Name: microscopic observation of lymphocyte dynamics in rat peyer's patches
Uploaded: 2020-06-25T15:00:00
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Esta investigación fue apoyada por subvenciones del National Defense Medical College y por una beca de investigación de Salud y Ciencias del Trabajo para la investigación sobre enfermedades intratables del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar, Japón.

El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Investigación Animal del Colegio Médico de Defensa Nacional (nº 16058). Los animales se mantuvieron en la comida de laboratorio estándar (CLEA Japan Inc, Tokio, Japón). Los animales de laboratorio fueron tratados de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud.
1. Recolección y separación de linfocitos
NOTA: Dado que los linfocitos deben estar frescos y no pueden almacenarse, deben se...

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	<li>Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunity+in+gut+and+lymphoid+cell+trafficking.">Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking.</a> Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).</li><li>Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+control+of+lymphocyte+trafficking:+a+general+overview.">Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview.</a> Immunology. 116, 1-12 (2005).</li><li>Yopp, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+receptors+regulate+chemokine-driven+transendothelial+migration+of+lymph+node+but+not+splenic+T+cells.">Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells.</a> The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).</li><li>Lucke, S., Levkau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+functions+of+sphingosine-1-phosphate.">Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).</li><li>Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+Intestinal+Lymphoid+Follicles+in+Rat+Peyer's+Patches.">Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).</li><li>Miura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Demonstration+of+Sequential+Migration+Process+of+Lymphocyte+Subpopulations+in+Rat+Peyer's+Patches.">Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).</li><li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cellular+movement+in+vivo+with+photoconvertible+fluorescence+protein+"Kaede"+transgenic+mice.">Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).</li><li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+of+Infected+Peyer's+Patches+Arises+From+Global,+Interferon-Receptor,+and+CD69-independent+Shutdown+of+Lymphocyte+Egress.">Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress.</a> Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).</li><li>Higashiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Selectin-Dependent+Monocyte+Recruitment+Through+Platelet+Interaction+in+Intestinal+Microvessels+of+LPS-Treated+Mice.">P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice.</a> Microcirculation. 15, 441-450 (2008).</li><li>Shirakabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+colitis+through+blocking+lymphopcytes+entry+to+Peyer's+patches+by+sphingosine-1-phosphate+lyase+inhibitor.">Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).</li><li>Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Microscopy:+Visualizing+Immunity+in+Context.">Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+Landscape+of+In+Vivo+Immunity:+Insights+from+Dynamic+In+Situ+Imaging+of+Secondary+Lymphoid+Tissues.">Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li></ol>

Aquí describimos un protocolo para recolectar linfocitos ingenuas de intestino y trópicos y observar su migración en PPs de ratas. Estos procedimientos pueden revelar cómo los linfocitos se mueven en la microvasculatura de los PPs y permiten comparar visualmente su dinámica bajo una condición normal o medicada. La observación directa de estas dinámicas tiene mucho mérito para obtener una pista de modificación inmunológica por parte de algunos fármacos, aunque el período observacional se limita a sólo unas p...

Los parches de Peyer consisten en cientos de folículos linfoides en la propria lamina del intestino delgado. Los PPs se dividen en folículos, la región interfollicular y los centros germinales ubicados en la parte inferior de los folículos, donde los linfocitos son estimulados por la presentación de antígenos. No hay vasos linfáticos aferentes, y los antígenos invaden la propria lamina del lúmenes intestinales a través de la capa celular epitelial. La región epitelial que cubre folículos linfoides se llama epitelio asociado al folículo, dentro del cual las células M intercaladas especializadas captan antígenos mucosos. Las células M toman antígenos del lado luminal y los antígenos son capturados por células dendríticas y presentados hacia linfocitos ingenuos que fluyen en PPs a través del endotelio de ventules endoteliales altos (HEV)1. Los PPs desempeñan un papel importante en la inmunidad intestinal y están relacionados con la etapa temprana de la inflamación. Muchas interacciones moleculares implican la entrada de linfocitos a órganos linfoides secundarios (SLOs), incluyendo moléculas de adhesión, quimioquinas2,3y esfingosina-1-fosfato4; por lo tanto, hay muchas dianas terapéuticas esperadas. Por lo tanto, observar la dinámica de linfocitos dentro de los PPs nos permite echar un vistazo a la etapa muy temprana de la inflamación y examinar la utilidad de varios fármacos prometedores.
El método aquí se centra en la migración de linfocitos en PPs, que incluye varios procedimientos (cannulación en el conducto torácico5 y recolección de linfocitos y observación a largo plazo después de la inyección en linfocitos recogidos). Dado que estos procedimientos son complejos y era difícil ver exactamente cómo se realizaba cada procedimiento en informes anteriores, mencionamos aquí algunos consejos para lograr una observación exitosa. Por ejemplo, la canulación de los tubos en el conducto torácico fue muy difícil, y la tasa de éxito inicial de la canulación fue inferior al 50%. Sin embargo, mejoramos el método y logramos una tasa de éxito superior al 80%. Mencionamos algunos otros consejos en este manuscrito que son necesarios para la observación exitosa para permitir la evaluación cuantitativa de la migración transendotelial de linfocitos en varias condiciones.
En informes anteriores, era difícil entender los cambios tridimensionales con el tiempo, como la inyección intravenosa de tinta india para manchar la estructura vascular de los PPs6,o el microscopio siendo monofocal7. En los últimos años, un método observacional utilizando algunos animales transgénicos de proteína de fluorescencia fotoconvertible como ratones Kaede han aclarado los movimientos celulares sistemáticos in vivo8. El otro estudio aclaró el apagado independiente CD69 de la salida de linfocitos de PPs9. Utilizamos microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) debido a su alta capacidad analítica. Ahora podemos obtener fácilmente imágenes de alta resolución y utilizarlas para analizar la dinámica de los linfocitos.
En este informe, demostramos una serie de métodos para evaluar la migración de linfocitos en los PPs. En primer lugar, mostramos métodos refinados de canulación de conductos torácicos para recolectar linfocitos. En segundo lugar, mejoramos los métodos de observación de varias maneras para mantener órganos objetivos siempre que sea posible bajo observación microscópica, lo que nos permite obtener imágenes de alta calidad durante 3 horas. En tercer lugar, cuantificamos los movimientos celulares de la migración de linfocitos para evaluar los efectos de algunos medicamentos. Estos protocolos modificados contribuirán al desarrollo de evaluaciones de inmunología mucosa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:913px;" width="913">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">A1R+</td>
			<td style="width:213px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:265px;">Comfocal Laser Scanning Microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechest 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td style="width:119px;">099-06571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Texas Red&#8211;dextran</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopic observation of lymphocyte dynamics in rat peyer's patches

Los linfocitos ingenuos recirculan de la sangre a los tejidos linfoides bajo condición fisiológica y comúnmente se reconoce como un fenómeno importante en la inmunidad intestinal. El estroma de órganos linfoides secundarios, como los parches de Peyer (PPs) o los ganglios linfáticos mesentericos, es donde los linfocitos ingenuos detectan antígenos. Los linfocitos ingenuos circulan a través del torrente sanguíneo para llegar a ventules endoteliales altos, el portal de entrada en PPs. Se estima que algunos inmunomoduladores influyen en la migración de linfocitos, pero la evaluación precisa de la dinámica de microcirculación es muy difícil, y establecer un método para observar la migración de linfocitos in vivo puede contribuir a la clarificación de los mecanismos precisos. Refinamos el método de recolección de linfocitos del conducto linfático y observando la dinámica detallada de los linfocitos trópicos intestinales en los PPs de rata. Elegimos la microscopía de escaneo láser confocal para observar los PPs de rata in vivo y la grabamos usando fotografía de lapso de tiempo. Ahora podemos obtener imágenes claras que puedan contribuir al análisis de la dinámica de los linfocitos.

Recolección de linfocitos de la linfa Para preparar la rata para la canulación del conducto torácico, haga una incisión en el tenso conducto torácico como se muestra en la Figura 1 y luego mantenga a la rata en la jaula de un Bollman como se muestra en la Figura 2.
Cuando los linfocitos están bien recogidos, podemos obtener alrededor de 20 ml/6 h de líquido linfático que contiene aproximadamente 107</s...

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Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

Aquí, describimos un método preciso para recoger linfocitos de conductos torácicos y observar la migración de linfocitos trópicos intestinales en parches de rata Peyer durante 3 horas utilizando fotografía de lapso de tiempo. Esta técnica puede aclarar cómo la dinámica de los linfocitos se ve afectada en condiciones inflamatorias.

Observación microscópica de la dinámica de linfocitos en los parches de Rat Peyer

Na&#239;ve lymphocytes recirculate from the blood to the lymphoid tissues under physiological condition and it is commonly recognized as an important ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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De liberación lenta Drug Delivery través Elvax 40W a la Rata Retina: Implicaciones para el tratamiento de condiciones crónicas

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Investigación

Medicina

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Método optimizado de LC-MS/MS para el análisis de alto rendimiento de las muestras clínicas de Ivacaftor, sus principales metabolitos y Lumacaftor en fluidos biológicos de pacientes con Fibrosis quística

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

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Implantación de parches hiPSC derivado de músculo cardiaco después de lesión del miocardio en un modelo del conejillo de Indias

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss ...

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