Name: microscopic observation of lymphocyte dynamics in rat peyer's patches
Uploaded: 2020-06-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches at JoVE.com

Questa ricerca è stata supportata da sovvenzioni del National Defense Medical College e da una borsa di ricerca per la salute e le scienze del lavoro per la ricerca sulle malattie intrattabili del Ministero della Salute, del Lavoro e del Welfare, Giappone.

Il protocollo sperimentale fu approvato dal Animal Research Committee del National Defense Medical College (n. 16058). Gli animali sono stati mantenuti su chow di laboratorio standard (CLEA Japan Inc, Tokyo, Giappone). Gli animali da laboratorio sono stati trattati in conformità con le linee guida degli Istituti Nazionali di Salute.
1. Raccolta e separazione dei linfociti
NOTA: Poiché i linfociti devono essere freschi e non possono essere conservati, devono essere r...

<ol>
	<li>Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunity+in+gut+and+lymphoid+cell+trafficking.">Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking.</a> Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).</li><li>Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+control+of+lymphocyte+trafficking:+a+general+overview.">Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview.</a> Immunology. 116, 1-12 (2005).</li><li>Yopp, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+receptors+regulate+chemokine-driven+transendothelial+migration+of+lymph+node+but+not+splenic+T+cells.">Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells.</a> The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).</li><li>Lucke, S., Levkau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+functions+of+sphingosine-1-phosphate.">Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).</li><li>Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+collection+of+lymph+from+the+liver,+small+intestine,+or+thoracic+duct+of+the+rat.">Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat.</a> The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).</li><li>Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+Intestinal+Lymphoid+Follicles+in+Rat+Peyer's+Patches.">Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).</li><li>Miura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Demonstration+of+Sequential+Migration+Process+of+Lymphocyte+Subpopulations+in+Rat+Peyer's+Patches.">Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).</li><li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cellular+movement+in+vivo+with+photoconvertible+fluorescence+protein+"Kaede"+transgenic+mice.">Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).</li><li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+of+Infected+Peyer's+Patches+Arises+From+Global,+Interferon-Receptor,+and+CD69-independent+Shutdown+of+Lymphocyte+Egress.">Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress.</a> Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).</li><li>Higashiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Selectin-Dependent+Monocyte+Recruitment+Through+Platelet+Interaction+in+Intestinal+Microvessels+of+LPS-Treated+Mice.">P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice.</a> Microcirculation. 15, 441-450 (2008).</li><li>Shirakabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+colitis+through+blocking+lymphopcytes+entry+to+Peyer's+patches+by+sphingosine-1-phosphate+lyase+inhibitor.">Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).</li><li>Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Microscopy:+Visualizing+Immunity+in+Context.">Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+Landscape+of+In+Vivo+Immunity:+Insights+from+Dynamic+In+Situ+Imaging+of+Secondary+Lymphoid+Tissues.">Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li></ol>

Qui abbiamo descritto un protocollo per la raccolta di linfociti intestinali-tropici ingenui e l'osservazione della loro migrazione nei PC di ratto. Queste procedure possono rivelare come i linfociti si muovono nella microvascolarizzazione dei PC e consentire di confrontare visivamente la loro dinamica in una condizione normale o medicata. L'osservazione diretta di queste dinamiche ha molto merito di ottenere un indizio per la modifica immunologica da parte di alcuni farmaci, anche se il periodo osservazionale è limitat...

Le chiazze di Peyer (PPs) sono costituite da centinaia di follicoli linfoidi nella lamina propria dell'intestino tenue. I PP sono divisi in follicoli, la regione interfollicolare e centri germinali situati nella parte inferiore dei follicoli, dove i linfociti sono stimolati dalla presentazione dell'antigene. Non ci sono vasi linfatici afferenti e gli antigeni invadono la lamina propria dal lume intestinale attraverso lo strato cellulare epiteliale. La regione epiteliale che copre i follicoli linfoidi è chiamata epitelio associato al follicolo, all'interno del quale le cellule M intervallate specializzate assuppongono gli antigeni mucosi. Le cellule M assupiscono antigeni dal lato luminale e gli antigeni vengono quindi catturati dalle cellule dendritiche e presentati verso linfociti ingenui che fluiscono nei PPs attraverso l'endotelio di alte venute endoteliali (HEV)1. I PP svolgono un ruolo importante nell'immunità intestinale e sono correlati con la fase iniziale dell'infiammazione. Molte interazioni molecolari coinvolgono l'ingresso di linfociti agli organi linfoidi secondari (SLO), comprese le molecole di adesione, le chemiochine2,3e la sfingosina-1-fosfato4; pertanto, ci sono molti obiettivi terapeutici attesi. Pertanto, osservare la dinamica dei linfociti all'interno dei PPs ci consente di intravedere la fase molto precoce dell'infiammazione ed esaminare l'utilità di diversi farmaci promettenti.
Il metodo qui si concentra sulla migrazione dei linfociti nei PS, che include diverse procedure (cannulazione nel dotto toracico5 e raccolta di linfociti e osservazione a lungo termine dopo l'iniezione nei linfociti raccolti). Poiché queste procedure sono complesse ed è stato difficile capire esattamente come ogni procedura è stata eseguita nelle relazioni precedenti, abbiamo menzionato qui alcuni suggerimenti per ottenere un'osservazione di successo. Ad esempio, la cannulazione dei tubi nel condotto toracico era molto difficile e il tasso iniziale di successo della cannulazione era inferiore al 50%. Tuttavia, abbiamo migliorato il metodo e raggiunto un tasso di successo superiore all'80%. Abbiamo menzionato alcuni altri suggerimenti in questo manoscritto che sono necessari per l'osservazione riuscita per consentire la valutazione quantitativa della migrazione transendoteliale dei linfociti in diverse condizioni.
Nei rapporti precedenti, era difficile comprendere i cambiamenti tridimensionali nel tempo, come l'iniezione endovenosa di inchiostro indiano per macchiare la struttura vascolare di PPs6, o il microscopio era monofocale7. Negli ultimi anni, un metodo osservazionale che utilizza alcuni animali transgenici proteici a fluorescenza fotoconvertibili come i topi Kaede ha chiarito i movimenti cellulari sistematici in vivo8. L'altro studio ha chiarito l'arresto indipendente del CD69 dell'uscita dei linfociti dai PPs9. Abbiamo utilizzato la microscopia a scansione laser confocale (CLSM) a causa della sua elevata capacità analitica. Ora possiamo facilmente ottenere immagini ad alta risoluzione e usarle per analizzare la dinamica dei linfociti.
In questa relazione, abbiamo dimostrato una serie di metodi per valutare la migrazione dei linfociti nei PC. In primo luogo, abbiamo mostrato metodi raffinati di cannulazione del dotto toracico per raccogliere i linfociti. In secondo luogo, abbiamo migliorato i metodi osservativi in diversi modi per mantenere organi oggettivi ogni volta che è possibile sotto osservazione microscopica, consentendoci di ottenere immagini di alta qualità per 3 ore. In terzo luogo, abbiamo quantificato i movimenti cellulari della migrazione dei linfociti per valutare gli effetti di alcuni farmaci. Questi protocolli modificati contribuiranno allo sviluppo di valutazioni dell'immunologia mucosa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:913px;" width="913">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">A1R+</td>
			<td style="width:213px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:265px;">Comfocal Laser Scanning Microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechest 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td style="width:119px;">099-06571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Texas Red&#8211;dextran</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopic observation of lymphocyte dynamics in rat peyer's patches

I linfociti ingenui ricircolano dal sangue ai tessuti linfoidi in condizioni fisiologiche ed è comunemente riconosciuto come un fenomeno importante nell'immunità intestinale. Lo stroma degli organi linfoidi secondari, come le chiazze di Peyer (PS) o i linfonodi mesenterici, sono dove i linfociti ingenui percepisce gli antigeni. I linfociti ingenui circolano attraverso il flusso sanguigno per raggiungere alte venute endoteliali, il portale di ingresso nei PC. Si stima che alcuni immunomodulatori influenzino la migrazione dei linfociti, ma la valutazione precisa della dinamica del microcircolo è molto difficile e stabilire un metodo per osservare la migrazione dei linfociti in vivo può contribuire al chiarimento dei meccanismi precisi. Abbiamo perfezionato il metodo di raccolta dei linfociti dal condotto linfatico e osservando la dinamica dettagliata dei linfociti intestinali-tropici nei PC di ratto. Abbiamo scelto la microscopia a scansione laser confocale per osservare i PC di ratto in vivo e l'abbiamo registrata utilizzando la fotografia time-lapse. Ora possiamo ottenere immagini chiare che possono contribuire all'analisi della dinamica dei linfociti.

Raccolta di linfociti dalla linfa Per preparare il ratto alla cannulazione del dotto toracico, fare un'incisione nel dotto toracico teso, come mostrato nella figura 1, quindi mantenere il ratto nella gabbia di Un Bollman, come mostrato nella figura 2.
Quando i linfociti sono ben raccolti, possiamo ottenere circa 20 mL / 6 h di liquido linfatico contenente circa 107~ 108/ mL linfociti. Tra i TD...

Watch this Scientific Journal Video about Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches at JoVE.com

Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

Qui descriviamo un metodo preciso per raccogliere linfociti del dotto toracico e osservare la migrazione dei linfociti intestinali-tropici nelle chiazze del ratto Peyer per 3 ore usando la fotografia time-lapse. Questa tecnica può chiarire come la dinamica dei linfociti sia influenzata in condizioni infiammatorie.

Osservazione microscopica della dinamica dei linfociti nelle patch di Rat Peyer

Na&#239;ve lymphocytes recirculate from the blood to the lymphoid tissues under physiological condition and it is commonly recognized as an important ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Lento rilascio Drug Delivery attraverso Elvax 40W al Rat Retina: Implicazioni per il trattamento di condizioni croniche

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Ricerca

Medicina

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Metodo ottimizzato di LC-MS/MS per l'analisi di High-throughput di campioni clinici di Ivacaftor, suoi principali metaboliti e Lumacaftor nei fluidi biologici di pazienti affetti da fibrosi cistica

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Implantation of hiPSC-derived Cardiac-muscle Patches after Myocardial Injury in a Guinea Pig Model

Impianto di hiPSC-derivato del muscolo cardiaco patch dopo lesione del miocardio in un modello della cavia

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

Una lesione segmentale del palloncino segmentale controllato dalla pressione carotide del ratto con applicazione terapeutica periadventitiale

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the ...

Acupuncture in a Rat Model of Asthma

Agopuntura in un modello di ratto di asma

A high platform can fix rats without restriction and completely expose the acupoints on the back during acupuncture manipulation. This article describes ...

Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts

Gestione avanzata del ritmo cardiaco applicando la fotostimolazione multi-sito optogenetica nei cuori murini

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is ...

The Microscopic Transcanal Approach in Stapes Surgery Revisited

The microscopic transcanal (aka transmeatal) surgical approach was first described in the 60s, offering a minimally invasive means of reaching the ...

Microscopic Replantation of Penile Glans Amputation Due to Circumcision

Reimpianto microscopico dell'amputazione del glande peniena dovuta alla circoncisione

Circumcision using a disposable stapler is becoming quite popular in China. However, improper surgical procedures also bring the risk of penile glans ...

Microscopic Cyst Resection for the Treatment of Patients Diagnosed with Epididymal Cyst

Resezione microscopica della cisti per il trattamento di pazienti con diagnosi di cisti epididimica

Epididymal cysts mostly occur in men aged 20-40 years old. Previous reports have covered concerns about postoperative complexes, including postoperative ...

Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation

Modello di ratto del trapianto di cuore eterotopico perfuso ex-situ normothermic

Heart transplantation is the most effective therapy for end-stage heart failure. Despite the improvements in therapeutic approaches and interventions, the ...