Name: flow cytometric characterization of murine b cell development
Uploaded: 2021-01-22T12:30:00
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원고를 비판적으로 읽어주신 매튜 슬리먼에게 감사드립니다. 우리는 또한 이 연구를 지원해 준 Regeneron의 Vivarium 운영 및 플로우 세포측정 핵심 부서에 감사드립니다.

모든 마우스 연구는 Regeneron의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 감독되고 승인되었습니다. 이 실험은 잭슨 연구소에서 3개의 C57BL/6J 암컷 마우스(17주)에서 조직에 대해 수행하였다. 이상적인 농도를 결정하기 위해 실험을 시작하기 전에 모든 항체를 적중시한다. 단일 색상 보정을 위해 보상 구슬을 사용할 때 샘플보다 밝거나 밝은 얼룩이 있는지 확인하십시오. 모든 완충제, 항체 및 세?...

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	<li>Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+therapy+with+monoclonal+antibodies+and+related+proteins.">Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins.</a> Clinical Medicine. 17 (3), 220 (2017).</li><li>Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+monoclonal+antibody+market.">The therapeutic monoclonal antibody market.</a> MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).</li><li>Macdonald, L. 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림프및 비 림프구 조직의 흐름 세포 분석은 1980 년대 이후 마우스와 인간에서 B 세포 하위 집단의 동시 식별 및 열거를 가능하게했다. 그것은 유머 면역의 척도로 사용되었으며 B 세포 기능을 평가하기 위해 더 적용 할 수 있습니다. 이 방법은 희귀 한 집단에서도 B 세포 이질성의 평가를 가능하게하는 다중 매개 변수의 동시 분석을 통해 마우스와 인간에서 B 세포 성숙의 다른 단계를 평가하기 위해...

단일 클론 항체는 주류 의학의 일부가됨에 따라 점점 많은 인간 질환에 대한 선택 요법이되고있다1,2. 우리는 이전에 마우스 IgH constants3,4를 가진 완전히 인간 변수 지역을 항구하는 항체를 능동하게 생성하는 유전자 조작 마우스를 기술했습니다 3,4. 가장 최근에, 우리는 뚜렷한 항원 결합5가 있는 항체 같이 분자를 생성하는 유전자 조작한 마우스를 기술했습니다5. 항체는 B 세포에 의해 분비되고 적응성 유머 면역의 기초를 형성합니다. B 세포, B-1 및 B-2의 2개의 명백한 모형이 있습니다. 포유동물에서 B-1 세포는 태아 간에서 유래하고 출생 후 점막 조직및 흉막 및 복막 구멍에서 풍부하게 되며, B-2 세포는 출생 전 과 그 이후 골수 (BM)에서 태아 간에서 유래한다. B-2 세포는 비장 과 혈액6,7,8을 포함하여 이차 림프성 기관에서 농축된다. BM에서, B-2 조혈 선조는 Ig mu 무거운 사슬 재배열9,10의 개시에 프로 B 세포를 분화하기 시작합니다. Ig 중형 사슬과 조립을 사전 B세포 수용체(pre-BCR)로 성공적으로 재배열하여 시그널링 및 증식 확장과 함께 사전 B 세포로 분화합니다. 사전 B 세포가 Ig kappa(Igθ)를 재배열하거나 비생산적인 경우 Ig lambda(Igλ) 광 사슬을 재배열한 후 μ 무거운 사슬과 결합하여 표면 IgM BCR 발현이 발생합니다. IgM 표면 발현은 자가 반응성 조건하에서 감소되는 것으로 알려져 있으며, 따라서 기능적으로 반응성이 없거나 식욕 부진 B cells11,12에서 자기 허용오차에 기여하는 것이 중요하다. 미숙한 B 세포는 전환 단계에 들어가서 IgD를 공동 발현하고 BM에서 비장으로 이동합니다. 비장에서, IgD 발현은 더 증가하고 세포는 과도기 B 세포의 두 번째 단계로 성숙하고, 그들의 성숙 상태 및 한계 영역 (MZ) 또는 여포 (Fol) 세포로 의 발달의 완료에 선행됩니다13,14,15. 성인 마우스에서, 비병 환경에서, 성숙한 B 세포의 수는 BM에서 매일 생성되고 10-20000,000,000미성숙 B 세포에도 불구하고 일정하게 남아 있습니다. 이 중 3%만이 성숙한 B 세포의 풀을 입력합니다. 말초 B 세포 구획의 크기는 세포 사멸에 의해 제한되며, 부분적으로자가 반응성 및 불완전한 성숙을 포함한 여러 가지 요인으로 인해 16,17,18. 유동 세포 측정 분석은 인간과 마우스에 있는 많은 면역 세포 하위 구획을 특성화하고 예매하기 위하여 광범위하게 이용되었습니다. 인간과 뮤린 B 세포 구획 사이에 는 몇 가지 유사점이 있지만,이 프로토콜은 뮤린 B 세포의 분석에만 적용됩니다. 이 프로토콜은 유전자 조작이 B 세포 발달을 바꿀 지 여부를 결정하기 위해 유전자 조작 된 마우스를 phenotyping의 목적으로 개발되었습니다. 유동 세포측정은 또한 세포 활성화, 기능, 증식, 사이클 분석, DNA 함량 분석, 세포 분석, 세포 분류 19,20을 측정하는 등 많은 추가 응용 분야에서 큰 인기를 끌고 있다.
유동 세포측정은 비장, BM 및 혈액과 같은 복잡한 장기를 포함하여 마우스와 인간에서 다양한 림프구 구획을 특성화하는 데 선택하는 도구입니다. 유세포측정을 위한 마우스 특이적 항체 시약으로 인해, 이 기술은 세포 표면 단백질뿐만 아니라 세포내 인포단백질 및 사이토카인뿐만 아니라 기능적인 readouts21을 조사하는 데 사용될 수 있다. 본명 우리는 이차 림프구 기관에서 성숙하고 분화할 때 B 세포 하위 집합을 식별하는 데 어떻게 유동 세포 측정 시약을 사용할 수 있는지 보여줍니다. 염색 조건, 시료 처리, 올바른 계측기 설정 및 데이터 수집, 마지막으로 데이터 분석의 최적화 후, 마우스내 B 세포 구획의 포괄적인 유량 세포 측정 분석을 위한 프로토콜을 활용할 수 있다. 이러한 포괄적인 분석은 BM B-2 세포를 개발하는 것이 B220, CD43, BP-1, CD24, IgM 및 IgD22의 발현에 따라 다른 분획 (분수)으로 나눌 수 있는 하디와 동료에 의해 고안된 수십 년 된 명명율을 기반으로 합니다. Hardy 등., B220+ CD43 BM B 세포가 BP-1 및 CD24(30F1) 발현을 기준으로 4개의 하위 집합(분수 A-C')으로 세분화될 수 있는 반면, B220+ CD43-(dim to neg) BM B 셀은 이그3의 상이한 발현을 기반으로 3개의 하위 집합(분수 D-F)으로 해결할 수 있음을 보여주었다. 분수 A(pre-pro-B 세포)는 BP-1-CD24(30F1)-분수 B(초기 프로-B 셀)로 정의되며, 분수 C(초기 프로-B 셀)는 BP-1+ CD24(30F1)++, 및 분수 C(초기 BP-1)로 정의된다. 또한, 분수 D(사전 B 셀)는 B220+ CD43-IgM-B 세포로 정의되며, 분수 E(새로 생성된 B 셀, 미숙한 및 과도기의 조합)는 B220+ CD43-IgM+ B 세포 및 분수 F(성숙하고 재순환하는 B 셀)로 정의됩니다. 대조적으로, 비장에서 발견되는 순진한 B 세포의 대부분은 CD93, CD23 및 IgM의 발현에 따라 성숙한 (B220+ CD93-) B 세포 및 과도기 (T1, T2, T3) 세포로 나눌 수 있다. 성숙한 B 세포는 IgM 및 CD21/CD35의 발현에 기초하여 한계 영역 및 여포 서브세트로 해결될 수 있으며, 여포 서브세트는 그들의 IgM 및 IgD 표면 발현의 수준에 따라 성숙한 여포 타입 I 및 여포형 II B 세포 서브셋으로 더 나눌 수 있다24. 이러한 비장 B 세포 인구는 주로 Igθ 광 사슬을 표현합니다. 마지막으로, 태아 간에서 유래하고 성인 마우스의 복막 및 흉막 구멍에서 주로 발견되는 B-1 B 세포 인구는 문헌에 설명되어 있다. 이러한 회막 B 세포는 CD23 발현의 부족에 의해 이전에 설명된 B-2 B 세포와 구별될 수 있다. 그(것)들은 그 후에 B-1a 또는 B-1b 인구로 더 세분화됩니다, 전자는 CD5의 존재에 의해 정의되고 그것의 부재25에 의해 후자에 의해 정의됩니다. B-1 세포 선조는 태아 간에서 풍부하지만 성인 BM에서는 발견되지 않습니다. B-1a 및 B-1b 세포는 다른 선조에서 유래하는 동안, 둘 다 복막과 흉막 충치를 시드24. B-2 세포와는 달리, B-1 세포는 자기 재생이 유일하게 가능하고 천연 IgM 항체의 생산을 담당합니다.
B 세포 발달의 결함은 BCR26,27의 성분에 있는 결핍, BCR 신호 강도에 영향을 미치는 신호 분자의 동요 14,28,29, 또는 B 세포 생존을 조절하는 사이토카인의 중단을 포함하여 많은 경우에 생길 수 있습니다30,31 . 림프구의 유동 세포 분석은 이들 마우스 및 많은 다른 사람들의 B 세포 발달 블록의 특성화에 기여했다. 림프구의 유동 세포 분석의 한 가지 장점은 살아있는 해리 된 조직에서 얻은 개별 세포에 대한 측정을 할 수있는 능력을 제공한다는 것입니다. 형광의 계속 확장 범위에서 시약의 가용성은 다중 매개 변수의 동시 분석을 허용하고 B 세포 이질성의 평가를 가능하게한다. 더욱이, 유동 세포측정 분석에 의한 B 세포의 열거는 림프구 기관 내에서 세포 국소화를 시각화하는 면역조직화학 방법, 유머 면역의 척도로서 순환 항체 수준을 검출하는 면역학적 분석, 그리고 실제 공간과 시간 32에서 B 세포 반응을 측정하는 2개의 광자 현미경 검사법과 같은 다른 면역학적 분석을 보완한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>22363611</td>
			<td>0.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL Eppendorf tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>22364111</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>352097</td>
			<td>15 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 gauge needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 gauge needle</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mM MACS SmartStrainer&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td>130-110-916&#160;</td>
			<td>70 mM cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U bottom plate&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer&#160;</td>
			<td>GIBCO&#160;</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>red blood cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acroprep Advance 96 Well Filter Plate</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>8027</td>
			<td>filter plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>17-0452-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD CompBead Anti-Mouse Ig/&#954;</td>
			<td>BD</td>
			<td>552843</td>
			<td>compensation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD CompBead Anti-Rat Ig/&#954;</td>
			<td>BD</td>
			<td>552844</td>
			<td>compensation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A8577</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BP-1</td>
			<td>BD</td>
			<td>740882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>566349</td>
			<td>brilliant stain buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>564011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>BD</td>
			<td>563168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>BD</td>
			<td>560143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD21/35</td>
			<td>BD</td>
			<td>562756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>740216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24 (HSA)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>138504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>561388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD43</td>
			<td>BD</td>
			<td>553270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD43</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>121206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5</td>
			<td>BD</td>
			<td>563194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD93</td>
			<td>BD</td>
			<td>740750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD93</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>136504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td>viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extended Fine Tip Transfer Pipette</td>
			<td>Samco</td>
			<td>233</td>
			<td>disposable transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSymphony A3 flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>custom order</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2)</td>
			<td>BD</td>
			<td>553142</td>
			<td>Fc block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Flowjo</td>
			<td></td>
			<td>flow cytometer analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>automated dissociation tube&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td>130-095-937</td>
			<td>tissue dissociator instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GR1 (Ly6C/6G)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgD</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>25-5790-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kappa</td>
			<td>BD</td>
			<td>550003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>407308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde, 32% Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True-Stain Monocyte Blocker</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>426103</td>
			<td>monocyte blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575038</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL XR</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>731050</td>
			<td>cell counter instrument&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric characterization of murine b cell development

광범위한 연구는 이차 림프구 기관에서 뮤린 B 세포의 개발 및 분화를 특징으로합니다. B 세포에 의해 분비된 항체는 고립되고 잘 확립된 치료제로 개발되었습니다. murine B 세포 발달의 검증은 자가 면역 경향이 마우스의 맥락에서, 또는 수정된 면역 계통을 가진 마우스에서, 마우스에 있는 치료에이전트를 개발하거나 시험하는 중요한 분대이고 유동 세포측정의 적당한 사용입니다. 잘 확립된 B 세포 흐름 세포 계발성 파라미터는 뮤린 복막, 골수 및 비장의 B 세포 발달을 평가하는 데 사용될 수 있지만, 다수의 모범 사례를 준수해야 한다. 또한, B 세포 구획의 유동 세포 측정 분석은 또한 B 세포 발달의 추가 판독을 보완해야 한다. 이 기술을 사용하여 생성된 데이터는 항체 또는 항체 와 같은 분자를 치료제로 생성하는 데 사용할 수 있는 인간화된 마우스뿐만 아니라 야생 유형, 자가 면역 경향이 마우스 모델뿐만 아니라 인간화된 마우스에 대한 우리의 이해를 더욱 발전시킬 수 있습니다.

여기서 우리는 마우스 복막, BM 및 비장의 B 세포 발달을 특성화하기위한 게이팅 전략을 제시합니다. 분석의 기초는 생존 염료로 염색의 개념을 중심으로 형성되고, 전방 분산 영역 (FSC-A) 및 전방 분산 높이 (FSC-H)에 따라 두 배를 게이팅하고, 마지막으로 FSC-A 및 측면 분산 영역 (SSC-A) 특성에 따라 세포를 선택하여 이물질을 제거하여 이물질을 제거합니다. 관심있는 인구에 ?...

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Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

본 명세서에 의한 복막, 비장 및 골수 조직에서 뮤린 면역 B 세포 구획의 이질성에 대한 간단한 분석을 설명한다. 프로토콜을 다른 마우스 조직으로 조정하고 확장할 수 있습니다.

뮤린 B 세포 발달의 유동 세포 측정 특성화

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

이 기술을 사용하여 생성된 데이터는 일반 항체 또는 항체 생명 치료제에 사용될 수 있는 인간화된 마우스 모델뿐만 아니라 자가면역 경향이 마우스 모델의 이해를 촉진합니다. 형광의 계속 확장 범위를 가진 시약의 가용성은 개별 적인 세포에 다중 파라미터의 동시 분석을 허용하고 B 세포 이질성의 평가를 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 유전자 조작 된 마우스를 phenotyping의 목적으로 개발되었다.유전자 조작이 B 세포 발달을 바꿀 지 여부를 결정합니다. 안녕하세요, 저는 믿음 해리스입니다. 오늘 절차를 시연할 것입니다.각 동물에서 각 세포 유형의 백만을 96웰 U-바닥 플레이트로 알리싱하는 것으로 시작합니다. 전체 얼룩, 형광 - 마이너스 - 1 샘플 및 각 형광에 대한 얼룩이없는 샘플을 포함하여 모든 샘플 및 컨트롤에 충분한 우물을 사용할 수 있는지 확인하십시오. 골수 성숙 패널과 비장 성숙 패널의 경우, 각 전체 얼룩 샘플에 대해 잘 1백만 개의 세포로 알리쿼트 세포를 넣습니다.단일 색상 보정 생존가능성 컨트롤의 경우 각 셀 유형각각2백만 개의 셀을 개별 우물에 추가합니다. 섭씨 4도에서 2분간 845 x g의 플레이트원심분리기. 우물을 교차 오염시키지 않도록 주의하여 접시를 싱크대 위로 빠르게 반전시키고 쓸어 넘기면 상체를 제거합니다.DPBS의 200 마이크로 리터에서 두 번 세포를 세척합니다. 원심 분리기와 각 세척 후 상퍼를 디칭합니다. DPBS에서 희석된 생존성 염료 100마이크로리터에서 세포를 1-1000의 비율로 재일시 중단하여 단일 색상 보정에 사용되는 세포를 피한다.각 얼룩 세트에 대해 완전히 얼룩지지 않은 샘플 및 생존 가능성 FMO 제어를 위해 얼룩이 없는 추가 우물을 남기고 완전히 얼룩지지 않은 샘플 및 기타 컨트롤을 남겨 둡니다. 이러한 우물에 PBS를 추가합니다. 희석된 생존성 염료의 200 마이크로리터에서 단일 색상 보정 생존 가능성 제어의 세포를 다시 중단합니다.이 세포의 100 마이크로리터를 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기고 섭씨 65도에서 5분 동안 가열된 세포를 나머지 살아있는 세포와 함께 원래로 다시 옮기시다. 빛으로부터 보호되는 30분 동안 섭씨 4도에서 세포를 배양합니다. 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하고 다른 우물을 교차 오염시켜 서퍼나탄을 가볍게 하거나 반전시면 상퍼를 제거합니다.DPBS의 200 마이크로 리터에서 다시 중단하여 세포를 씻어 낸 다음 원심 분리기를 하고 이전과 같이 상퍼를 데칭하십시오. DPBS 세척을 다시 반복합니다. 1-50의 비율로 스테인 버퍼로 희석된 FC 블록의 마이크로리터를 추가하여 밀리리터당 10 마이크로그램의 최종 농도를 얻습니다.회중 세포의 경우, 비특이적 염색을 줄이기 위해 5개의 마이크로리터를 모노사이클 차단제를 첨가한다. 그런 다음, 빛으로부터 보호, 15 분 동안 섭씨 4도에서 세포를 배양. 텍스트 원고의 항체 테이블을 사용하여 백만 세포당 100 마이크로리터의 최종 부피를 위해 얼룩 버퍼에 전체 얼룩 마스터 믹스 및 FmOs를 준비합니다.FC 블록을 제거하지 않고, 선택한 우물에 전체 얼룩 믹스와 FmOS의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 각 항체 및 얼룩 세트에 대한 단일 색상 보정 컨트롤을 준비합니다. 보상 구슬을 사용하는 경우 제조업체의 지시에 따라 다.세포와 구슬을 4°C에서 30분간 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 그런 다음 원심 분리기를 뒤집어 접시를 가볍게 하여 상체를 장식합니다. 세포와 구슬을 200 마이크로리터의 얼룩 버퍼로 세 번 씻고 매번 상체를 원심분리하고 해독합니다.DPBS에서 2%파라포름알데히드의 200 마이크로리터에서 세포와 구슬을 다시 중단하여 분석을 위한 샘플을 수정합니다. 세포와 구슬을 섭씨 4도에서 30분간 배양하고, 빛으로부터 보호한 다음 원심분리기를 제거한 다음, 판을 뒤집거나 쓸어넘기면 상퍼를 데칭합니다. 얼룩 버퍼의 200 마이크로 리터에서 세포와 구슬을 다시 중단합니다.필터 플레이트를 깨끗한 96웰 U-바닥 플레이트 위에 놓고 각 샘플을 멀티 파이펫을 사용하여 필터 플레이트의 우물로 옮기습니다. 필터 플레이트를 원심 분리하고 상체를 데칭합니다. 골수 및 비장 성숙 패널의 경우 얼룩 버퍼 100 마이크로리터에서 완전히 얼룩진 세포를 다시 중단하십시오.각 동물에 대한 두 개의 우물을 하나의 우물로 결합합니다. 나머지 패널, FmOs 및 컨트롤을 스테인 버퍼 200마이크로리터에서 다시 중단합니다. 고정 된 세포와 구슬을 밤새 섭씨 4도에서 배양하여 빛으로부터 보호합니다.준비된 단일 얼룩 보정을 사용하여 각 얼룩 패널에 대한 보상 컨트롤을 기록하고 각 샘플에 대해 긍정적이고 음수 게이트를 설정합니다. 소프트웨어를 사용하여 보상 행렬을 계산합니다. 첫 번째 샘플을 획득하기 시작하여 게이트가 적절하게 설정되었는지 확인합니다.텍스트 원고에 언급된 대로 각 샘플의 다양한 셀 이벤트를 실행하고 기록하도록 컴퓨터를 설정합니다. 텍스트 원고의 게이팅 전략에 따라 흐름 세포 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 진행합니다. 복막에서 복막 B 세포의 특성화를 위한 유동 세포 측정 분석은 마우스에서 실행 가능한 복막 세포, 총 B 세포, B-1 및 B-2 서브셋뿐만 아니라 B-1a 및 B-1b 세포의 주파수를 나타낸다.골수 B 세포가 분석되었을 때, 실행 가능한 세포의 주파수, 총 B 세포, 분획 A, 사전 프로 B 세포, 분획 B, 분획 C, 분수 C'분수 D, 미성숙 분수 E, 과도기 분수 E 및 마우스내분수 F B 세포가 결정되었다. 비장 B 세포의 분석은 생쥐에서 실행 가능한 비장 세포, 총 B 세포, 과도기 B 세포, T1, T2, T3 세포, 성숙한 B 세포, 여포 I 세포, 여포 II 세포, 전구체 및 성숙한 한계 영역 세포 및 B-1 세포의 주파수를 나타낸다. 마우스내 면역글로불린 카파 및 면역글로불린 람다 B 세포의 주파수는 비장의 유동 세포 측정 분석으로 결정되었다.이 프로토콜을 수행할 때보정 컨트롤을 사용하여 한 검출기의 신호를 다음 단계로 이상 출혈로 해결해야 합니다. 이러한 컨트롤은 셀이 소독적으로 염색되거나 상업적으로 이용 가능한 보상 구슬이 있을 수 있습니다. 추가 분석법은 림프구 내세포 국소화를 시각화하기 위한 면역조직화학과 같은 유동 세포측정과 함께 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 실제 공간과 시간에 B 세포 반응을 분석하기 위해 2개의 광자 현미경 검사법을 사용할 수 있다.B 세포 구획의 유동 세포 분석은 BCR 및 관련 결핍, BCR 신호 분자의 방해 또는 B 세포 생존을 조절하는 사이토카인의 붕괴와 관련된 표현형의 특성화를 허용합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

B 세포의 CD40 - 정품 인증 Murine 모델

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

연구

면역학 및 감염병학

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

분리 및 신경 교종-침투 말초 혈액 단핵 세포의 유세포 분석

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

쥐 소장 림프구의 분리 및 유세포 특성

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

그룹 B의 쥐 모델<em&gt; 연쇄상 구균</em&gt; 질 식민

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

PM10의 입자 바인딩 베팅 1 절 알레르기의 유세포 분석

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...