Name: flow cytometric characterization of murine b cell development
Uploaded: 2021-01-22T12:30:00
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Ringraziamo Matthew Sleeman per la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo anche i dipartimenti Vivarium Operations e Flow Cytometry Core di Regeneron per aver supportato questa ricerca.

Tutti gli studi sui topi sono stati supervisionati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) di Regeneron. L'esperimento è stato condotto su tessuti di tre topi femmina C57BL / 6J (17 settimane di età) dei Jackson Laboratories. Titolare tutti gli anticorpi prima di iniziare l'esperimento per determinare la concentrazione ideale. Quando si utilizzano perline di compensazione per la compensazione monocolore, assicurarsi che siano brillanti o più luminose dei campioni. Mantenere tutti i tamponi...

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	<li>Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+therapy+with+monoclonal+antibodies+and+related+proteins.">Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins.</a> Clinical Medicine. 17 (3), 220 (2017).</li><li>Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+monoclonal+antibody+market.">The therapeutic monoclonal antibody market.</a> MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).</li><li>Macdonald, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+and+in+situ+genetic+humanization+of+6+Mb+of+mouse+immunoglobulin+genes.">Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5147-5152 (2014).</li><li>Murphy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+with+megabase+humanization+of+their+immunoglobulin+genes+generate+antibodies+as+efficiently+as+normal+mice.">Mice with megabase humanization of their immunoglobulin genes generate antibodies as efficiently as normal mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5153-5158 (2014).</li><li>Macdonald, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kappa-on-Heavy+(KoH)+bodies+are+a+distinct+class+of+fully-human+antibody-like+therapeutic+agents+with+antigen-binding+properties.">Kappa-on-Heavy (KoH) bodies are a distinct class of fully-human antibody-like therapeutic agents with antigen-binding properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 292-299 (2020).</li><li>Pieper, K., Grimbacher, B., Eibel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+biology+and+development.">B-cell biology and development.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131 (4), 959-971 (2013).</li><li>Nagasawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+niches+in+the+bone+marrow+required+for+B-cell+development.">Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development.</a> Nature Reviews: Immunology. 6 (2), 107-116 (2006).</li><li>Lund, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-producing+B+lymphocytes-key+regulators+of+immunity.">Cytokine-producing B lymphocytes-key regulators of immunity.</a> Current Opinion in Immunology. 20 (3), 332-338 (2008).</li><li>Martensson, I. L., Keenan, R. A., Licence, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pre-B-cell+receptor.">The pre-B-cell receptor.</a> Current Opinion in Immunology. 19 (2), 137-142 (2007).</li><li>von Boehmer, H., Melchers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoints+in+lymphocyte+development+and+autoimmune+disease.">Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease.</a> Nature Immunology. 11 (1), 14-20 (2010).</li><li>Goodnow, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+immunoglobulin+expression+and+functional+silencing+of+self-reactive+B+lymphocytes+in+transgenic+mice.">Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice.</a> Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).</li><li>Zikherman, J., Parameswaran, R., Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+antigen+tunes+the+responsiveness+of+naive+B+cells+but+not+T+cells.">Endogenous antigen tunes the responsiveness of naive B cells but not T cells.</a> Nature. 489 (7414), 160-164 (2012).</li><li>Melchers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoints+that+control+B+cell+development.">Checkpoints that control B cell development.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2203-2210 (2015).</li><li>Henderson, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Rac-dependent+checkpoint+in+B+cell+development+controls+entry+into+the+splenic+white+pulp+and+cell+survival.">A novel Rac-dependent checkpoint in B cell development controls entry into the splenic white pulp and cell survival.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 837-853 (2010).</li><li>Pillai, S., Cariappa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+follicular+versus+marginal+zone+B+lymphocyte+cell+fate+decision.">The follicular versus marginal zone B lymphocyte cell fate decision.</a> Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 767-777 (2009).</li><li>Shahaf, G., Zisman-Rozen, S., Benhamou, D., Melamed, D., Mehr, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Development+in+the+Bone+Marrow+Is+Regulated+by+Homeostatic+Feedback+Exerted+by+Mature+B+Cells.">Cell Development in the Bone Marrow Is Regulated by Homeostatic Feedback Exerted by Mature B Cells.</a> Frontiers in Immunology. 7, 77 (2016).</li><li>Nemazee, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+central+tolerance+for+B+cells.">Mechanisms of central tolerance for B cells.</a> Nature Reviews: Immunology. 17 (5), 281-294 (2017).</li><li>Petkau, G., Turner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+circuits+that+direct+early+B-cell+development.">Signalling circuits that direct early B-cell development.</a> Biochemical Journal. 476 (5), 769-778 (2019).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry:+An+Overview.">Flow Cytometry: An Overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-5 (2018).</li><li>Betters, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Flow+Cytometry+in+Clinical+Practice.">Use of Flow Cytometry in Clinical Practice.</a> Journal of the Advanced Practioner in Oncology. 6 (5), 435-440 (2015).</li><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project.">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature Reviews: Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li><li>Van Epps, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bringing+order+to+early+B+cell+chaos.">Bringing order to early B cell chaos.</a> Journal of Experimental Medicine. 203 (6), 1389 (2006).</li><li>Hardy, R. R., Carmack, C. E., Shinton, S. A., Kemp, J. D., Hayakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+and+characterization+of+pro-B+and+pre-pro-B+cell+stages+in+normal+mouse+bone+marrow.">Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow.</a> Journal of Experimental Medicine. 173 (5), 1213-1225 (1991).</li><li>Allman, D., Pillai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+B+cell+subsets.">Peripheral B cell subsets.</a> Current Opinion in Immunology. 20 (2), 149-157 (2008).</li><li>Shapiro-Shelef, M., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+plasma-cell+development.">Regulation of plasma-cell development.</a> Nature Reviews: Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).</li><li>Kitamura, D., Roes, J., Kuhn, R., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+B+cell-deficient+mouse+by+targeted+disruption+of+the+membrane+exon+of+the+immunoglobulin+mu+chain+gene.">A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene.</a> Nature. 350 (6317), 423-426 (1991).</li><li>Keenan, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Censoring+of+autoreactive+B+cell+development+by+the+pre-B+cell+receptor.">Censoring of autoreactive B cell development by the pre-B cell receptor.</a> Science. 321 (5889), 696-699 (2008).</li><li>Chan, V. W., Meng, F., Soriano, P., DeFranco, A. L., Lowell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+B+lymphocyte+populations+in+Lyn-deficient+mice+and+the+role+of+Lyn+in+signal+initiation+and+down-regulation.">Characterization of the B lymphocyte populations in Lyn-deficient mice and the role of Lyn in signal initiation and down-regulation.</a> Immunity. 7 (1), 69-81 (1997).</li><li>Zikherman, J., Doan, K., Parameswaran, R., Raschke, W., Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+differences+in+CD45+expression+unmask+functions+for+CD45+in+B-cell+development,+tolerance,+and+survival.">Quantitative differences in CD45 expression unmask functions for CD45 in B-cell development, tolerance, and survival.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 3-12 (2012).</li><li>Miyamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+proliferation+of+B+cells+and+auto-immunity+in+mice+lacking+protein+kinase+Cdelta.">Increased proliferation of B cells and auto-immunity in mice lacking protein kinase Cdelta.</a> Nature. 416 (6883), 865-869 (2002).</li><li>Mecklenbrauker, I., Kalled, S. L., Leitges, M., Mackay, F., Tarakhovsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+B-cell+survival+by+BAFF-dependent+PKCdelta-mediated+nuclear+signalling.">Regulation of B-cell survival by BAFF-dependent PKCdelta-mediated nuclear signalling.</a> Nature. 431 (7007), 456-461 (2004).</li><li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-engaged+B+cells+undergo+chemotaxis+toward+the+T+zone+and+form+motile+conjugates+with+helper+T+cells.">Antigen-engaged B cells undergo chemotaxis toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells.</a> PLoS Biology. 3 (6), 150 (2005).</li><li>Robinson, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry.">Flow Cytometry.</a> Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , 630-640 (2004).</li><li>Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+analysis+in+flow+cytometry:+the+future+just+started.">Data analysis in flow cytometry: the future just started.</a> Cytometry A. 77 (7), 705-713 (2010).</li><li>Cossarizza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+of+flow+cytometry+and+cell+sorting+in+immunological+studies.">Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies.</a> European Journal of Immunology. 47 (10), 1584 (2017).</li><li>Bigos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+index:+an+easy-to-use+metric+for+evaluation+of+different+configurations+on+the+same+flow+cytometer.">Separation index: an easy-to-use metric for evaluation of different configurations on the same flow cytometer.</a> Current Protocols in Cytometry. , 21 (2007).</li><li>Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+and+autoimmunity.">B cells and autoimmunity.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (6), 721-731 (2011).</li></ol>

L'analisi citometrica a flusso di tessuti linfoidi e non linfoidi ha permesso l'identificazione simultanea e l'enumerazione delle sottopopolazioni di cellule B nei topi e negli esseri umani dal 1980. È stato usato come misura dell'immunità umorale e può essere applicato ulteriormente per valutare la funzionalità delle cellule B. Questo metodo sfrutta la disponibilità di reagenti per valutare le diverse fasi della maturazione delle cellule B nei topi e nell'uomo, attraverso l'analisi simultanea di più parametri che ...

Gli anticorpi monoclonali sono diventati sempre più la terapia di scelta per molte malattie umane in quanto entrano a far parte della medicina tradizionale1,2. Abbiamo precedentemente descritto topi geneticamente modificati che producono in modo efficiente anticorpi che ospitano regioni variabili completamente umane con costanti IgH di topo3,4. Più recentemente, abbiamo descritto topi geneticamente modificati che producono molecole simili a anticorpi che hanno un legame antigene distinto5. Gli anticorpi sono secreti dalle cellule B e costituiscono la base dell'immunità umorale adattativa. Esistono due tipi distinti di cellule B, B-1 e B-2. Nei mammiferi, le cellule B-1 hanno origine nel fegato fetale e sono arricchite nei tessuti mucosi e nelle cavità pleurica e peritoneale dopo la nascita, mentre le cellule B-2 hanno origine nel fegato fetale prima della nascita e successivamente nel midollo osseo (BM). Le cellule B-2 sono arricchite negli organi linfoidi secondari tra cui la milza e il sangue6,7,8. Nel BM, i progenitori ematopoietici B-2 iniziano a differenziarsi in cellule pro-B all'inizio del riarrangiamento della catena pesante Ig mu9,10. Il riarrangiamento riuscito della catena pesante Ig e il suo assemblaggio nel recettore delle cellule pre-B (pre-BCR), insieme alla segnalazione e all'espansione proliferativa, porta alla differenziazione in cellule pre-B. Dopo che le cellule pre-B riorganizzano le loro catene leggere Ig kappa (Igκ), o se improduttive, Ig lambda (Igλ), si accoppiano con μ catena pesante, con conseguente espressione superficiale di IgM BCR. È importante sottolineare che l'espressione superficiale delle IgM è nota per essere ridotta in condizioni di autoreattività, contribuendo così all'autotolleranza nelle cellule B funzionalmente non reattive o anergiche11,12. Le cellule B immature entrano quindi in una fase di transizione, dove iniziano a co-esprimere IgD e migrano dal BM alla milza. Nella milza, l'espressione di IgD aumenta ulteriormente e le cellule maturano in un secondo stadio di cellule B di transizione, seguito dal completamento del loro stato di maturazione e dallo sviluppo in cellule della zona marginale (MZ) o follicolari (Fol)13,14,15. Nei topi adulti, in un ambiente non malato, il numero di cellule B mature rimane costante nonostante 10-20 milioni di cellule B immature vengano generate quotidianamente nel BM. Di questi, solo il tre per cento entra nel pool di cellule B mature. La dimensione del compartimento periferico delle cellule B è limitata dalla morte cellulare, dovuta in parte a diversi fattori tra cui l'auto-reattività e la maturazione incompleta16,17,18. L'analisi citometrica a flusso è stata ampiamente utilizzata per caratterizzare ed enumerare molti sottocompartimenti delle cellule immunitarie negli esseri umani e nei topi. Mentre ci sono alcune somiglianze tra compartimenti di cellule B umane e murine, questo protocollo si applica solo all'analisi delle cellule B murine. Questo protocollo è stato sviluppato con lo scopo di fenotipizzare topi geneticamente modificati, per determinare se la manipolazione genetica avrebbe alterato lo sviluppo delle cellule B. La citometria a flusso è stata anche molto popolare in molte applicazioni aggiuntive, tra cui la misurazione dell'attivazione cellulare, della funzione, della proliferazione, dell'analisi del ciclo, dell'analisi del contenuto del DNA, dell'apoptosi e dello smistamento cellulare 19,20.
La citometria a flusso è lo strumento di scelta per caratterizzare vari compartimenti linfocitari nei topi e nell'uomo, anche in organi complessi come la milza, il BM e il sangue. Grazie ai reagenti anticorpali specifici del topo ampiamente disponibili per la citometria a flusso, questa tecnica può essere utilizzata per studiare non solo le proteine di superficie cellulare, ma anche le fosfoproteine intracellulari e le citochine, nonché le letture funzionali21. Qui dimostriamo come i reagenti per citometria a flusso possono essere utilizzati per identificare i sottoinsiemi di cellule B man mano che maturano e si differenziano negli organi linfoidi secondari. Dopo l'ottimizzazione delle condizioni di colorazione, la gestione dei campioni, la corretta configurazione dello strumento e l'acquisizione dei dati e, infine, l'analisi dei dati, è possibile utilizzare un protocollo per l'analisi citometrica a flusso completa del compartimento delle cellule B nei topi. Tale analisi completa si basa su una nomenclatura vecchia di decenni ideata da Hardy e colleghi, in cui lo sviluppo di cellule BM B-2 può essere diviso in diverse frazioni (Frazione) a seconda della loro espressione di B220, CD43, BP-1, CD24, IgM e IgD22. Hardy et al., hanno dimostrato che le cellule B220+ CD43 BM B possono essere suddivise in quattro sottoinsiemi (Frazione A-C') sulla base dell'espressione DI BP-1 e CD24 (30F1), mentre le cellule B220+ CD43-(dim to neg) possono essere risolte in tre sottoinsiemi (Frazione D-F) basati sull'espressione differenziale di IgD e IgM23 di superficie. La frazione A (cellule pre-pro-B) è definita come BP-1- CD24 (30F1)-, la frazione B (prime cellule pro-B) è definita come BP-1- CD24 (30F1)+, la frazione C (cellule pro-B tardive) è definita come BP-1+ CD24 (30F1)+, e la frazione C' (prime cellule pre-B) è definita come BP-1+ e CD24high. Inoltre, la Frazione D (cellule pre-B) è definita come B220+ CD43- IgM- B, e la Frazione E (cellule B di nuova generazione, combinazione di cellule immature e transitorie) è definita come B220+ CD43- IgM+ B cells e la Frazione F (cellule B mature, a ricircolo) è definita come B220high CD43- IgM+ B cells. Al contrario, la maggior parte delle cellule B naïve presenti nella milza può essere suddivisa in cellule B mature (B220+ CD93-) e cellule transizionali (T1, T2, T3) a seconda dell'espressione di CD93, CD23 e IgM. Le cellule B mature possono essere risolte in zone marginali e sottoinsiemi follicolari basati sull'espressione di IgM e CD21/CD35, e sottoinsiemi follicolari possono essere ulteriormente suddivisi in sottoinsiemi follicolari maturi di tipo I e follicolari di tipo II B a seconda del livello della loro espressione superficiale IgM e IgD24. Queste popolazioni di cellule B spleniche esprimono prevalentemente la catena leggera Igκ. Infine, in letteratura sono state descritte popolazioni di cellule B-1 B, che hanno origine nel fegato fetale e si trovano principalmente nelle cavità peritoneale e pleurica di topi adulti. Queste cellule B peritoneali possono essere distinte dalle cellule B-2 B precedentemente descritte per la loro mancanza di espressione di CD23. Sono poi ulteriormente suddivisi in popolazioni B-1a o B-1b, con la prima definita dalla presenza di CD5 e la seconda dalla sua assenza25. I progenitori delle cellule B-1 sono abbondanti nel fegato fetale, ma non si trovano nel BM adulto. Mentre le cellule B-1a e B-1b provengono da diversi progenitori, entrambe seminano le cavità peritoneale e pleurica24. A differenza delle cellule B-2, le cellule B-1 sono in grado di auto-rinnovarsi e sono responsabili della produzione di anticorpi IgM naturali.
Difetti nello sviluppo delle cellule B possono insorgere in molti casi, tra cui carenze nei componenti del BCR26,27, perturbazioni di molecole di segnalazione che influenzano la potenza di segnalazione BCR14,28,29, o interruzione delle citochine che modulano la sopravvivenza delle cellule B30,31 . L'analisi citometrica a flusso dei compartimenti linfoidi ha contribuito alla caratterizzazione dei blocchi di sviluppo delle cellule B in questi topi e in molti altri. Un vantaggio dell'analisi citometrica a flusso dei compartimenti linfoidi è che offre la possibilità di effettuare misurazioni su singole cellule ottenute da tessuto dissociato vivo. La disponibilità di reagenti in una gamma sempre più ampia di fluorofori consente l'analisi simultanea di più parametri e consente la valutazione dell'eterogeneità delle cellule B. Inoltre, l'enumerazione delle cellule B mediante analisi citometrica a flusso integra altri saggi immunologici come i metodi immunoistochimici che visualizzano la localizzazione cellulare all'interno degli organi linfoidi, il rilevamento dei livelli di anticorpi circolanti come misura dell'immunità umorale, nonché due microscopi a fotoni per misurare le risposte delle cellule B nello spazio e nel tempo reali32.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>22363611</td>
			<td>0.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL Eppendorf tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>22364111</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>352097</td>
			<td>15 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 gauge needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 gauge needle</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mM MACS SmartStrainer&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td>130-110-916&#160;</td>
			<td>70 mM cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U bottom plate&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer&#160;</td>
			<td>GIBCO&#160;</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>red blood cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acroprep Advance 96 Well Filter Plate</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>8027</td>
			<td>filter plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>17-0452-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD CompBead Anti-Mouse Ig/&#954;</td>
			<td>BD</td>
			<td>552843</td>
			<td>compensation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD CompBead Anti-Rat Ig/&#954;</td>
			<td>BD</td>
			<td>552844</td>
			<td>compensation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A8577</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BP-1</td>
			<td>BD</td>
			<td>740882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>566349</td>
			<td>brilliant stain buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>564011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>BD</td>
			<td>563168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>BD</td>
			<td>560143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD21/35</td>
			<td>BD</td>
			<td>562756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>740216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24 (HSA)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>138504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>561388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD43</td>
			<td>BD</td>
			<td>553270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD43</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>121206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5</td>
			<td>BD</td>
			<td>563194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD93</td>
			<td>BD</td>
			<td>740750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD93</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>136504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td>viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extended Fine Tip Transfer Pipette</td>
			<td>Samco</td>
			<td>233</td>
			<td>disposable transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSymphony A3 flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>custom order</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2)</td>
			<td>BD</td>
			<td>553142</td>
			<td>Fc block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Flowjo</td>
			<td></td>
			<td>flow cytometer analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>automated dissociation tube&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td>130-095-937</td>
			<td>tissue dissociator instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GR1 (Ly6C/6G)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgD</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>25-5790-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kappa</td>
			<td>BD</td>
			<td>550003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>407308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde, 32% Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True-Stain Monocyte Blocker</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>426103</td>
			<td>monocyte blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575038</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL XR</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>731050</td>
			<td>cell counter instrument&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric characterization of murine b cell development

Studi approfonditi hanno caratterizzato lo sviluppo e la differenziazione delle cellule B murine negli organi linfoidi secondari. Gli anticorpi secreti dalle cellule B sono stati isolati e sviluppati in terapie ben consolidate. La convalida dello sviluppo delle cellule B murine, nel contesto di topi autoimmuni o in topi con sistema immunitario modificato, è una componente cruciale dello sviluppo o della sperimentazione di agenti terapeutici nei topi ed è un uso appropriato della citometria a flusso. Parametri citometrici a flusso di cellule B ben consolidati possono essere utilizzati per valutare lo sviluppo delle cellule B nel peritoneo murino, nel midollo osseo e nella milza, ma è necessario rispettare una serie di migliori pratiche. Inoltre, l'analisi citometrica a flusso dei compartimenti delle cellule B dovrebbe anche integrare ulteriori letture dello sviluppo delle cellule B. I dati generati utilizzando questa tecnica possono migliorare la nostra comprensione di modelli murini selvatici, autoimmuni e di topi umanizzati che possono essere utilizzati per generare anticorpi o molecole simili a anticorpi come terapeutici.

Qui presentiamo la strategia di gating per caratterizzare lo sviluppo delle cellule B nel peritoneo di topo, nel BM e nella milza. La base dell'analisi si forma attorno al concetto di colorazione con colorante di vitalità, quindi estraendo doppietti basati su Forward-Scatter-Area (FSC-A) e Forward-Scatter-Height (FSC-H), e infine estraendo i detriti selezionando le celle in base alle loro caratteristiche FSC-A e Side-Scatter-Area (SSC-A), qui indicate come size gate, che riflettono la di...

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Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

Descriviamo qui una semplice analisi dell'eterogeneità del compartimento delle cellule B immunitarie murine nel peritoneo, nella milza e nei tessuti del midollo osseo mediante citometria a flusso. Il protocollo può essere adattato ed esteso ad altri tessuti di topo.

Caratterizzazione citometrica a flusso dello sviluppo delle cellule B murine

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

I dati generati utilizzando questa tecnica favoriscono la comprensione dei modelli murini autoimmuni, così come dei topi umanizzati, che possono essere utilizzati per terapie generali di vita anticorpale o anticorpale. La disponibilità di reagenti con una gamma sempre più ampia di fluorofori, consente l'analisi simultanea di più parametri su singole cellule e consente la valutazione dell'eterogeneità delle cellule B. Questo protocollo è stato sviluppato con lo scopo di fenotipizzare topi geneticamente modificati.per determinare se la manipolazione genetica altererebbe lo sviluppo delle cellule B. Ciao, sono Faith Harris. Oggi dimostrerò la procedura.Inizia aliquotando un milione di ogni tipo di cellula da ciascun animale in una piastra a U a 96 pozzetti. Assicurarsi che siano disponibili pozzi sufficienti per tutti i campioni e i controlli, inclusi campioni di macchia completa, fluorescenza meno uno e campioni non macchiati per ciascun fluoroforo. Per il pannello di maturazione del midollo osseo e il pannello di maturazione della milza, le cellule aliquote in due pozzetti, 1 milione di cellule per pozzetto per ogni campione di macchia completa.Per i controlli di vitalità della compensazione del colore singolo, aggiungere due milioni di celle ciascuna di ciascun tipo di cella ai singoli pozzetti. Centrifugare la piastra a 845 x g per due minuti a quattro gradi Celsius. Decantare il surnatante invertendo rapidamente e facendo scorrere la piastra su un lavandino, facendo attenzione a non contaminare i pozzi.Lavare le celle due volte in 200 microlitri di DPBS. Centrifugare e decantare il surnatante dopo ogni lavaggio. Risospese le cellule in 100 microlitri di colorante di vitalità diluito in DPBS con un rapporto di uno a 1000, evitando le celle utilizzate per la compensazione del singolo colore.Per ogni set di macchie, lasciare diversi pozzetti non macchiati per un campione completamente non macchiato e altri controlli di cui potresti aver bisogno, nonché un ulteriore pozzo non macchiato per il controllo FMO di fattibilità. Aggiungi PBS a questi pozzi. Sospendere le celle dei controlli di vitalità di compensazione del colore singolo in 200 microlitri di colorante di vitalità diluito.Trasferire 100 microlitri di queste cellule in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri e riscaldarlo per cinque minuti a 65 gradi Celsius, quindi trasferire le celle riscaldate al pozzo originale con le cellule vive rimanenti. Incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 30 minuti al riparo dalla luce. Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule e decantare il surnatante facendo scorrere o invertire la piastra senza contaminare gli altri pozzetti.Lavare le cellule rieseguendo in 200 microlitri di DPBS, quindi centrifugare e decantare il surnatante come prima. Ripetere nuovamente il lavaggio DPBS. Aggiungere microlitri di blocco FC diluiti con tampone antimacchia in un rapporto da uno a 50 per ottenere una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro.Per le cellule peritoneali, aggiungere cinque microlitri di bloccante dei monociti per ridurre la colorazione non specifica. Quindi, incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 15 minuti, al riparo dalla luce. Preparare miscele complete di master di macchie e FMO nel tampone di colorazione per un volume finale di 100 microlitri per milione di cellule utilizzando le tabelle degli anticorpi nel manoscritto di testo.Senza rimuovere il blocco FC, aggiungere 100 microlitri di miscele di macchie complete e FMO ai pozzetti selezionati. Preparare controlli di compensazione del colore singolo per ogni anticorpo e un set di macchie. Seguire le istruzioni del produttore se si utilizzano perline di compensazione.Incubare le cellule e le perline a quattro gradi Celsius per 30 minuti, al riparo dalla luce. Quindi, centrifugare e decantare il surnatante invertendo e facendo scorrere la piastra. Lavare le cellule e le perline in 200 microlitri di tampone antimacchia tre volte, centrifugando e decantando il surnatante ogni volta.Risospesere le cellule e le perline in 200 microlitri di paraformaldeide al 2% in DPBS per fissare i campioni per l'analisi. Incubare la cellula e le perline a quattro gradi Celsius per 30 minuti, al riparo dalla luce, quindi centrifugare e decantare il surnatante invertendo o facendo scorrere la piastra. Risospesere le cellule e le perline in 200 microlitri di tampone antimacchia.Posizionare una piastra filtrante su una piastra a U pulita a 96 pozzetti e trasferire ogni campione in un pozzetto della piastra filtrante utilizzando una pipetta multipla. Centrifugare la piastra filtrante e decantare il surnatante. Per i pannelli di maturazione del midollo osseo e della milza, risospese le cellule completamente colorate in 100 microlitri di tampone antimacchia.Unire i due pozzetti per ogni animale in un unico pozzo. Risospendere i pannelli rimanenti, FMO e controlli in 200 microlitri di tampone antimacchia. Incubare cellule fisse e perline a quattro gradi Celsius durante la notte, al riparo dalla luce.Registrare i controlli di compensazione per ciascun pannello di macchia utilizzando le compensazioni a singola macchia preparate e impostare cancelli positivi e negativi per ciascun campione. Calcola la matrice di compensazione utilizzando il software. Inizia ad acquisire il primo campione, assicurandoti che i cancelli siano impostati in modo appropriato.Impostare la macchina per l'esecuzione e registrare i vari eventi di cella per ogni campione come menzionato nel manoscritto di testo. Procedere con l'analisi dei dati utilizzando un software di analisi della citometria a flusso, seguendo le strategie di gating nel manoscritto di testo. L'analisi citometrica a flusso per la caratterizzazione delle cellule B peritoneali nel peritoneo mostra le frequenze delle cellule peritoneali vitali, delle cellule B totali, dei sottoinsiemi B-1 e B-2, nonché delle cellule B-1a e B-1b nei topi.Quando sono state analizzate le cellule B del midollo osseo, sono state determinate le frequenze delle cellule vitali, delle cellule B totali, della frazione A, delle cellule pre-pro-B, della frazione B, della frazione C, della frazione C'D, della frazione immatura E, della frazione transitoria E e della frazione F B nei topi. L'analisi delle cellule B della milza mostra le frequenze delle cellule vitali della milza, delle cellule B totali, delle cellule B di transizione, delle cellule T1, T2, T3, delle cellule B mature, delle cellule follicolari I, delle cellule follicolari II, delle cellule precursori e mature della zona marginale e delle cellule B-1 nei topi. Le frequenze delle cellule B di immunoglobuline kappa e immunoglobuline lambda nei topi sono state determinate con l'analisi citometrica a flusso della milza.Quando si esegue questo protocollo, è necessario risolvere il segnale da un rilevatore di sanguinamento al successivo utilizzando i controlli di compensazione. Questi controlli potrebbero essere macchiati singolarmente o con perle di compensazione disponibili in commercio. Ulteriori saggi possono essere utilizzati in combinazione con la citometria a flusso, come l'immunoistochimica per visualizzare la localizzazione cellulare all'interno degli organi linfoidi, nonché due microscopia fotonica per analizzare le risposte delle cellule B nello spazio e nel tempo reali.L'analisi citometrica a flusso dei compartimenti delle cellule B consente la caratterizzazione dei fenotipi associati alla BCR e alle relative carenze, perturbazioni delle molecole di segnalazione BCR o interruzione delle citochine che modulano la sopravvivenza delle cellule B.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Modello murino di CD40-attivazione delle cellule B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Analisi Citometria a flusso di cellule immunitarie all&#39;interno aorte Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flusso Isolamento citometrica di primari murini di tipo II cellule alveolari epiteliali per gli studi funzionali e molecolari

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolamento e analisi citofluorimetrica delle cellule immunitarie dal cervello ischemica mouse

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

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Isolamento e analisi citofluorimetrica di-Glioma infiltrazione sangue periferico mononucleari Cellule

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolamento e caratterizzazione citometria a flusso di Murine Piccolo intestinale Linfociti

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Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

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Flusso analisi di citometria di Particle-bound Bet v 1 allergene in PM10

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Flusso analisi di citometria di Natural Killer cellulare Lytic attività nel Sangue umano intero

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

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Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...