Name: flow cytometric characterization of murine b cell development
Uploaded: 2021-01-22T12:30:00
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Agradecemos a Matthew Sleeman por la lectura crítica del manuscrito. También agradecemos a los departamentos de Operaciones de Vivarium y Núcleo de Citometría de Flujo en Regeneron por apoyar esta investigación.

Todos los estudios con ratones fueron supervisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Regeneron. El experimento se llevó a cabo en tejidos de tres ratones hembra C57BL / 6J (17 semanas de edad) de Jackson Laboratories. Valore todos los anticuerpos antes de comenzar el experimento para determinar la concentración ideal. Cuando use perlas de compensación para la compensación de un solo color, asegúrese de que se manchen tan brillantes o más brillantes que sus muestras. Ma...

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	<li>Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+therapy+with+monoclonal+antibodies+and+related+proteins.">Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins.</a> Clinical Medicine. 17 (3), 220 (2017).</li><li>Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+monoclonal+antibody+market.">The therapeutic monoclonal antibody market.</a> MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).</li><li>Macdonald, L. 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L., Leitges, M., Mackay, F., Tarakhovsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+B-cell+survival+by+BAFF-dependent+PKCdelta-mediated+nuclear+signalling.">Regulation of B-cell survival by BAFF-dependent PKCdelta-mediated nuclear signalling.</a> Nature. 431 (7007), 456-461 (2004).</li><li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-engaged+B+cells+undergo+chemotaxis+toward+the+T+zone+and+form+motile+conjugates+with+helper+T+cells.">Antigen-engaged B cells undergo chemotaxis toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells.</a> PLoS Biology. 3 (6), 150 (2005).</li><li>Robinson, J. 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El análisis citométrico de flujo de tejidos linfoides y no linfoides ha permitido la identificación y enumeración simultánea de subpoblaciones de células B en ratones y humanos desde la década de 1980. Se ha utilizado como una medida de la inmunidad humoral y se puede aplicar aún más para evaluar la funcionalidad de las células B. Este método aprovecha la disponibilidad de reactivos para evaluar diferentes etapas de maduración de células B en ratones y humanos, mediante el análisis simultáneo de múltiples...

Los anticuerpos monoclonales se han convertido cada vez más en la terapia de elección para muchas enfermedades humanas a medida que se convierten en parte de la medicina convencional1,2. Hemos descrito previamente ratones genéticamente modificados que producen eficientemente anticuerpos que albergan regiones variables completamente humanas con constantes de IgH de ratón3,4. Más recientemente, hemos descrito ratones genéticamente modificados que producen moléculas similares a anticuerpos que tienen una unión a antígenos distinta5. Los anticuerpos son secretados por las células B y forman la base de la inmunidad humoral adaptativa. Hay dos tipos distintos de células B, B-1 y B-2. En los mamíferos, las células B-1 se originan en el hígado fetal y se enriquecen en los tejidos de la mucosa y las cavidades pleural y peritoneal después del nacimiento, mientras que las células B-2 se originan en el hígado fetal antes del nacimiento y posteriormente en la médula ósea (BM). Las células B-2 se enriquecen en órganos linfoides secundarios, incluyendo el bazo y la sangre6,7,8. En el BM, los progenitores hematopoyéticos B-2 comienzan a diferenciarse a células pro-B al iniciar el reordenamiento de la cadena pesada Ig mu9,10. El reordenamiento exitoso de la cadena pesada de Ig y su ensamblaje en el receptor de células pre-B (pre-BCR), junto con la señalización y la expansión proliferativa, conduce a la diferenciación a células pre-B. Después de que las células pre-B reorganizan sus cadenas ligeras Ig kappa (Igκ), o si son improductivas, Ig lambda (Igλ), se emparejan con μ cadena pesada, lo que resulta en la expresión superficial de IgM BCR. Es importante señalar que se sabe que la expresión superficial de IgM se reduce en condiciones de autorreactividad, contribuyendo así a la autotolerancia en células B funcionalmente insensibles o anérgicas11,12. Las células B inmaduras entran en una etapa de transición, donde comienzan a coexpresar IgD y migran de la BM al bazo. En el bazo, la expresión de IgD aumenta aún más y las células maduran en una segunda etapa de células B de transición, seguida de la finalización de su estado de maduración y el desarrollo en células de zona marginal (MZ) o foliculares (Fol)13,14,15. En ratones adultos, en un entorno no enfermo, el número de células B maduras permanece constante a pesar de que se generan diariamente 10-20 millones de células B inmaduras en el BM. De estos, solo el tres por ciento ingresa al grupo de células B maduras. El tamaño del compartimento periférico de las células B está limitado por la muerte celular, debido en parte a varios factores, incluida la autorreactividad y la maduración incompleta16,17,18. El análisis citométrico de flujo se ha utilizado ampliamente para caracterizar y enumerar muchos subcompartimentos de células inmunes en humanos y ratones. Si bien existen algunas similitudes entre los compartimentos de células B humanas y murinas, este protocolo se aplica solo al análisis de células B murinas. Este protocolo fue desarrollado con el propósito de fenotipar ratones genéticamente modificados, para determinar si la manipulación genética alteraría el desarrollo de las células B. La citometría de flujo también ha sido muy popular en muchas aplicaciones adicionales, incluida la medición de la activación celular, la función, la proliferación, el análisis del ciclo, el análisis del contenido de ADN, la apoptosis y la clasificación celular 19,20.
La citometría de flujo es la herramienta de elección para caracterizar varios compartimentos de linfocitos en ratones y humanos, incluso en órganos complejos como el bazo, la BM y la sangre. Debido a los reactivos de anticuerpos específicos de ratón ampliamente disponibles para la citometría de flujo, esta técnica se puede utilizar para investigar no solo las proteínas de la superficie celular, sino también las fosfoproteínas y citoquinas intracelulares, así como las lecturas funcionales21. Aquí demostramos cómo los reactivos de citometría de flujo se pueden usar para identificar subconjuntos de células B a medida que maduran y se diferencian en los órganos linfoides secundarios. Después de la optimización de las condiciones de tinción, el manejo de muestras, la configuración correcta del instrumento y la adquisición de datos, y finalmente el análisis de datos, se puede utilizar un protocolo para el análisis citométrico de flujo integral del compartimiento de células B en ratones. Este análisis exhaustivo se basa en una nomenclatura de décadas de antigüedad ideada por Hardy y sus colegas, donde las células BM B-2 en desarrollo se pueden dividir en diferentes fracciones (Fracción) dependiendo de su expresión de B220, CD43, BP-1, CD24, IgM e IgD22. Hardy et al., demostraron que las células B B B220+ CD43 BM se pueden subdividir en cuatro subconjuntos (Fracción A-C') sobre la base de la expresión BP-1 y CD24 (30F1), mientras que las células B B BM B B CD43-(dim a neg) se pueden resolver en tres subconjuntos (Fracción D-F) basados en la expresión diferencial de IgD e IgM23 de superficie. La fracción A (células pre-pro-B) se definen como BP-1- CD24 (30F1)-, la fracción B (células pro-B tempranas) se definen como BP-1- CD24 (30F1)+, la fracción C (células pro-B tardías) se definen como BP-1+ CD24 (30F1)+, y la fracción C' (células pre-B tempranas) se definen como BP-1+ y CD24high. Además, la Fracción D (células pre-B) se definen como células B220+ CD43- IgM-B, y la Fracción E (células B recién generadas, combinación de células B inmaduras y de transición) se definen como células B B220+ CD43- IgM+ y la Fracción F (células B maduras, recircultantes) se definen como células B B220high CD43- IgM+. Por el contrario, la mayoría de las células B naïve que se encuentran en el bazo se pueden dividir en células B maduras (B220 + CD93-) y células de transición (T1, T2, T3) dependiendo de la expresión de CD93, CD23 e IgM. Las células B maduras pueden resolverse en subconjuntos de zonas marginales y foliculares basados en la expresión de IgM y CD21/CD35, y los subconjuntos foliculares se pueden dividir en subconjuntos de células B foliculares maduras tipo I y folicular tipo II dependiendo del nivel de su expresión superficial de IgM e IgD24. Estas poblaciones de células B esplénicas expresan predominantemente cadena ligera Igκ. Finalmente, las poblaciones de células B-1 B, que se originan en el hígado fetal y se encuentran principalmente en las cavidades peritoneal y pleural de ratones adultos, se han descrito en la literatura. Estas células B peritoneales se pueden distinguir de las células B B-2 descritas anteriormente por su falta de expresión de CD23. Luego se subdividen en poblaciones B-1a o B-1b, con la primera definida por la presencia de CD5 y la segunda por su ausencia25. Los progenitores de células B-1 son abundantes en el hígado fetal, pero no se encuentran en la BM adulta. Mientras que las células B-1a y B-1b se originan a partir de diferentes progenitores, ambas siembran las cavidades peritoneal y pleural24. A diferencia de las células B-2, las células B-1 son excepcionalmente capaces de autorrenovarse y son responsables de la producción de anticuerpos IgM naturales.
Los defectos en el desarrollo de las células B pueden surgir en muchos casos, incluyendo deficiencias en los componentes de la BCR26,27, perturbaciones de moléculas de señalización que afectan la intensidad de señalización de BCR14,28,29, o interrupción de citoquinas que modulan la supervivencia de las células B30,31 . El análisis de citometría de flujo de los compartimentos linfoides ha contribuido a la caracterización de los bloques de desarrollo de células B en estos ratones y muchos otros. Una ventaja del análisis citométrico de flujo de compartimentos linfoides es que ofrece la capacidad de realizar mediciones en células individuales obtenidas de tejido vivo disociado. La disponibilidad de reactivos en una gama cada vez mayor de fluoróforos permite el análisis simultáneo de múltiples parámetros y permite la evaluación de la heterogeneidad de las células B. Además, la enumeración de células B por análisis citométrico de flujo complementa otros ensayos inmunológicos como los métodos de inmunohistoquímica que visualizan la localización celular dentro de los órganos linfoides, la detección de niveles de anticuerpos circulantes como medida de la inmunidad humoral, así como la microscopía de dos fotones para medir las respuestas de las células B en el espacio y el tiempo reales32.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>22363611</td>
			<td>0.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL Eppendorf tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>22364111</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>352097</td>
			<td>15 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 gauge needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 gauge needle</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mM MACS SmartStrainer&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td>130-110-916&#160;</td>
			<td>70 mM cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U bottom plate&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer&#160;</td>
			<td>GIBCO&#160;</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>red blood cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acroprep Advance 96 Well Filter Plate</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>8027</td>
			<td>filter plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>17-0452-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD CompBead Anti-Mouse Ig/&#954;</td>
			<td>BD</td>
			<td>552843</td>
			<td>compensation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD CompBead Anti-Rat Ig/&#954;</td>
			<td>BD</td>
			<td>552844</td>
			<td>compensation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A8577</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BP-1</td>
			<td>BD</td>
			<td>740882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>566349</td>
			<td>brilliant stain buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>564011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>BD</td>
			<td>563168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>BD</td>
			<td>560143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD21/35</td>
			<td>BD</td>
			<td>562756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>740216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24 (HSA)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>138504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>561388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD43</td>
			<td>BD</td>
			<td>553270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD43</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>121206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5</td>
			<td>BD</td>
			<td>563194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD93</td>
			<td>BD</td>
			<td>740750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD93</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>136504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td>viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extended Fine Tip Transfer Pipette</td>
			<td>Samco</td>
			<td>233</td>
			<td>disposable transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSymphony A3 flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>custom order</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2)</td>
			<td>BD</td>
			<td>553142</td>
			<td>Fc block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Flowjo</td>
			<td></td>
			<td>flow cytometer analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>automated dissociation tube&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td>130-095-937</td>
			<td>tissue dissociator instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GR1 (Ly6C/6G)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgD</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>25-5790-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kappa</td>
			<td>BD</td>
			<td>550003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>407308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde, 32% Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True-Stain Monocyte Blocker</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>426103</td>
			<td>monocyte blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575038</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL XR</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>731050</td>
			<td>cell counter instrument&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric characterization of murine b cell development

Extensos estudios han caracterizado el desarrollo y la diferenciación de las células B murinas en los órganos linfoides secundarios. Los anticuerpos secretados por las células B han sido aislados y desarrollados en terapias bien establecidas. La validación del desarrollo de células B murinas, en el contexto de ratones propensos a la autoinmunidad, o en ratones con sistemas inmunes modificados, es un componente crucial del desarrollo o prueba de agentes terapéuticos en ratones y es un uso apropiado de la citometría de flujo. Se pueden utilizar parámetros citométricos de flujo de células B bien establecidos para evaluar el desarrollo de células B en el peritoneo murino, la médula ósea y el bazo, pero se deben seguir una serie de mejores prácticas. Además, el análisis citométrico de flujo de los compartimentos de células B también debe complementar las lecturas adicionales del desarrollo de células B. Los datos generados utilizando esta técnica pueden ampliar nuestra comprensión de los modelos de ratón propensos autoinmunes de tipo salvaje, así como de los ratones humanizados que se pueden usar para generar anticuerpos o moléculas similares a anticuerpos como terapéuticos.

Aquí presentamos la estrategia de gating para caracterizar el desarrollo de células B en peritoneo de ratón, BM y bazo. La base del análisis se forma en torno al concepto de tinción con tinte de viabilidad, luego se eliminan los dobletes basados en el Área de Dispersión Hacia Adelante (FSC-A) y la Altura de Dispersión Hacia Adelante (FSC-H), y finalmente se eliminan los desechos seleccionando las células de acuerdo con sus características FSC-A y Área de Dispersión Lateral (SS...

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Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

Describimos aquí un análisis simple de la heterogeneidad del compartimento de células B inmunes murinas en el peritoneo, el bazo y los tejidos de la médula ósea por citometría de flujo. El protocolo se puede adaptar y extender a otros tejidos de ratón.

Caracterización citométrica de flujo del desarrollo de células B murinas

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

Los datos generados utilizando esta técnica promueven una comprensión de los modelos de ratones propensos a la autoinmunidad, así como de los ratones humanizados, que se pueden utilizar para generalizar anticuerpos o terapias de vida de anticuerpos. La disponibilidad de reactivos con una gama cada vez mayor de fluoróforos permite el análisis simultáneo de múltiples parámetros en células individuales y permite la evaluación de la heterogeneidad de las células B. Este protocolo fue desarrollado con el propósito de fenotipar ratones genéticamente modificados.para determinar si la manipulación genética alteraría el desarrollo de las células B. Hola, soy Faith Harris. Voy a demostrar el procedimiento hoy.Comience por alícuar un millón de cada tipo de célula de cada animal en una placa de fondo en U de 96 pocillos. Asegúrese de que haya suficientes pozos disponibles para todas las muestras y controles, incluidas las muestras de tinción completa, fluorescencia menos uno y muestras no teñidas para cada fluoróforo. Para el panel de maduración de la médula ósea y el panel de maduración del bazo, alícuotas las células en dos pocillos, 1 millón de células por pocillo por cada muestra de tinción completa.Para los controles de viabilidad de compensación de color único, agregue dos millones de células cada una de cada tipo de célula a los pozos individuales. Centrifugar la placa a 845 x g durante dos minutos a cuatro grados centígrados. Decantar el sobrenadante invirtiendo rápidamente y moviendo la placa sobre un fregadero, teniendo cuidado de no contaminar los pozos.Lave las células dos veces en 200 microlitros de DPBS. Centrifugar y decantar el sobrenadante después de cada lavado. Resuspend las células en 100 microlitros de colorante de viabilidad diluido en DPBS en la proporción de uno a 1000, evitando las células utilizadas para la compensación de un solo color.Para cada juego de manchas, deje varios pozos sin teñir para una muestra completamente sin manchar y otros controles que pueda necesitar, así como un pozo adicional sin teñir para el control fmO de viabilidad. Agregue PBS a estos pozos. Resuspendir las células de los controles de viabilidad de compensación de un solo color en 200 microlitros de colorante de viabilidad diluido.Transfiera 100 microlitros de estas células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y caliéntelo durante cinco minutos a 65 grados centígrados, luego transfiera las células calentadas al pozo original con las células vivas restantes. Incubar las células a cuatro grados centígrados durante 30 minutos protegidos de la luz. Después de la incubación, centrífuga las células y decanta el sobrenadante moviendo o invirtiendo la placa sin contaminar los otros pozos.Lave las células resuspiendo en 200 microlitros de DPBS, luego centrífuga y decante el sobrenadante como antes. Repita de nuevo el lavado DPBS. Agregue microlitros de bloque FC diluido con tampón de manchas en una proporción de uno a 50 para obtener una concentración final de 10 microgramos por mililitro.Para las células peritoneales, agregue cinco microlitros de bloqueador de monocitos para reducir la tinción inespecífica. Luego, incuba las células a cuatro grados centígrados durante 15 minutos, protegidas de la luz. Prepare mezclas maestras de tinción completas y FMO en el tampón de manchas para un volumen final de 100 microlitros por millón de células utilizando las tablas de anticuerpos en el manuscrito de texto.Sin eliminar el bloque FC, agregue 100 microlitros de mezclas de manchas completas y FMO a los pozos seleccionados. Prepare controles de compensación de color único para cada anticuerpo y un juego de manchas. Siga las instrucciones del fabricante si usa perlas de compensación.Incubar las células y las cuentas a cuatro grados centígrados durante 30 minutos, protegidos de la luz. Luego, centrifuga y decanta el sobrenadante invirtiendo y moviendo la placa. Lave las células y las perlas en 200 microlitros de tampón de manchas tres veces, centrifugando y decantando el sobrenadante cada vez.Resuspend las células y perlas en 200 microlitros de paraformaldehído al 2% en DPBS para fijar las muestras para su análisis. Incubar la célula y las perlas a cuatro grados centígrados durante 30 minutos, protegidos de la luz, luego centrifugar y decantar el sobrenadante invirtiendo o moviendo la placa. Resuspend las células y cuentas en 200 microlitros de tampón de manchas.Coloque una placa de filtro sobre una placa limpia de 96 pocillos con fondo en U y transfiera cada muestra a un pozo de la placa de filtro utilizando una pipeta múltiple. Centrifugar la placa filtrante y decantar el sobrenadante. Para los paneles de maduración de la médula ósea y el bazo, resuspenda las células completamente teñidas en 100 microlitros de tampón de manchas.Combine los dos pozos para cada animal en un solo pozo. Resuspender los paneles, FMO y controles restantes en 200 microlitros de tampón de manchas. Incuba células fijas y cuentas a cuatro grados centígrados durante la noche, protegidos de la luz.Registre los controles de compensación para cada panel de manchas utilizando las compensaciones de manchas individuales preparadas y establezca puertas positivas y negativas para cada muestra. Calcule la matriz de compensación utilizando el software. Comience a adquirir la primera muestra, asegurándose de que las puertas estén configuradas adecuadamente.Configure la máquina para que funcione y registre los diversos eventos de celda para cada muestra como se menciona en el manuscrito de texto. Proceda con el análisis de datos utilizando el software de análisis de citometría de flujo, siguiendo las estrategias de cierre en el manuscrito de texto. El análisis citométrico de flujo para la caracterización de células B peritoneales en el peritoneo muestra las frecuencias de células peritoneales viables, células B totales, subconjuntos B-1 y B-2, así como células B-1a y B-1b en ratones.Cuando se analizaron las células B de la médula ósea, se determinaron las frecuencias de las células viables, las células B totales, la fracción A, las células pre-pro-B, la fracción B, la fracción C, la fracción C'fracción D, la fracción E inmadura, la fracción E de transición y las células B de la fracción F en ratones. El análisis de las células B esplénicas muestra las frecuencias de las células viables del bazo, las células B totales, las células B de transición, las células T1, T2, T3, las células B maduras, las células foliculares I, las células foliculares II, las células precursoras y maduras de la zona marginal y las células B-1 en ratones. Las frecuencias de inmunoglobulina kappa e inmunoglobulina lambda células B en ratones se determinaron con análisis citométrico de flujo del bazo.Al realizar este protocolo, debe resolver la señal de un detector sangrando al siguiente utilizando controles de compensación. Estos controles podrían ser de células teñidas individualmente o con cuentas de compensación disponibles comercialmente. Se pueden usar ensayos adicionales junto con la citometría de flujo, como la inmunohistoquímica para visualizar la localización celular dentro de los órganos linfoides, así como la microscopía de dos fotones para analizar las respuestas de las células B en el espacio y el tiempo reales.El análisis de citometría de flujo de los compartimentos de células B permite la caracterización de fenotipos asociados con BCR y deficiencias relacionadas, perturbaciones de moléculas de señalización de BCR o interrupción de citoquinas que modulan la supervivencia de las células B.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Modelo murino de CD40-activación de las células B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Investigación

Inmunología e Infección

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Análisis por citometría de flujo de células inmunes dentro de aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Citometría de flujo El aislamiento de células primarias murino tipo II alveolares epiteliales de Estudios funcionales y moleculares

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Aislamiento y análisis de citometría de flujo de células inmunes del cerebro isquémico Ratón

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

El aislamiento y la citometría de flujo análisis de las células mononucleares de sangre periférica Glioma infiltrantes

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

El aislamiento y la citometría de flujo Caracterización de murino Small intestinal linfocitos

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Un modelo murino de Grupo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonización vaginal

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Análisis de citometría de flujo de partículas unida a Bet v 1 de alérgenos en el MP10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Análisis de citometría de flujo de las células asesinas naturales lítico Actividad en sangre entera humana

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...