Name: microscopic observation of lymphocyte dynamics in rat peyer's patches
Uploaded: 2020-06-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra National Defense Medical College og av et forskningsstipend for helse- og arbeidsvitenskap for forskning på vanskelige sykdommer fra Helse-, arbeids- og velferdsdepartementet i Japan.

Den eksperimentelle protokollen ble godkjent av Animal Research Committee of National Defense Medical College (nr. 16058). Dyrene ble opprettholdt på standard laboratoriemat (CLEA Japan Inc, Tokyo, Japan). Laboratoriedyrene ble behandlet i henhold til Nasjonale helseinstitutter.
1. Innsamling og separasjon av lymfocytter
MERK: Siden lymfocytter må være friske og ikke kan lagres, må de samles inn fra rotter for hvert eksperiment. I tillegg må tarmtropiske lymfocyt...

<ol>
	<li>Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunity+in+gut+and+lymphoid+cell+trafficking.">Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking.</a> Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).</li><li>Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+control+of+lymphocyte+trafficking:+a+general+overview.">Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview.</a> Immunology. 116, 1-12 (2005).</li><li>Yopp, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+receptors+regulate+chemokine-driven+transendothelial+migration+of+lymph+node+but+not+splenic+T+cells.">Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells.</a> The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).</li><li>Lucke, S., Levkau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+functions+of+sphingosine-1-phosphate.">Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).</li><li>Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+collection+of+lymph+from+the+liver,+small+intestine,+or+thoracic+duct+of+the+rat.">Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat.</a> The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).</li><li>Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+Intestinal+Lymphoid+Follicles+in+Rat+Peyer's+Patches.">Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).</li><li>Miura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Demonstration+of+Sequential+Migration+Process+of+Lymphocyte+Subpopulations+in+Rat+Peyer's+Patches.">Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).</li><li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cellular+movement+in+vivo+with+photoconvertible+fluorescence+protein+"Kaede"+transgenic+mice.">Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).</li><li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+of+Infected+Peyer's+Patches+Arises+From+Global,+Interferon-Receptor,+and+CD69-independent+Shutdown+of+Lymphocyte+Egress.">Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress.</a> Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).</li><li>Higashiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Selectin-Dependent+Monocyte+Recruitment+Through+Platelet+Interaction+in+Intestinal+Microvessels+of+LPS-Treated+Mice.">P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice.</a> Microcirculation. 15, 441-450 (2008).</li><li>Shirakabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+colitis+through+blocking+lymphopcytes+entry+to+Peyer's+patches+by+sphingosine-1-phosphate+lyase+inhibitor.">Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).</li><li>Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Microscopy:+Visualizing+Immunity+in+Context.">Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+Landscape+of+In+Vivo+Immunity:+Insights+from+Dynamic+In+Situ+Imaging+of+Secondary+Lymphoid+Tissues.">Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li></ol>

Her beskrev vi en protokoll for innsamling av naive tarmtropiske lymfocytter og observere deres migrasjon hos rotte-PPer. Disse prosedyrene kan avsløre hvordan lymfocytter beveger seg i mikrovaskulaturen av PPer og gjør det mulig å visuelt sammenligne dynamikken under en normal eller medisinert tilstand. Den direkte observasjonen av disse dynamikkene har mye fortjeneste for å få en anelse om immunologisk modifikasjon av noen stoffer, selv om observasjonsperioden er begrenset til bare noen få timer.
<p class="jo...

Peyers patcher (PPer) består av hundrevis av lymfoide follikler i laminapropria i tynntarmen. PPs er delt inn i follikler, den interfollicular regionen, og germinal sentre som ligger i den nedre delen av folliklene, hvor lymfocytter stimuleres av antigenpresentasjon. Det er ingen afferent lymfatiske kar, og antigenene invaderer lamina propria fra tarmlumen via epitelcellelaget. Epitelregionen som dekker lymfoide follikler kalles follikkel-assosiert epitel, der spesialiserte ispedd M-celler tar opp slimhinneantigener. M celler tar i antigener fra luminalsiden og antigener blir deretter fanget av dendrittiske celler og presentert mot naive lymfocytter som strømmer inn i PPer gjennom endotelet av høye endotel venules (HEVs)1. PPs spiller en viktig rolle i tarmimmunitet og er relatert til det tidlige stadiet av betennelse. Mange molekylære interaksjoner involverer inngangen til lymfocytter til sekundære lymfoide organer (SFO), inkludert vedheftmolekyler, chemokines2,3og sphingosine-1-fosfat4; Dermed er det mange forventede terapeutiske mål. Derfor, observere lymfocytt dynamikken i PPs gjør oss i stand til å få et glimt av den svært tidlige fasen av betennelse og undersøke nytten av flere lovende legemidler.
Metoden her fokuserer på migrering av lymfocytter hos PPer, som inkluderer flere prosedyrer (kanylering i thoraxkanalen5 og innsamling av lymfocytter og langsiktig observasjon etter injeksjonen i innsamlede lymfocytter). Siden disse prosedyrene er komplekse og det var vanskelig å se nøyaktig hvordan hver prosedyre ble utført i tidligere rapporter, nevnte vi her noen tips for å oppnå en vellykket observasjon. For eksempel var hermetikk av rørene i thoraxkanalen svært vanskelig, og den første suksessraten for hermetikk var mindre enn 50%. Vi forbedret imidlertid metoden og oppnådde en suksessrate over 80%. Vi nevnte noen andre tips i dette manuskriptet som er nødvendige for vellykket observasjon for å muliggjøre kvantitativ evaluering av transendothelial migrasjon av lymfocytter under flere forhold.
I tidligere rapporter var det vanskelig å forstå de tredimensjonale endringene over tid, for eksempel intravenøs injeksjon av India-blekk for å flekke den vaskulære strukturen til PPs6, eller mikroskopet er monofokal7. I de senere årene har en observasjonsmetode ved hjelp av noen fotokonvertible fluorescensproteintransgene dyr som Kaede-mus avklart systematiske cellulære bevegelser in vivo8. Den andre studien avklart CD69 uavhengig nedleggelse av lymfocytt utgående fra PPs9. Vi brukte konfokal laserskanning mikroskopi (CLSM) på grunn av sin høye analytiske evne. Nå kan vi enkelt få høyoppløselige bilder og bruke dem til å analysere lymfocyttdynamikk.
I denne rapporten demonstrerte vi en rekke metoder for evaluering av lymfocyttmigrasjon i PPer. Først viste vi raffinerte metoder for thoraxkanal cannulation for å samle lymfocytter. For det andre forbedret vi observasjonsmetodene på flere måter for å opprettholde objektive organer når det er mulig under mikroskopisk observasjon, slik at vi kan få bilder av høy kvalitet i 3 timer. For det tredje kvantifiserte vi cellulære bevegelser av lymfocyttmigrasjon for å evaluere effekten av noen medisiner. Disse modifiserte protokollene vil bidra til utvikling av slimhinneimmunologievalueringer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:913px;" width="913">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">A1R+</td>
			<td style="width:213px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:265px;">Comfocal Laser Scanning Microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechest 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td style="width:119px;">099-06571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Texas Red&#8211;dextran</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopic observation of lymphocyte dynamics in rat peyer's patches

Naive lymfocytter resirkulerer fra blodet til lymfoidvevet under fysiologisk tilstand, og det er ofte anerkjent som et viktig fenomen i tarmimmuniteten. Stroma av sekundære lymfoide organer, som Peyers patcher (PPer) eller mesenteriske lymfeknuter, er der naive lymfocytter registrerer antigener. Naive lymfocytter sirkulerer gjennom blodet for å nå høye endotel venules, portalen for inntreden i PPs. Noen immunmodulatorer er anslått å påvirke lymfocyttmigrasjon, men den nøyaktige evalueringen av mikrosirkulasjonsdynamikk er svært vanskelig, og etablering av en metode for å observere lymfocyttmigrasjon in vivo kan bidra til avklaring av de nøyaktige mekanismene. Vi raffinerte metoden for å samle lymfocytter fra lymfekanalen og observere den detaljerte dynamikken i tarmtropiske lymfocytter hos rotte-PPer. Vi valgte konfokal laserskanning mikroskopi for å observere rotte PPs in vivo og registrert den ved hjelp av time-lapse fotografering. Vi kan nå få klare bilder som kan bidra til analyse av lymfocyttdynamikk.

Innsamling av lymfocytter fra lymfe For å forberede rotten for thoraxkanal cannulation, gjør et snitt i den spente thoraxkanalen som vist i figur 1 og deretter opprettholde rotten i en Bollmanbur som vist i figur 2.
Når lymfocytter er godt samlet, kan vi få ca 20 ml / 6 h lymfevæske som inneholder ca 107~ 108/ ml lymfocytter. Av TDLs, 70% express CD4, blant annet ca 90% celler uttrykke CD...

Watch this Scientific Journal Video about Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches at JoVE.com

Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

Her beskriver vi en presis metode for å samle thoraxkanallymfocytter og observere migrering av tarmtropiske lymfocytter hos rotte Peyers patcher i 3 timer ved hjelp av time-lapse fotografering. Denne teknikken kan avklare hvordan dynamikken i lymfocytter påvirkes under inflammatoriske forhold.

Mikroskopisk observasjon av lymfocyttdynamikk i Rotte Peyers patcher

Na&#239;ve lymphocytes recirculate from the blood to the lymphoid tissues under physiological condition and it is commonly recognized as an important ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Slow-release Drug Delivery gjennom Elvax 40W til Rat Retina: Konsekvenser for behandling av kroniske betingelser

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Optimalisert LC--MS-/ MS metoden for høy gjennomstrømming analyse av klinisk prøver av Ivacaftor, store metabolitter og Lumacaftor i biologiske væsker Cystic Fibrosis pasienter

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Implantation of hiPSC-derived Cardiac-muscle Patches after Myocardial Injury in a Guinea Pig Model

Implantering av hiPSC-avledet Hjertemuskel oppdateringer etter hjerteinfarkt skade i en Guinea Gris modell

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

En rotte carotis arterie trykkkontrollert segmental ballong skade med periadventitial terapeutisk applikasjon

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the ...

Acupuncture in a Rat Model of Asthma

Akupunktur i en rottemodell av astma

A high platform can fix rats without restriction and completely expose the acupoints on the back during acupuncture manipulation. This article describes ...

Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts

Avansert hjerterytmehåndtering ved å bruke optogenetisk multi-site fotostimulering i murine hjerter

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is ...

The Microscopic Transcanal Approach in Stapes Surgery Revisited

The microscopic transcanal (aka transmeatal) surgical approach was first described in the 60s, offering a minimally invasive means of reaching the ...

Microscopic Replantation of Penile Glans Amputation Due to Circumcision

Mikroskopisk replantasjon av penis glans amputasjon på grunn av omskjæring

Circumcision using a disposable stapler is becoming quite popular in China. However, improper surgical procedures also bring the risk of penile glans ...

Microscopic Cyst Resection for the Treatment of Patients Diagnosed with Epididymal Cyst

Mikroskopisk cystereseksjon for behandling av pasienter diagnostisert med epididymal cyste

Epididymal cysts mostly occur in men aged 20-40 years old. Previous reports have covered concerns about postoperative complexes, including postoperative ...

Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation

Rottemodell av normoterm ex-situ perfusert heterotopisk hjertetransplantasjon

Heart transplantation is the most effective therapy for end-stage heart failure. Despite the improvements in therapeutic approaches and interventions, the ...