wurde, wobei sich entwickelnde BM B-2-Zellen in Abhängigkeit von ihrer Expression von B220, CD43, BP-1, CD24, IgM und IgD22 in verschiedene Fraktionen (Fraction) unterteilt werden können. Hardy et al. zeigten, dass B220+ CD43 BM B-Zellen auf der Grundlage der BP-1- und CD24(30F1)-Expression in vier Untergruppen (Fraction A-C') unterteilt werden können, während B220+ CD43-(dim to neg) BM B-Zellen basierend auf der differentiellen Expression von IgD und Oberflächen-IgM23 in drei Untergruppen (Fraction D-F') aufgelöst werden können. Fraktion A (Prä-Pro-B-Zellen) sind definiert als BP-1- CD24 (30F1)-, Fraktion B (frühe Pro-B-Zellen) sind definiert als BP-1- CD24 (30F1)+, Fraktion C (späte Pro-B-Zellen) sind definiert als BP-1+ CD24 (30F1)+ und Fraktion C' (frühe Prä-B-Zellen) sind als BP-1+ und CD24high definiert. Darüber hinaus sind Fraktion D (Prä-B-Zellen) definiert als B220 + CD43- IgM- B-Zellen, und Fraktion E (neu erzeugte B-Zellen, Kombination von unreifen und Übergangszellen) sind definiert als B220 + CD43- IgM + B-Zellen und Fraktion F (reife, rezirkulierende B-Zellen) sind definiert als B220high CD43- IgM + B-Zellen. Im Gegensatz dazu kann die Mehrheit der naiven B-Zellen in der Milz in reife (B220+ CD93-) B-Zellen und Übergangszellen (T1, T2, T3) unterteilt werden, abhängig von der Expression von CD93, CD23 und IgM. Reife B-Zellen können basierend auf der Expression von IgM und CD21/CD35 in Marginalzonen und follikuläre Untergruppen aufgelöst werden, und follikuläre Untergruppen können weiter in reife follikuläre Typ I und follikuläre Typ II B-Zelluntergruppen unterteilt werden, abhängig von der Ebene ihrer IgM- und IgD-Oberflächenexpression24. Diese Milz-B-Zell-Populationen exprimieren überwiegend Igκ-Leichtketten. Schließlich wurden B-1 B-Zellpopulationen, die aus der fetalen Leber stammen und hauptsächlich in den Peritoneal- und Pleurahöhlen erwachsener Mäuse vorkommen, in der Literatur beschrieben. Diese peritonealen B-Zellen können von den zuvor beschriebenen B-2 B-Zellen durch ihre fehlende CD23-Expression unterschieden werden. Sie werden dann weiter in B-1a- oder B-1b-Populationen unterteilt, wobei erstere durch das Vorhandensein von CD5 und letztere durch sein Fehlen definiert werden25. B-1-Zell-Vorläufer sind in der fetalen Leber reichlich vorhanden, werden aber nicht in erwachsenen BM gefunden. Während B-1a- und B-1b-Zellen von verschiedenen Vorläuferzellen stammen, säen beide die Peritoneal- und Pleurahöhle24. Im Gegensatz zu B-2-Zellen sind B-1-Zellen einzigartig in der Lage, sich selbst zu erneuern und sind für die Produktion natürlicher IgM-Antikörper verantwortlich.
Defekte in der B-Zell-Entwicklung können in vielen Fällen auftreten, einschließlich Mängel in den Komponenten des BCR26,27, Störungen von Signalmolekülen, die die BCR-Signalstärke beeinflussen14,28,29, oder Störungen von Zytokinen, die das Überleben von B-Zellen modulieren30,31 . Die durchflusszytometrische Analyse der lymphatischen Kompartimente hat zur Charakterisierung der B-Zell-Entwicklungsblöcke bei diesen Mäusen und vielen anderen beigetragen. Ein Vorteil der durchflusszytometrischen Analyse von lymphatischen Kompartimenten besteht darin, dass sie die Möglichkeit bietet, Messungen an einzelnen Zellen durchzuführen, die aus lebendem dissoziiertem Gewebe gewonnen werden. Die Verfügbarkeit von Reagenzien in einem ständig wachsenden Spektrum von Fluorophoren ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer Parameter und die Beurteilung der B-Zell-Heterogenität. Darüber hinaus ergänzt die Aufzählung von B-Zellen durch durchflusszytometrische Analyse andere immunologische Assays wie immunhistochemische Methoden, die die Zelllokalisierung in lymphatischen Organen visualisieren, den Nachweis zirkulierender Antikörperspiegel als Maß für die humorale Immunität sowie die Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Messung von B-Zell-Antworten in realem Raum und Zeit32.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>22363611</td>
			<td>0.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL Eppendorf tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>22364111</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>352097</td>
			<td>15 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 gauge needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 gauge needle</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mM MACS SmartStrainer&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td>130-110-916&#160;</td>
			<td>70 mM cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U bottom plate&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer&#160;</td>
			<td>GIBCO&#160;</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>red blood cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acroprep Advance 96 Well Filter Plate</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>8027</td>
			<td>filter plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>17-0452-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD CompBead Anti-Mouse Ig/&#954;</td>
			<td>BD</td>
			<td>552843</td>
			<td>compensation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD CompBead Anti-Rat Ig/&#954;</td>
			<td>BD</td>
			<td>552844</td>
			<td>compensation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A8577</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BP-1</td>
			<td>BD</td>
			<td>740882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>566349</td>
			<td>brilliant stain buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>564011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>BD</td>
			<td>563168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>BD</td>
			<td>560143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD21/35</td>
			<td>BD</td>
			<td>562756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>740216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24 (HSA)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>138504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>561388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD43</td>
			<td>BD</td>
			<td>553270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD43</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>121206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5</td>
			<td>BD</td>
			<td>563194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD93</td>
			<td>BD</td>
			<td>740750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD93</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>136504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td>viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extended Fine Tip Transfer Pipette</td>
			<td>Samco</td>
			<td>233</td>
			<td>disposable transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSymphony A3 flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>custom order</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2)</td>
			<td>BD</td>
			<td>553142</td>
			<td>Fc block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Flowjo</td>
			<td></td>
			<td>flow cytometer analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>automated dissociation tube&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td>130-095-937</td>
			<td>tissue dissociator instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GR1 (Ly6C/6G)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgD</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>25-5790-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kappa</td>
			<td>BD</td>
			<td>550003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>407308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde, 32% Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True-Stain Monocyte Blocker</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>426103</td>
			<td>monocyte blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575038</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL XR</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>731050</td>
			<td>cell counter instrument&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric characterization of murine b cell development

Umfangreiche Studien haben die Entwicklung und Differenzierung von murinen B-Zellen in sekundären lymphatischen Organen charakterisiert. Antikörper, die von B-Zellen sezerniert werden, wurden isoliert und zu etablierten Therapeutika weiterentwickelt. Die Validierung der Entwicklung von murinen B-Zellen im Zusammenhang mit autoimmunanfälligen Mäusen oder bei Mäusen mit verändertem Immunsystem ist ein entscheidender Bestandteil der Entwicklung oder Erprobung von Therapeutika bei Mäusen und eine geeignete Anwendung der Durchflusszytometrie. Gut etablierte zytometrische Parameter des B-Zell-Flusses können verwendet werden, um die B-Zell-Entwicklung im murinen Peritoneum, Knochenmark und Milz zu bewerten, aber eine Reihe von Best Practices müssen eingehalten werden. Darüber hinaus sollte die durchflusszytometrische Analyse von B-Zell-Kompartimenten auch zusätzliche Ablesungen der B-Zell-Entwicklung ergänzen. Daten, die mit dieser Technik generiert werden, können unser Verständnis von wildtypischen, autoimmunanfälligen Mausmodellen sowie humanisierten Mäusen verbessern, die zur Erzeugung von Antikörpern oder antikörperähnlichen Molekülen als Therapeutika verwendet werden können.

Hier stellen wir die Gating-Strategie zur Charakterisierung der B-Zell-Entwicklung in Mausperitoneum, BM und Milz vor. Die Grundlage der Analyse bildet das Konzept der Färbung mit Lebensfähigkeitsfarbstoff, dann das Ausstecken von Dubletten basierend auf der Forward-Scatter-Area (FSC-A) und Forward-Scatter-Height (FSC-H) und schließlich das Ausgleiten von Trümmern durch Auswahl von Zellen nach ihren FSC-A- und Side-Scatter-Area (SSC-A) -Eigenschaften, hier als Größengatter bezeichne...

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Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

Wir beschreiben hierin eine einfache Analyse der Heterogenität des murinen Immun-B-Zell-Kompartiments im Peritoneum-, Milz- und Knochenmarkgewebe mittels Durchflusszytometrie. Das Protokoll kann angepasst und auf andere Mausgewebe ausgedehnt werden.

Durchflusszytometrische Charakterisierung der Entwicklung von Murinen B-Zellen

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

Die mit dieser Technik generierten Daten fördern das Verständnis von autoimmunanfälligen Mausmodellen sowie humanisierten Mäusen, die für allgemeine Antikörper- oder Antikörper-Lebenstherapeutika verwendet werden können. Die Verfügbarkeit von Reagenzien mit einem ständig wachsenden Spektrum an Fluorophoren ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer Parameter an einzelnen Zellen und die Beurteilung der B-Zell-Heterogenität. Dieses Protokoll wurde mit dem Ziel entwickelt, gentechnisch veränderte Mäuse zu phänotypisieren.um festzustellen, ob genetische Manipulation die B-Zell-Entwicklung verändern würde. Hallo, ich bin Faith Harris. Ich werde das Verfahren heute demonstrieren.Beginnen Sie damit, eine Million jedes Zelltyps von jedem Tier in eine 96-Well-U-Bodenplatte zu aliquotieren. Stellen Sie sicher, dass für alle Proben und Kontrollen ausreichend Vertiefungen verfügbar sind, einschließlich vollständiger Färbung, Fluoreszenz-Minus-Eins-Proben und nicht gefärbter Proben für jeden Fluorophor. Für das Knochenmarkreifungspanel und das Milzreifungspanel aliquote Zellen in zwei Vertiefungen, 1 Million Zellen pro Vertiefung für jede vollständige Fleckenprobe.Für die Single-Color-Compensation-Lebensfähigkeitskontrollen fügen Sie jeweils zwei Millionen Zellen jedes Zelltyps zu einzelnen Vertiefungen hinzu. Zentrifugieren Sie die Platte bei 845 x g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Dekantieren Sie den Überstand, indem Sie die Platte schnell umkehren und über eine Spüle streichen und darauf achten, dass die Vertiefungen nicht verunreinigt werden.Waschen Sie die Zellen zweimal in 200 Mikroliter DPBS. Zentrifugieren und dekantieren Sie den Überstand nach jedem Waschen. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern Lebensfähigkeitsfarbstoff, der in DPBS im Verhältnis eins zu 1000 verdünnt ist, und vermeiden Sie die Zellen, die für die Einzelfarbkompensation verwendet werden.Lassen Sie für jeden Fleckensatz mehrere nicht gebeizte Vertiefungen für eine vollständig ungefärbte Probe und andere Kontrollen, die Sie möglicherweise benötigen, sowie eine zusätzliche nicht gefärbte Vertiefung für die FMO-Kontrolle der Lebensfähigkeit. Fügen Sie PBS zu diesen Bohrlöchern hinzu. Resuspend die Zellen der Einfarbkompensation Lebensfähigkeit Kontrollen in 200 Mikroliter verdünnten Lebensfähigkeit Farbstoff.Übertragen Sie 100 Mikroliter dieser Zellen in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr und erhitzen Sie es fünf Minuten bei 65 Grad Celsius, dann übertragen Sie die beheizten Zellen mit den verbleibenden lebenden Zellen zurück in den ursprünglichen Brunnen. Inkubieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius für 30 Minuten vor Licht geschützt. Nach der Inkubation die Zellen zentrifugieren und den Überstand dekantieren, indem Sie die Platte streichen oder invertieren, ohne die anderen Vertiefungen zu kreuzkontaminieren.Waschen Sie die Zellen, indem Sie sie in 200 Mikrolitern DPBS wiederverwenden, dann zentrifugieren und dekantieren Sie den Überstand wie zuvor. Wiederholen Sie die DPBS-Wäsche erneut. Fügen Sie Mikroliter FC-Block, verdünnt mit Fleckenpuffer, in einem Verhältnis von eins zu 50 hinzu, um eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten.Für Peritonealzellen fügen Sie fünf Mikroliter Monozytenblocker hinzu, um die unspezifische Färbung zu reduzieren. Dann inkubieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius für 15 Minuten, geschützt vor Licht. Bereiten Sie vollständige Fleckenstammmischungen und FMOs im Fleckenpuffer für ein endgültiges Volumen von 100 Mikrolitern pro Million Zellen unter Verwendung der Antikörpertabellen im Textmanuskript vor.Ohne den FC-Block zu entfernen, fügen Sie 100 Mikroliter voller Fleckenmischungen und FMOs zu ausgewählten Vertiefungen hinzu. Bereiten Sie einzelne Farbkompensationskontrollen für jeden Antikörper und ein Fleckenset vor. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, wenn Sie Kompensationsperlen verwenden.Inkubieren Sie die Zellen und die Kügelchen bei vier Grad Celsius für 30 Minuten, geschützt vor Licht. Dann zentrifugieren und dekantieren Sie den Überstand, indem Sie die Platte invertieren und streicheln. Waschen Sie die Zellen und Perlen dreimal in 200 Mikrolitern Fleckenpuffer, wobei Sie den Überstand jedes Mal zentrifugieren und dekantieren.Resuspendieren Sie die Zellen und Kügelchen in 200 Mikrolitern 2% Paraformaldehyd in DPBS, um die Proben für die Analyse zu fixieren. Inkubieren Sie die Zelle und die Perlen bei vier Grad Celsius für 30 Minuten, geschützt vor Licht, dann zentrifugieren und dekantieren Sie den Überstand, indem Sie die Platte umkehren oder streicheln. Resuspendieren Sie die Zellen und Kügelchen in 200 Mikrolitern Fleckenpuffer.Legen Sie eine Filterplatte über eine saubere 96-Well-U-Bodenplatte und übertragen Sie jede Probe mit einer Multipipette in eine Vertiefung der Filterplatte. Zentrifugieren Sie die Filterplatte und dekantieren Sie den Überstand. Für die Knochenmark- und Milzreifungsplatten resuspendieren Sie die vollständig gefärbten Zellen in 100 Mikrolitern Fleckenpuffer.Kombinieren Sie die beiden Vertiefungen für jedes Tier zu einem Brunnen. Resuspendieren Sie die verbleibenden Panels, FMOs und Steuerungen in 200 Mikroliter Fleckenpuffer. Fixierte Zellen und Perlen über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren, vor Licht geschützt.Zeichnen Sie die Kompensationskontrollen für jedes Fleckenpanel mit den vorbereiteten Einzelfleckenkompensationen auf und legen Sie positive und negative Gatter für jede Probe fest. Berechnen Sie die Vergütungsmatrix mit der Software. Beginnen Sie mit der Erfassung der ersten Probe und stellen Sie sicher, dass die Gates entsprechend eingestellt sind.Stellen Sie die Maschine so ein, dass sie läuft, und zeichnen Sie die verschiedenen Zellereignisse für jede Probe auf, wie im Textmanuskript erwähnt. Fahren Sie mit der Datenanalyse mit einer Durchflusszytometrie-Analysesoftware fort und folgen Sie den Gating-Strategien im Textmanuskript. Die durchflusszytometrische Analyse zur Charakterisierung von peritonealen B-Zellen im Peritoneum zeigt die Häufigkeiten lebensfähiger Peritonealzellen, Gesamt-B-Zellen, B-1- und B-2-Untergruppen sowie B-1a- und B-1b-Zellen in Mäusen.Wenn Knochenmark-B-Zellen analysiert wurden, wurden Frequenzen von lebensfähigen Zellen, Gesamt-B-Zellen, Fraktion A, Prä-Pro-B-Zellen, Fraktion B, Fraktion C, Fraktion C'Fraktion D, unreife Fraktion E, Übergangsfraktion E und Fraktion F B-Zellen in Mäusen bestimmt. Die Analyse von Milz-B-Zellen zeigt die Häufigkeiten von lebensfähigen Milzzellen, Gesamt-B-Zellen, Übergangs-B-Zellen, T1-, T2-, T3-Zellen, reifen B-Zellen, follikulären I-Zellen, follikulären II-Zellen, Vorläufer- und reifen Randzonenzellen und B-1-Zellen bei Mäusen. Die Häufigkeiten von Immunglobulin kappa- und Immunglobulin-Lambda-B-Zellen in Mäusen wurden mit einer durchflusszytometrischen Analyse der Milz bestimmt.Wenn Sie dieses Protokoll ausführen, müssen Sie das Signal von einem Detektor, der ausblutet, mithilfe von Kompensationskontrollen in den nächsten auflösen. Diese Kontrollen könnten entweder einzeln gefärbt oder mit handelsüblichen Kompensationsperlen versehen sein. Zusätzliche Assays können in Verbindung mit der Durchflusszytometrie verwendet werden, wie die Immunhistochemie zur Visualisierung der Zelllokalisation in lymphatischen Organen sowie die Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Analyse von B-Zell-Antworten in realem Raum und Zeit.Die durchflusszytometrische Analyse der B-Zellkompartimente ermöglicht die Charakterisierung von Phänotypen, die mit BCR und damit verbundenen Mängeln, Störungen von BCR-Signalmolekülen oder Störungen von Zytokinen, die das Überleben von B-Zellen modulieren, assoziiert sind.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Mausmodell der CD40-Aktivierung von B-Zellen

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Durchflusszytometrische Isolation of Primary Murine Type II Alveolarepithelzellen für Funktionelle und Molekulare Studien

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolation und Analyse über Durchflusszytometrie von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn der Maus

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie von Gliom-Infiltration peripheren mononukleären Blutzellen

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolierung und Durchflusszytometrie Charakterisierung von murinen Dünndarms Lymphozyten

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Ein Mausmodell der Gruppe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Durchflusszytometrische Analyse von partikelgebundenen Bet v 1 Allergens in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...