Name: an in vitro hemodynamic loop model to investigate the hemocytocompatibility and host cell activation of vascular medical devices
Uploaded: 2020-08-21T13:00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices at JoVE.com

作者感谢埃琳娜·登克斯女士的技术援助。

这项研究得到了马格德堡大学医学院伦理委员会（申请号88/18）的批准，受试者在抽血程序之前提供了书面知情同意。
1. 肝素库存制备和血液取样
<ol><li>计算整个实验所需的血液量。 注：几乎，每个血管设备需要5 mL的肝素血重复（循环）。同样，每个基线和静态条件需要 5 mL 的血液，这些血液在室温下保持。</li>
	<li>通过稀释去压水中未分离的肝素（例如Rotexmedia），在浓度为100 IU/mL时准备肝素库存溶液。使用此溶液的 150 μL 进行 10 mL 新鲜血液的肝素化。</li>
	<li>计算全血细胞计数、ELISA 和 FACS 测定所需的血液量和血浆量。 注：本研究中表示的测量值来自两个平行运行的循环（一个为重复），总血量为 10 mL。</li>
	<li>根据所需血液量，用150μL的肝素库存溶液填充10 mL注射器，以防止最终肝素浓度为1.5 IU/mL血液的血液凝固。</li>
	<li>用蝴蝶抽血（大小：21G）。非常轻柔地填充注射器，以避免因真空过多而产生血解或细胞激活。 注：在实验开始前，应获得当地道德委员会的许可。获得每个献血者知情同意。确保献血者健康，不服用任何药物，特别是实验前至少10天不服用抗血小板剂或非类固醇抗炎药物。值得注意的是，在比较不同类型的血管设备时，选择相同的捐赠者，如本手稿中介绍。为了进一步评估个体间的差异，可以与不同的捐助者重复议定书。</li>
	<li>在玻璃烧杯中收集血液，避免过度搅拌。</li>
</ol>2. 体外血流动力学循环总成
<ol><li>将水浴注满，直到水位达到旋转单元的中心。将水温设置为 37 °C。</li>
	<li>用于测试不同管材的循环组件（聚PVC、HepPVC、PVC和乳胶）<ol>
<li>用管切割机切割两块 50 厘米长的管材（内径 5 mm）。确保切割表面平整，因为对于小直径的回路的完美闭合尤为重要，这样血液在管接头边缘上不会出现任何变形。 注：整个协议使用内径为 5 mm 的管。</li>
		<li>为了便于处理，避免旋转后样品处理延迟，请并行运行四个循环（2 个重复材料）。</li>
		<li>要生成循环形状，请将管的开端插入一小块硅管中，以安装调查管的外径。</li>
		<li>使用聚碳酸酯张力带，确保正确关闭环路。首次使用时，通过用剪刀切割张力带，调整带子的长度以适应环路的外径，然后用 3 mm 扭矩扳手固定。</li>
		<li>在检查管端时小心拧紧张力带接头的锁紧螺钉。调整闭合力，使管端之间没有间隙。如果锁紧螺钉完全拧紧，且聚碳酸酯带的张力似乎过低，以关闭管端之间的间隙，则打开锁定系统并切割几毫米的张紧带。重复此，直到实现精确的环路闭合（图 1A）。</li>
		<li>如果管材非常柔软，并且倾向于在张力带内滑动，则用电胶带将环固定到张力带上（图 1B，C）。</li>
		<li>为温度控制准备一个附加的 PVC 循环，其尺寸与测试回路相同。</li>
		<li>将回路固定到水浴外旋转装置的循环底座中。此后，将循环底座连接到水浴内的旋转单元（图 1E）。</li>
		<li>部分从环路上拆除张力带，并拔下每个管的一端以打开环路。</li>
		<li>用 5 mL 血清移液器轻轻填充每个循环 5 mL 的血液。在将血液轻轻混合到玻璃杯中两次，在装入循环之前，缓慢上下移液。</li>
		<li>拿一次性温度计，放在温度控制回路内。如果温度计太大，用剪刀剪下来，以安装较小的管子。在室温下用5 mL的去化水填充循环。</li>
		<li>关闭环路，确保环路、张力带和机架是否安装正确。</li>
		<li>将转速设置为每分钟 30 转 （rpm），旋转 3 小时。</li>
	</ol></li>
	<li>用于测试不当环路闭合（间隙）影响循环组件<ol>
<li>准备四个循环（多边形PVC），如2.2中所述。</li>
		<li>用张紧带正确关闭两个环，避免管端之间的任何间隙。</li>
		<li>对于其他两个循环，如 2.2.3 所述，将开端插入更大的管中，但在环路端点之间留下 1-2 mm 的间隙。请勿使用这些环路的张力带（图1D）。</li>
		<li>准备一个温度控制回路，如 2.2.7 和 2.2.11 中所述。</li>
		<li>如 2.2.10 中所述，用血液填充所有循环。</li>
		<li>将转速设置为 30 rpm，旋转 3 小时。</li>
	</ol></li>
	<li>支架测试的循环组件<ol>
<li>准备四个循环，如 2.2 中所述，如下所示。 注：为了评估支架的血液生物相容性，应测试管材本身是否具有生物相容性，以防止细胞活化。如果不存在数据，可以像 2.2 中所述对管材料本身进行测试。此外，支架内的直径范围可应用（参见制造商的说明），并且应适合管材的内径。</li>
		<li>打开两个回路，将管子从张力带系统中带走。</li>
		<li>根据制造商的说明，将支架插入管中间。</li>
		<li>使用不带支架的其他两个循环作为控件。如 2.2.10 中所述，用血液填充所有循环。</li>
		<li>将转速设置为 30 rpm，旋转 3 小时。</li>
	</ol></li>
	<li>温度控制<ol>
<li>在持续时间内的任何时间以及停止旋转时，回路内的血液温度由温度控制回路内的温度计指示。要读取温度，请停止旋转并立即读取温度计指示的温度。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 血液样品处理
<ol><li>旋转后，让回路在机架中站立 2 分钟，处于向上位置，让血液积聚在回路底部，避免在打开回路时溢出。</li>
	<li>检查留下的血液是否静静：如果血液凝固，最终怀疑肝素不当。在这种情况下，最好也使用另一个献血者重复实验。</li>
	<li>小心地将循环从机架中拿出来。打开接头，让血液流入 10 mL 玻璃烧杯。</li>
	<li>从重复运行的管子中抽出血液。</li>
	<li>从同一供体中抽出新鲜血液进行基线分析，如 1.5 和 1.6 中所述。</li>
	<li>柠檬酸钠血的收集<ol>
<li>对于柠檬酸钠血液的收集，填充四个1.5 mL管，每个管中含有从柠檬酸钠管中收集的111μL柠檬酸钠溶液，最终产生3.2%的柠檬酸钠浓度。</li>
		<li>如 1.6 和 3.3 所述，用玻璃烧杯中 1 mL 的血液填充每个管。</li>
		<li>保持血液在室温下，并使用此血液进行 FACS 分析，如 12 所述。 注：要更改不同实验设置的环路长度，请根据要测量的数量正确规划等分。在进行实际实验之前，可能需要用新鲜血液建立所有必需的测量结果，以确保循环中的血液量足以用于所有测量。</li>
	</ol>
</li>
	<li>收集乙二胺甲酸（EDTA）血液和血浆样品。<ol>
<li>从每个带血的玻璃烧杯（见1.6和3.3）将4.5毫升血液转移到一个5mlEDTA管中。用血液从每个 10 ml 玻璃烧杯中填充两个 EDTA 管。</li>
		<li>轻轻地混合血液，放在冰上。</li>
		<li>将 2 mL 的血液转移到 2 mL 锁定离心管中，并使用此血液进行血细胞计数和自由血红蛋白测量，如 5 中所述。和6.</li>
		<li>将剩余血液以3，500 x g离心 20分钟。</li>
		<li>小心地将血浆收集在500μL等分中，并立即在-80°C下冻结。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 扫描电子显微镜和+CT图像
<ol><li>血液样本处理后，用 10 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗 2.3 中所述的空环。</li>
	<li>用手术刀小心地从每个管子的每一端切开一个1厘米长的样品。</li>
	<li>在4°C下孵育样品，在2%的谷胱甘肽溶液中孵育样品。 注意：吸入醛蒸汽可引起鼻腔症状，如流鼻涕或持续闷塞和气道刺激，与皮肤接触会导致皮炎。戴手套、防护服和安全护目镜时，应在烟罩中处理醛。</li>
	<li>用 PBS 冲洗样品（3 次）。</li>
	<li>在去维化水中制备1%的三氧化硅（OsO4）溶液，并在室温下孵育样品15分钟。 注意：OsO4 是一种强氧化剂，可通过暴露在光线下减少。为了避免在制备过程中减少，请将 OsO4 存放在棕色玻璃瓶中。OsO4 挥发性极强，其烟雾对眼睛、鼻子和喉咙有毒。始终在烟罩下工作，使用手套和保护衣物，确保身体的任何部位都暴露在 OsO4 中。联系您机构有关废物处理和储存处理的准则。一般来说，OsO4 可存储几个月，但它需要特殊的玻璃瓶与特氟龙衬里和干燥器，因为 OsO4 可以变色内部表面和冰箱内装物在泄漏烟雾的情况下。</li>
	<li>提取样品，将其转移到新的 15 mL 离心管中，然后用 PBS 冲洗样品 3 次。</li>
	<li>准备一系列浓度不同的乙醇（25%、50%、75%、95%、100%）</li>
	<li>乙醇中的脱水样品：在25%、50%、75%、90%和30分钟内孵育20分钟。</li>
	<li>从 100% 乙醇中抽取样品，让它在室温下通宵干燥。</li>
	<li>在 5 kV 的加速度电压下，使用 X 射线 μCT 扫描仪检查扫描电子显微镜中的样品。</li>
</ol>5. 血细胞计数
<ol><li>服用 2 mL 的 EDTA 血液，如 3.7.3 中所述</li>
	<li>将管子插入自动血液学分析仪，并按照制造商的说明操作。</li>
</ol>6. 等离子体中自由血红蛋白（fHb）的测量
<ol><li>从 3.7.5 中描述的每个条件中解冻一个等离子样品。解冻后储存在冰上。 注：始终在37°C的水浴中解冻冷冻血浆样品，并立即转移到含有一些水的冰中，以降低温度。这对于避免在解冻过程中激活血液成分非常重要。</li>
	<li>使用 fHb 试剂，并按照制造商的说明进行操作。打开后避免污染，防止试剂受到直接光线（阳光、紫外线）的照射。</li>
	<li>使用1：5稀释的移液方案（参见制造商的说明）。</li>
	<li>在1.6 mL半微库中加入1000μL的血红蛋白试剂。使用此 cuvette 确定空白值。</li>
	<li>将 1000 μL 的血红蛋白试剂和 250 μL 的血浆样品加入另一个半微库中。</li>
	<li>通过反复填充反应混合物，将两个槽中的内料混合，并在室温下孵育至少3分钟。</li>
	<li>确定样品对fHb试剂的消光（E）为空白试剂。计算样品的 fHb 浓度 （mmol/l）： E540-E680 x 0.452。</li>
</ol>7. FPA 的测量
<ol><li>从3.7.5中描述的每个条件中解冻血浆样品，解冻后储存在冰上。</li>
	<li>使用 FPA Elisa 套件，并按照制造商的说明进行操作。</li>
</ol>8. sC5b9 的测量
<ol><li>从3.7.5中描述的每个条件中解冻血浆样品，解冻后储存在冰上。</li>
	<li>使用 sC5b-9 ELISA 套件，并按照制造商的说明操作。</li>
</ol>9. PMN 的测量
<ol><li>从3.7.5中描述的每个条件中解冻血浆样品，解冻后储存在冰上。</li>
	<li>使用 PMN-弹性酶 ELISA 套件，并按照制造商的说明进行操作。</li>
</ol>10. TNF的测量
<ol><li>微孔板必须在运行 ELISA 前一天涂覆。对于涂层，在2°C-8°C下将100μL的捕获抗体溶液加入到所有孔、密封板和孵育中。</li>
	<li>从 3.7.5 中描述的每个条件中解冻一个等离子样品。解冻后储存在冰上。</li>
	<li>使用 TNF ELISA 套件，并按照制造商的说明操作。</li>
</ol>11. IL-6的测量
<ol><li>微孔板必须在实验前一天涂上捕获抗体。对于涂层，在4°C下，将100μL的捕获抗体溶液加入微孔板的所有孔井中，并密封板，并在4°C下隔夜孵育</li>
	<li>从 3.7.5 中描述的每个条件中解冻等离子体样本。解冻后储存在冰上。</li>
	<li>使用 IL-6 ELISA 套件，并按照制造商的说明操作。</li>
</ol>12. FACS 分析
<ol><li>通过添加 10 mL 的胎儿小牛血清和 2 mL 的 EDTA 溶液 （0.5 M） 到 488 mL 的 1x PBS 来准备 500 mL 的 FACS 缓冲液。FACS 缓冲区可以在 4°C 下存储 4 周。</li>
	<li>在每个染色过程（单细胞血小板聚合体（MPA）、血小板活化（PA）、白细胞内分（LI））使用100μL的柠檬酸钠血（参见3.6.3）。</li>
	<li>将100μL的血液从每个样品中移入5 mL FACS管。在每个样品中，用MPA（单细胞血小板聚合体）面板、PA（血小板聚合体）面板和LI（白细胞集成）面板制备3个用于抗体染色和标签的管。</li>
	<li>将其余 4 个样品混合到一个 5 mL FACS 管中。使用此混合物用于未污染和荧光减去一 （FMO） 控制。</li>
	<li>通过将混合样本血的100μL移液到每个管中，准备6个FACS管。将 3 管标记为未污染管，将 3 管标记为 FMO-CD41、FMO-CD62P 和 FMO-CD162。</li>
	<li>加入100μL的4%的甲醛溶液，在室温下在黑暗中孵育15分钟。 注意：甲醛对皮肤和眼睛有毒。吸入后可引起严重的肺刺激，长时间接触后可导致肺部损伤。此外，它被归类为致癌物质和生殖毒素。始终戴上手套和安全眼镜，在烟罩下工作。</li>
	<li>在每个管中加入1 mL的洗涤缓冲液，以287 x g的离心机 进行5分钟。丢弃上一杯，重复洗涤步骤两次。</li>
	<li>对于红血球（RBC）解液，加入1mL的1x缓冲RBC解液缓冲液（稀释10xRBC解液缓冲液在去ion化水中），通过缓慢上下移液混合，在黑暗中在RT中孵育5分钟。</li>
	<li>为单个污渍准备补偿珠。到 1 mL 的 FACS 缓冲器添加 4 滴每个正负珠。涡流彻底，并添加100μL的珠液到一个5mL FACS管。</li>
	<li>准备4个带珠子和标签的管子，作为CD14-FITC、CD41-BV421、CD45-APC和CD62P-PE。在每个管中加入1 mL的FACS缓冲液，以287 x g的离心机进行5分钟。丢弃上一杯，继续冰上。</li>
	<li>RBC 解解后，将 1 mL 的 FACS 缓冲液添加到每个管中，然后如 12.7 中所述进行清洗。丢弃上一个。</li>
	<li>准备抗体鸡尾酒：<ol>
<li>MPA 面板：添加 4 μL 的 CD45-APC、4 μL 的 CD14-FITC 和 4 μL 的 CD41-BV421 至 388 μL 的 FACS 缓冲液。</li>
		<li>PA面板：将1.6μL的CD41-BV421和12μL的CD62P-PE添加到386.4μL的FACS缓冲液中。</li>
		<li>LI面板：添加4μL的CD45-APC和8μL的CD162-BV421至388μL的FACS缓冲液。继续冰上。</li>
	</ol></li>
	<li>准备单个污渍：为 CD14-FITC、CD41-BV421 和 CD45-APC 各加入 0.5 μL 至 499.5 μL 的 FACS 缓冲液。对于 CD62P-PE，将 0.3 μL 添加到 499.7 μL 的 FACS 缓冲液中。继续冰上。</li>
	<li>准备FMO控制：（i） MPA面板（FMO-CD41）：将1个μL CD14-FITC抗体和1 μL的CD45-APC抗体加入98μL FACS缓冲液。（ii） PA面板（FMO-CD62P）：将 CD41-BV421 添加到 99.6 μL 的 FACS 缓冲液中。（iii） LI面板（FMO-CD162）：在99μL的FACS缓冲液中加入1μL的CD45-APC。将 FMO 控制装置放在冰上。</li>
	<li>Vortex 抗体鸡尾酒，并添加 100 μL 的每一抗体鸡尾酒，如 12.12 中制备的每个标签管（MPA、PA 和 LI 面板），如 12.3 所述，通过上下移液轻轻混合。在黑暗中继续 Rt 。</li>
	<li>涡流单染色抗体稀释，并加入100μL的单染色抗体稀释，如12.13中制备。每个标签管与珠子如12.7所述，轻轻混合通过上下移液。在黑暗中继续 Rt 。</li>
	<li>Vortex FMO 抗体鸡尾酒，并加入 100 μL 的每款 FMO-1 抗体鸡尾酒，如 12.14 中制备。每个标签管（FMO 控制），如 12.5 中所述。通过上下移液轻轻混合。在黑暗中保持 Rt 。</li>
	<li>在黑暗中用抗体染色孵育所有管子30分钟。</li>
	<li>将三根管用于无污染控制（参见 12.4），并在 250 μL 的 FACS 缓冲液中重新填充颗粒。继续冰上。</li>
	<li>孵育时间后，用 12.7 中所述的 FACS 缓冲液洗洗除未污染控制装置以外的所有管。在 250 μL 的 FACS 缓冲液中重新暂停颗粒，并获取流式细胞仪上的数据。</li>
	<li>在 FACS 软件中，使用未污染的单元格进行负值设置，对鼠标珠进行补偿。使用无污染的单元格进行正面设置。此外，使用 FMO 控制浇注策略，其中 FMO-CD41 用于 MPA 面板，FMO-CD62P 在 PA 面板中使用，FMO-CD162 用于 LI 面板。</li>
	<li>获取近 0.5 x 106 - 0.25 x 106 事件每个管为 FACS.使用分析软件保存数据并进行分析（版本 9.9.6）。</li>
</ol>

<ol>
	<li>International Organisation for Standardisation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIN+ISO+10993-4:+Biological+evaluation+of+medical+devices+-+Part+4:+Selection+of+tests+for+interactions+with+blood.">DIN ISO 10993-4: Biological evaluation of medical devices - Part 4: Selection of tests for interactions with blood.</a> International Organisation for Standardisation. , (2017).</li><li>Mayes, J. T., Schreiber, R. D., Cooper, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+the+quantitation+of+alternative+complement+pathway+activation+in+human+serum.">Development and application of an enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitation of alternative complement pathway activation in human serum.</a> Journal of Clinical Investigation. 73 (1), 160-170 (1984).</li><li>Maiolini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sandwich+method+of+enzyme-immunoassay.+II.+Quantification+of+rheumatoid+factor.">A sandwich method of enzyme-immunoassay. II. Quantification of rheumatoid factor.</a> Journal of Immunological Methods. 20, 25-34 (1978).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry:+The+Glass+Is+Half+Full.">Flow Cytometry: The Glass Is Half Full.</a> Methods in Molecular Biology. 1678, 1-10 (2018).</li><li>Betke, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Slurry+Composition+on+Properties+of+Cellular+Alumina:+A+Computed+Tomographic+Study.">Impact of Slurry Composition on Properties of Cellular Alumina: A Computed Tomographic Study.</a> Advanced Engineering Materials. 19 (10), (2017).</li><li>Chandler, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+thrombotic+coagulation+of+the+blood;+a+method+for+producing+a+thrombus.">In vitro thrombotic coagulation of the blood; a method for producing a thrombus.</a> Laboratory Investigation. 7 (2), 110-114 (1958).</li><li>Fink, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+study+of+blood+compatibility+of+vascular+grafts+made+of+bacterial+cellulose+in+comparison+with+conventionally-used+graft+materials.">An in vitro study of blood compatibility of vascular grafts made of bacterial cellulose in comparison with conventionally-used graft materials.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 97 (1), 52-58 (2011).</li><li>Lenz-Habijan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+Thrombogenicity+of+a+Bare+and+Antithrombogenic+Coated+Flow+Diverter+in+an+In+Vitro+Flow+Model.">Comparison of the Thrombogenicity of a Bare and Antithrombogenic Coated Flow Diverter in an In Vitro Flow Model.</a> Cardiovascular and Interventional Radiology. 43 (1), 140-146 (2020).</li><li>Olsen, A. L., Long, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+catheter+thrombogenicity+in+a+modified+chandler+loop+model+using+goat+blood.">Comparison of catheter thrombogenicity in a modified chandler loop model using goat blood.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 106 (12), 3143-3151 (2018).</li><li>Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+investigation+of+fluid+flow+in+a+chandler+loop.">Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 136 (7), (2014).</li><li>Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+the+ex+vivo+Chandler+Loop+Apparatus+to+assess+the+biocompatibility+of+modified+polymeric+blood+conduits.">The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).</li><li>Feyerabend, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+compatibility+of+magnesium+and+its+alloys.">Blood compatibility of magnesium and its alloys.</a> Acta Biomaterialia. 25, 384-394 (2015).</li><li>Lukas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Immobilized+Antithrombin+III+on+the+Thromboresistance+of+Polycarbonate+Urethane.">Effect of Immobilized Antithrombin III on the Thromboresistance of Polycarbonate Urethane.</a> Materials. 10 (4), 355 (2017).</li><li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+influence+the+hemostatic+system+by+activating+the+intrinsic+coagulation+pathway+in+an+in+vitro+Chandler-Loop+model.">Aptamers influence the hemostatic system by activating the intrinsic coagulation pathway in an in vitro Chandler-Loop model.</a> Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16 (2), 161-169 (2010).</li><li>Link, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocompatibility+Testing+of+Blood-Contacting+Implants+in+a+Flow+Loop+Model+Mimicking+Human+Blood+Flow.">Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), e60610 (2020).</li><li>van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+modified+chandler,+roller+pump,+and+ball+valve+circulation+models+for+in+vitro+testing+in+high+blood+flow+conditions:+application+in+thrombogenicity+testing+of+different+materials+for+vascular+applications.">Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications.</a> International Journal of Biomaterials. 2012, 673163 (2012).</li><li>Maa, Y. F., Hsu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+denaturation+by+combined+effect+of+shear+and+air-liquid+interface.">Protein denaturation by combined effect of shear and air-liquid interface.</a> Biotechnology and Bioengineering. 54 (6), 503-512 (1997).</li><li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+the+Chandler+loop+to+examine+the+interaction+potential+of+NXY-059+on+the+thrombolytic+properties+of+rtPA+on+human+thrombi+in+vitro.">The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro.</a> British Journal of Pharmacology. 153 (1), 124-131 (2008).</li><li>Fletcher, E. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+human+whole+blood+in+motion,+as+a+tool+to+predict+first-infusion+reactions+and+mechanism-of-action+of+immunotherapeutics.">Extracorporeal human whole blood in motion, as a tool to predict first-infusion reactions and mechanism-of-action of immunotherapeutics.</a> International Immunopharmacology. 54, 1-11 (2018).</li><li>Krajewski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocompatibility+evaluation+of+different+silver+nanoparticle+concentrations+employing+a+modified+Chandler-loop+in+vitro+assay+on+human+blood.">Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood.</a> Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).</li><li>Larm, O., Larsson, R., Olsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+non-thrombogenic+surface+prepared+by+selective+covalent+binding+of+heparin+via+a+modified+reducing+terminal+residue.">A new non-thrombogenic surface prepared by selective covalent binding of heparin via a modified reducing terminal residue.</a> Biomaterials, Medical Devices, and Artificial Organs. 11 (2-3), 161-173 (1983).</li><li>Gong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubing+loops+as+a+model+for+cardiopulmonary+bypass+circuits:+both+the+biomaterial+and+the+blood-gas+phase+interfaces+induce+complement+activation+in+an+in+vitro+model.">Tubing loops as a model for cardiopulmonary bypass circuits: both the biomaterial and the blood-gas phase interfaces induce complement activation in an in vitro model.</a> Journal of Clinical Immunology. 16 (4), 222-229 (1996).</li><li>Tevaearai, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trillium+coating+of+cardiopulmonary+bypass+circuits+improves+biocompatibility.">Trillium coating of cardiopulmonary bypass circuits improves biocompatibility.</a> The International Journal of Artificial Organs. 22 (9), 629-634 (1999).</li><li>Ma, Y. Q., Plow, E. F., Geng, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-selectin+binding+to+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+induces+an+intermediate+state+of+alphaMbeta2+activation+and+acts+cooperatively+with+extracellular+stimuli+to+support+maximal+adhesion+of+human+neutrophils.">P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1 induces an intermediate state of alphaMbeta2 activation and acts cooperatively with extracellular stimuli to support maximal adhesion of human neutrophils.</a> Blood. 104 (8), 2549-2556 (2004).</li><li>Bandyk, D. F., Galbraith, T. A., Haasler, G. B., Almassi, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+flow+velocity+of+internal+mammary+artery+and+saphenous+vein+grafts+to+the+coronary+arteries.">Blood flow velocity of internal mammary artery and saphenous vein grafts to the coronary arteries.</a> Journal of Surgical Research. 44 (4), 342-351 (1988).</li><li>Gardner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+examination+of+the+fluid+mechanics+and+thrombus+formation+time+parameters+in+a+Chandler+rotating+loop+system.">An examination of the fluid mechanics and thrombus formation time parameters in a Chandler rotating loop system.</a> Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 84 (4), 494-508 (1974).</li><li>Gaamangwe, T., Peterson, S. D., Gorbet, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+Effect+of+Blood+Sample+Volume+in+the+Chandler+Loop+Model:+Theoretical+and+Experimental+Analysis.">Investigating the Effect of Blood Sample Volume in the Chandler Loop Model: Theoretical and Experimental Analysis.</a> Cardiovascular Engineering and Technology. 5 (2), 133-144 (2014).</li><li>B&#246;swirth, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Technische Str&#246;mungslehre. 8 edn. , (2010).</li><li>Cartwright, I. J., Pockley, A. G., Galloway, J. H., Greaves, M., Preston, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+dietary+omega-3+polyunsaturated+fatty+acids+on+erythrocyte+membrane+phospholipids,+erythrocyte+deformability+and+blood+viscosity+in+healthy+volunteers.">The effects of dietary omega-3 polyunsaturated fatty acids on erythrocyte membrane phospholipids, erythrocyte deformability and blood viscosity in healthy volunteers.</a> Atherosclerosis. 55 (3), 267-281 (1985).</li><li>Wong, K. K. L., Wu, J., Liu, G., Huang, W., Ghista, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arteries+hemodynamics:+effect+of+arterial+geometry+on+hemodynamic+parameters+causing+atherosclerosis.">Coronary arteries hemodynamics: effect of arterial geometry on hemodynamic parameters causing atherosclerosis.</a> Medical &amp; biological engineering &amp; computing. 58, 1831-1843 (2020).</li><li>Kania, R. E., Herman, P., Ar, A., Tran Ba Huy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+pitfalls+in+middle+ear+gas+studies:+errors+introduced+by+the+gas+permeability+of+tubing+and+additional+dead+space.">Technical pitfalls in middle ear gas studies: errors introduced by the gas permeability of tubing and additional dead space.</a> Acta Oto-Laryngologica. 125 (5), 529-533 (2005).</li><li>Foley, M. E., McNicol, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in-vitro+study+of+acidosis,+platelet+function,+and+perinatal+cerebral+intraventricular+haemorrhage.">An in-vitro study of acidosis, platelet function, and perinatal cerebral intraventricular haemorrhage.</a> The Lancet. 1 (8024), 1230-1232 (1977).</li><li>Engstrom, M., Schott, U., Romner, B., Reinstrup, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+impairs+the+coagulation:+A+thromboelastographic+study.">Acidosis impairs the coagulation: A thromboelastographic study.</a> The Journal of Trauma. 61 (3), 624-628 (2006).</li><li>Dirkmann, D., Hanke, A. A., Gorlinger, K., Peters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia+and+acidosis+synergistically+impair+coagulation+in+human+whole+blood.">Hypothermia and acidosis synergistically impair coagulation in human whole blood.</a> Anesthesia &amp; Analgesia. 106 (6), 1627-1632 (2008).</li><li>Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+diagnostic+value+of+leukocyte+and+platelet+accumulations+around+"air+bubbles"+in+blood+after+venous+air+embolism.">Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism.</a> International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).</li><li>Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bubble-induced+aggregation+of+platelets:+effects+of+gas+species,+proteins,+and+decompression.">Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression.</a> Undersea &amp; Hyperbaric Medicine : Journal of the Undersea and Hyperbaric Medical Society, Inc. 20 (2), 101-119 (1993).</li><li>Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+evaluation+of+novel+blood+incubation+systems+for+in+vitro+hemocompatibility+assessment+of+planar+solid+surfaces.">Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B. 66 (1), 379-390 (2003).</li><li>Hesh, C. A., Qiu, Y., Lam, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+microfluidics+and+the+blood-endothelium+interface.">Vascularized microfluidics and the blood-endothelium interface.</a> Micromachines. 11 (1), 18 (2019).</li><li>Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+model+for+studying+the+interactions+between+human+whole+blood+and+endothelium.">A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).</li></ol>

资助者[ebo kunze工业设计，Im Dentel 17，72639 Neuffen，德国]以消耗品和出版费的形式向本手稿的作者[Max Wacker]提供了财政支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿编写方面没有任何额外作用。

研究表明，体外血流循环模型为按照ISO 10993-4标准测试医疗器械体外血液相容性提供了可靠的方法。
协议中的关键步骤包括抽血和用血填充管子，其中应避免过多的真空或搅拌，以防止血液成分通过处理程序激活。此外，立即冻结血浆样品并在解冻后将它们留在冰上非常重要，因为通过将样品保持室温较长时间，可以篡改补充和凝固系统活化。
由于与其他体外模型相比，该模型既有优点也有缺点，因此在设计实验时需要考虑几个因素。
首先，循环的长度和直径可以变化，以适应各种实验设置。如果设置包括不同内径的对比管，应记住，直径的差异将导致不同的剪切力，从而影响凝固和补充级联7。其次，在此实验中，转速设置为 30 rpm。这将导致血液流量约25厘米/s，这与人类冠状动脉旁路移植25的血流速度相当。循环旋转产生的应变速率是启动血液成分（包括细胞和无细胞蛋白）的生化级联的主要参数。但由于血液是非牛顿流体，应变率也会受管曲率的影响，分别将闭合到循环10的管的长度。每当旋转速度或回路大小发生变化时，重要的是要考虑应变速率和旋转速度之间的相关性不是线性的。旋转速度和应变速率之间的相关性直到今天才得到充分的检查，需要进一步研究以研究这些特定的参数10，26，27。但是，基于层边界层模型，给定管直径为 5 mm，旋转速度为 25 厘米/s， 对壁剪应力 （WSS） 的粗略估计表明，当血液密度估计为 1060 kg*m-3 且运动粘度设置为 0.0025pascal*s 28、29时，在 2.20-22.00 pascal 之间，与管壁的距离为 1，00-0，01mm。有趣的是，对人类冠状动脉曲率流动力学的更详细的计算分析显示，WSS值范围从11.33到16.77帕斯卡，在血液30的速度、密度和粘度大致相当的参数。
除了这个限制，提出的循环模型是一个压力小的系统，不模仿人体血管系统的血管内血压比。
下一个重要的限制是血液与循环内的空气接触，这会带来额外的干扰。这种血空气接触受到两个参数的影响，包括管的气体渗透性和回路内空气的保留，同时用血液填充它们。每个管材都有一定的气体渗透性，可导致管内气体浓度的显著变化。虽然一些作者指出，气体渗透对血液成分激活的影响仍然不清楚31，但众所周知，血液凝固剂的功能对pH-SHIFT非常敏感，这可能是由CO2扩散32、33、34引起的。在这里，我们测试了室内空气条件下血液灌注管的生物相容性，可与体外血液灌注的临床场景相媲美。对于未来对展示的模型的改进，将整个模型孵化到CO2培养箱中，并在孵化前和孵化后进行血液pH值验证，可能有助于进一步标准化该模型。
此外，回路内的血空气界面可导致血浆蛋白和血液35，36细胞分数的激活。管内无空气的滚筒泵驱动装置可以避免血空气接口问题，但与此处显示的环模型相比，它们肯定会对血红蛋白水平明显升高的血细胞造成损害，血浆中的血红蛋白会干扰ELISA16中测试分析物的灵敏度。在这项研究中，我们已经表明，循环模型本身的解水作用仍然最小，而使用生物相容材料，如肝素涂层PVC管。因此，与泵驱动的模型相比，该模型一方面不会造成过多的细胞损伤，另一方面则是由于血液空气接触而诱导血浆蛋白。值得注意的是，范奥维伦等人开发了一个球阀为基础的循环模型，避免空气在循环内16。这种有希望的替代这里提出的循环模型可以克服血-空气接口的问题，但是，与这里提出的模型相比，血小板粘附性仍然高于球阀为基础的环模型。
关于静态控制，值得注意的是，玻璃本身已被证明是凝固系统37的有力活化剂。然而，在介绍的设置中，在玻璃烧杯中孵育（静态控制）不会导致与直接在抽血后基线水平相比，过度的宿主细胞激活或凝固系统激活。总之，如果静态控制显示高激活水平，则使用聚丙烯管可能会有所帮助。
无论是基于循环的模型还是泵驱动的模型，这些体外模型完全缺乏真正的生物相互作用，而真正的生物相互作用主要是由完整的内皮贡献的，内皮是理想的血液接触表面。当像支架这样的医疗设备正在测试时，这个问题背后的理由更加明显，在内皮的情况下，在激活和血浆蛋白方面，它可能会产生不同的结果。这宣称是所有讨论的体外系统模仿循环系统的主要缺点。因此，为了克服这个问题，完全被内皮覆盖的新微流体系统正获得巨大的兴趣，但与这里介绍的循环模型相比，它们仍然局限于容纳更小的血液量和最小流速38，39 
因此，我们得出结论，钱德勒循环模型仍然是心血管研究领域血管医疗器械血液生物相容性标准化测试的稳健模型。

医疗器械的血相容性测试是开发血管支架或灌注管等用于体外膜氧合的新设备的关键步骤。直到今天，动物模型还被视为标准工具，在医疗器械在人类实施之前完成医疗器械测试程序。从今以后，有必要寻找替代体外模型，进一步有助于最大限度地减少对动物的调查。因此，在这项研究中，我们探索了一个微型体外血热动力学循环模型。该方法的目标是按照ISO 10993-4标准测试医疗器械的体外血液相容性。
ISO 10993-4 标准描述了要对血液样本 1 进行调查的标准化临床参数集。简言之，这些是血栓形成（血小板聚集和计数）、凝血（纤维蛋白肽A、FPA）、血液学分析（全血细胞计数）、造血指数（自由血浆血红蛋白）和补血系统（终端补充复合体，sC5b9）。然而，其他标记，如嗜中性粒细胞多形态核弹性酶（PMN），白细胞间6（IL-6）和肿瘤坏死因子- alpha（TNF）反映白细胞的激活状态，也可以考虑测量。为了确定和量化血浆中存在的循环细胞自由蛋白，三明治酶链接免疫吸附剂测定（ELISA）代表了一种传统和最可靠的方法2，3。同样，通过流式细胞学（FACS）检测分子的细胞表面表达（基于单细胞悬浮的读数，其中荧光标记的特定抗体与靶细胞表面分子4结合），可以量化宿主细胞（如白细胞）的表型和活化状态。也建议扫描电子显微镜 （SEM） 以确定 ISO 10993-4 标准 1 的测试材料上的血栓形成。此方法可以辅以 X 射线显微断层扫描 （μCT），对血栓进行结构分析，例如，在 3D 渲染图像5中，其厚度、大小和定位。
使用这种体外血流动力学模型的理由是，通过了解血液成分（如血小板）的基本生理动力学，以及它们与不同类型的血管装置的相互作用，来筛选性能最佳和相容的医疗器械。这种体外系统是高度要求的，因为它们减少了对动物研究的要求。
此处介绍的循环模型满足了这些要求。这个模型最初由 A.B钱德勒在1958年描述为血血栓的生产，因此，也被称为钱德勒循环模型6。到目前为止，该模型已被用于一系列的实验和修改，以调查医疗器械7，8，9，10，11，12，13，14的血液生物相容性。它由聚合物管组成，部分充满血液，形成可回收的回路。这些回路在温度控制的水浴中旋转，以模拟血管流动条件及其血液学效应。替代方法，如泵驱动模型或模型，使用机械球阀内的循环，以诱导血液流动内的聚合物管已经描述了15，16。然而，本文提出的方法的整体优势是，应用于血细胞和蛋白质的机械力低，避免血解，并且血液和连接器之间没有接触，这可能导致流动湍流和血液成分的激活。回路内的主要激活因素是测试材料本身和内部捕获的空气。这有助于最大限度地减少测量误差的来源，并提供高可重复性，即使血空界面可导致蛋白质变性17。也可以调查各种管材和支架直径，没有长度或大小限制，从而允许使用不同的长度和内径管。此外，在不准确的环闭和暴露在未涂层管表面的宿主血容也是可能的调查。这种体外血动力循环模型的其他类似医学应用是，它也可用于研究免疫治疗（药物）和血液成分之间的相互作用，无论是临床前开发或个别药物安全筛选之前的第一阶段第一阶段临床试验，或产生血栓材料，可用于进一步实验18，19，20。
本研究描述了测试灌注管和/或支架的血容的详细协议。在这里，无涂层和涂层PVC管（HepPVC：肝素涂层，聚PVC：生物活性聚合物涂层）的比较。血小板的活化降低，但与未涂覆管相比，两种涂层管的凝固系统（FPA）的活化率更高。这里使用的 HepPVC 管经过共价绑定肝素的修改，使其血栓性21， 并且已在循环模型中用于优化和描述不同的参数22。本研究中使用的聚PVC管是用于体外血液灌注临床设置的商用管，并涂有肝素聚合物，以减少其血栓原性23。有时，在临床应用中，甚至使用未涂覆的PVC管。因此，我们包括乳胶管作为正对照组，显示血小板的过度活化，凝固系统和可溶性因素，如IL-6，TNF和PMN弹性酶。模拟不准确的环闭合时，注意到了血栓的形成。与基线条件相比，这导致了凝血和补剂系统以及白细胞和血小板的激活。此外，血液接触这里使用的支架材料（裸金属尼丁醇支架，覆盖碳浸渍扩大聚四氟乙烯）导致更高的血小板和白细胞活化在PMN弹性酶方面。总体而言，所提出的模型没有在任何测试的血管装置中诱导血解，因为它们与基线或静态条件相当，但乳胶管除外，其中红细胞（RBC）血解明显。此外，这些灌注管可以通过成像或组织学检查。虽然组织学评估可能是可行的，但我们主要关注ELISA和流式细胞学来进行这些实验，从而使许多实验室根据本文提出的模型进行实验的敏感性。因此，该方法是按照ISO 10993-4标准的建议，对血管医疗器械的血液生物相容性进行检验的可行方法。此外，当血液和材料之间的相互作用应在流动条件下进行测试时，可以使用这种方法，模仿体内条件。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 ml tube, K3 EDTA</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>32332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td>Becton Dickinson BioSciences</td>
			<td>552843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>368512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa II cell analyzer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>647465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Citrate Tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>369714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer one-use holder</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>364815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Safety-Lok butterfly canula 21 G</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker glass ROTILABO short 10 ml</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>X686.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker glass ROTILABO short 50 ml</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>X688.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-human CD162 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-human CD41 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge ROTINA 420 | 420 R</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td>4701 | 4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHC Super modified, 5mm PVC tubing</td>
			<td>Corline Sweden</td>
			<td>1807-148</td>
			<td>Referred to as hepPVC tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular Precision Cutter</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 007-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Closing Unit (complete with tension bands)</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 008-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric tape Scotch Super 33+</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MMMA331933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA MAX Deluxe Set Human IL-6</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>430504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA MAX Deluxe Set Human TNF-a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>430204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,1 &#8211; 2,5 &#181;L, gray</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,5 &#8211; 10 &#181;L, gray</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 10 &#8211; 100 &#181;L, yellow</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 100 &#8211; 1,000 &#181;L, blue</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 20 &#8211; 200 &#181;L, yellow</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. sample bag, 0,5 &#8211; 5 mL, violet</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes polystyrene 5.0 ml round bottom</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum Gold Plus</td>
			<td>Bio-Sell</td>
			<td>FBS.GP.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>367116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluency plus stent 13.5 x 60 mm</td>
			<td>Angiomed GmbH &#38; Co</td>
			<td>FVM14060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free Hemoglobin fHb Reagent</td>
			<td>Bioanalytics GmbH</td>
			<td>004001-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS Tablets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves Vasco Nitril white L</td>
			<td>B. Braun Deutschland GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td>9208437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves Vasco Nitril white M</td>
			<td>B. Braun Deutschland GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td>9208429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25% aequous solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G6257-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin, 25.000 IE in 5 ml</td>
			<td>Rotexmedica, Trittau, Germany</td>
			<td>PZN 3862340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fibrinopeptide A (FPA) ELISA Kit</td>
			<td>H&#246;lzel Diagnostika</td>
			<td>abx253234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kodan tincture forte colourless</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td>104012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex tube, ID 5 mm</td>
			<td>Laborhandel24 GmbH</td>
			<td>305 0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loop Stand</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 009-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medimex venous tourniquet classic</td>
			<td>ROESER Medical GmbH</td>
			<td>310005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite 200 Pro M Plex</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>TEC006418I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate shaker PMS-1000i</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Metric non-phthalate PVC tubing, ID 5 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NALG8703-0508</td>
			<td>Referred to as PVC tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NexTemp (Standard) Single-Use Clinical Thermometer</td>
			<td>Medical Indicators</td>
			<td>2112-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp ELISA Plates, uncoated</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10256970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD16Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD62P (P-Selectin) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller, pipetus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips epT.I.P.S. 0.2 - 5 ml</td>
			<td>OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>5186480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips epT.I.P.S. standard 0,1 - 10&#181;l</td>
			<td>Th. Geyer GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>9409410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips epT.I.P.S. standard 2 - 200&#181;l</td>
			<td>Th. Geyer GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>0030 000.870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips epT.I.P.S. standard 50 - 1000&#181;l blue</td>
			<td>Th. Geyer GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>0030 000.919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMN (Neutrophil) Elastase Human ELISA Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BMS269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe stand ROTILABO combi</td>
			<td>CARL ROTH</td>
			<td>K082.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for rotation unit (12 slots 3/8 &#39;&#39; with variable slot width)</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 011-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10X)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-1184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotation Unit</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 010-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock micro test tubes 0.5 ml</td>
			<td>OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>5409320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock micro test tubes 1.5 ml</td>
			<td>OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>5409331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sc5b9 Human ELISA KIT</td>
			<td>TECOmedicalGroup</td>
			<td>A029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel no 10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9999403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope XL30 ESEM-FEG</td>
			<td>Philips</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 1000 ml, GL 45</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>X715.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 500 ml, GL 45</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>X714.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro cuvette 1.6 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67.746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10.0 ml</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 25.0 ml</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 5.0 ml</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tube, inner diameter 8 mm, outer diameter 12 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BURK8803-0812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprout mini centrifuge</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>552034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Solution for TMB Substrate</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>77316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swabs, sterile</td>
			<td>Fuhrmann GmbH</td>
			<td>32055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 ml</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled water basin</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 020-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butanol, 99.5%, extra pure, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10000730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB Substrate Set</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>421101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trillium PVC tube, 5 mm ID</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>161100107100103</td>
			<td>Referred to as polyPVC tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4974,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spektrometer Lambda 2</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>33539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vornado Mini Vortexer</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>55BV101-B-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XN-3000 workstation blood analyzer</td>
			<td>Sysmex Europe</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-CT Phoenix Nanotom S</td>
			<td>GE Sensing &#38; Inspection, Wunstorf, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro hemodynamic loop model to investigate the hemocytocompatibility and host cell activation of vascular medical devices

本研究将内径为5毫米的聚氯乙烯（PVC）和涂覆不同生物活性联结物的管的血相容性与PVC管内未涂覆的PVC管、乳胶管和血管内应用支架进行比较。使用 ISO 标准 10993-4 推荐的体外血动力循环模型对血容度进行评估。管子被切成相同长度的片段并闭合成环，避免在接头上出现任何间隙，然后充满人血，在37°C的水浴中旋转3小时。此后，采集管内血液，用于分析全血细胞计数、血解（自由血浆血红蛋白）、补血系统（sC5b-9）、凝血系统（纤维蛋白肽A）和白细胞活化（多态核弹性酶、肿瘤坏死因子因子和白细胞-6）。使用流细胞学确定细胞活化、白细胞整流蛋白状态和单细胞血小板聚合。用X射线显微断层扫描和扫描电子显微镜检查了不准确的环闭效应，显示拼接时形成血栓。乳胶管显示血液血浆和细胞成分的活化能力最强，表明血相容性差，其次是支架组和未涂覆的PVC管。涂层PVC管未显示血小板活化状态显著下降，但与未涂覆PVC管相比，补和凝固级联增加。循环模型本身没有导致细胞或可溶性因子的激活，溶血水平较低。因此，提出的体外血液动力学循环模型避免了机械力过度激活血液成分，并作为一种研究供体血液和血管医疗设备之间体外相互作用的方法。

所有提交的数据，除了FACS图，都用统计软件进行分析。使用流式细胞学软件对FACS绘图进行了分析。
对整个血细胞计数的分析没有显示所有测试条件之间的红细胞有任何显著差异（图2）。但是，乳胶组的血小板和白细胞急剧减少，表明乳胶的生物相容性很差。乳胶组自由血红蛋白水平增加进一步强调了这一点，表明除乳胶组外，其他血管装置或条件均无导致大量血解（图2）。此外，涂层PVC管、聚PVC和 HepPVC，以及测试的支架，没有通过血小板和白细胞损失导致血栓形成，而乳胶表现出最高的血小板和白细胞损失，其次是未涂覆的PVC管，显示出下降趋势。
虽然所有测试的血管设备都导致凝血系统 （FPA） 和补剂组件 （sC5b-9） 的激活率增加，但与聚PVC回路相比，HeppPVC回路呈现出 FPA 和 sC5b-9 水平下降的趋势（图 3）。有趣的是，与聚PVC相比，未涂覆的PVC和Gap循环显示的FPA水平较低，但没有达到统计显著性水平。然而，与基线和静态条件相比，乳胶环的FPA水平显著增加。
根据整个血细胞计数，乳胶环表现出最高水平的TNF，IL-6和PMN弹性酶（图4），达到统计显著性水平相比，其他组在TNF和IL-6（图4A，B），而静态和基线条件在PMN弹性酶（图4C）。这些结果表明乳胶对白细胞有有效的激活。激活标记的基线水平始终与静态条件相媲美，表明血液的肝素化。
有趣的是，随着凝血系统（FPA）和白细胞（PMN弹性酶）的适度激活，间隙诱导回路的血小板和白细胞计数仅略有减少，但不适当的环闭合与由此产生的流动湍流和血液接触到未涂覆的粗糙切割表面导致拼接的宏观可见血块（图1F）。块块及其分布整个拼接表面明显与+CT和SEM图像，而没有发现血块时，循环关闭与外部关闭装置之间没有留下循环结束之间的间隙（图5）。
图6A、B所示，对沾有血小板特异性标记、CD41和血小板活化标记的宿主血细胞进行细胞计量分析。在这里，乳胶管在血小板上表现出极高的中值荧光强度（MFI），其次是支架，而肝素涂层聚PVC管表现出最小的活化血小板，描绘了多PVC管的抗血栓特性。此外，白细胞根据CD45和SSC（侧散射）的粒度分类为（i） 粒细胞;（ii） 单细胞和（iii）淋巴细胞（图7），在已知与血小板24上的CD62P相互作用的每个白细胞亚细胞上检测到CD162+内黄蛋白的表达。人们注意到，乳胶循环中的粒细胞和淋巴细胞的内黄蛋白表达急剧减少。这一结果与乳胶环中白细胞总频率降低水平一样（图2）。一般来说，单核细胞中的整蛋白水平高于粒细胞和淋巴细胞，表明单细胞与活性血小板相互作用的可能性。在这方面，还通过用CD14（作为单细胞标记物）和CD41（作为血小板标记）染色血细胞，并最终识别双阳性细胞，即CD14+CD41=MPA（图8）来评价单细胞血小板聚集体。在这里，我们注意到支架组在MPA上表现出最高水平的CD41表达，其次是乳胶组，表明尽管单细胞频率降低（<1%）， 形成MPA的趋势增加在乳胶循环。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig01.jpg"> 图1：体外血流动力学循环模型概述及其修改。（A） 用于外部环路闭合系统的间隙实验，在接头上不留下间隙。（B） 循环由聚PVC涂层PVC管和支架内（箭头）。（C） 由乳胶管做的循环。（D） 间隙实验的环路，无需外部环路闭合系统，在管端（箭头）之间留下间隙。（E） 循环放置在水浴内的循环摇篮中，充满鲜血。（F） 旋转后在接头（箭头）上产生间隙。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig02.jpg"> 图2：血细胞计数和血浆血红蛋白的结果。（A） 红细胞计数.（B） 血小板计数。（F） 白细胞计数.（D） 自由血浆血红蛋白。结果表明乳胶的生物相容性差，导致过度血解。数据以平均值表示;错误栏指示 SEM. n=1。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig02large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig03.jpg"> 图3：凝固和补剂系统激活结果。（A） 凝固系统激活，用纤维蛋白肽A（FPA）（B）水平测量，补充系统激活，用sC5b-9水平测量。虽然乳胶管引起FPA水平的显著升高，但所有测试材料的补性活化都很强。数据以均值表示，误差条指示 SEM. *p<0.05，n=1。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig03large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig04.jpg"> 图4：白细胞激活标记。（A） 肿瘤坏死因子α（TNF）。（B） 白细胞素6 （IL-6） （C） PMN弹性酶。 结果表明，由于分析标记物水平升高，白细胞的激活率增加，其次是支架回路，这只能导致PMN弹性酶水平升高，而不是TNF或IL-6。数据以均值表示，误差条表示 SEM. *p<0.5;**p<0.01， n=1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig04large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig05.jpg"> 图5：循环拼接的成像。（A） μ（间隙）的环路的一个计算机断层扫描 （μCT）。红色区域表示血栓材料。（B） 管的发光侧的渲染。矩形选择表示扫描电子显微镜 （SEM） （C）的区域。（D） 带外部环路闭合装置的环路的 CT，在拼接时没有间隙，以及 （ E） 渲染和查看灯具表面。未发现血栓材料。（F） 矩形选择的 SEM 图像 （E）。在切割表面上未发现血栓材料。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig05large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig06.jpg"> 图 6：用于血小板激活 （CD62P） 的 FACS 图。（A） 代表 FACS 图（基本状况）显示血液 CD41+ 血 小板。（B） 显示血小板激活状态的图形，与静态RT和基线条件相比，不同类型血管装置的荧光强度（MFI）反映了血小板激活状态。数据栏显示来自单个测量的数据。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig06large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig07.jpg"> 图7：白细胞内黄蛋白（CD162）的FACS图。（A） 代表 FACS 图（基本条件）显示血液 CD45+ 白细胞和亚群 （B） 图显示白细胞 CD162+ 内特格林平均荧光强度 （MFI） 不同类型的血管设备与静态和基线条件进行比较。数据栏显示来自单个测量的数据。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig07large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig08.jpg"> 图8：血小板单细胞聚合的FACS图（CD41/CD14）。（A） 代表性 FACS 图（基本条件）显示血液单细胞 （CD45+/CD14+ ）、血小板 （CD41+） 和单核细胞血小板聚合体 （CD41+/CD14+） （ B ）显示与静态和基线条件相比，单细胞小板聚合的 CD41= 平均荧光强度 （MFI） 。数据栏显示来自单个测量的数据。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig08large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices at JoVE.com

An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

此处介绍的是标准化体外血流动力学循环模型的协议。此模型允许测试灌注管或血管支架的血相容性是否符合 ISO（国际标准化组织）标准 10993-4。

研究血管医疗器械血细胞相容性和宿主细胞活化的体外血流循环模型

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive ...

这种血液动力学循环模型允许研究人员测试血管设备（如灌注管或支架）的体外血质兼容性。在标准化条件下。因此，这种技术不会以机械力对血液产生任何影响，从而避免血液成分的内在激活产生误导的结果。在尝试试验之前，必须进行适当的机械部件组装、完善的环闭系统构造和缓慢的血液加载到回路中。要准备环路组件，请使用管切割机在平面上切割 250 厘米长、5 毫米内径的管件。将管子的开端插入一小块硅管，安装调查管的外径，生成一个循环形状。小心拧紧张力带接头的锁紧螺钉并调整关闭力，使两个弯曲之间没有间隙。如果锁紧螺钉完全拧紧，并且聚碳酸酯带的张力似乎过低，以关闭两个弯曲之间的间隙，则打开锁定系统并切割几毫米的张力带。要准备支架回路组件，请打开两个回路，然后将管从张力带系统中带走。然后按照制造商的指示将支架插入管中间。当为实验生成适当数量的循环时，将循环固定在旋转单元的回路底座中，在 37 度水浴之外，将循环底座连接到水浴内的旋转单元。接下来，用150微升或新鲜准备的肝素库存溶液每采集一个10毫升的注射器，并使用21量表蝴蝶轻轻地将血液收集到注射器中，注意避免因真空过多而发生同化或细胞活化。当所有的血液被收集后，将血液转移到玻璃烧杯上，并使用五毫升血清移液器，轻轻地混合血液和肝素。当获得均匀溶液时，移液器尖端未完全插入管中，小心地用五毫升的血液填充每个循环。加满后关闭每个环路，并确认环路、张力带和机架已正确固定。然后以每分钟 30 圈的速度旋转循环 3 小时。在旋转结束时，让循环在机架中站立两分钟，让血液积聚在循环底部，然后小心地打开接头，将重复的血液拉入单独的 10 毫升玻璃烧杯中。当所有血液被收集后，用 10 毫升 PBS 冲洗每个管，并使用手术刀小心地从每个管的末端切开一厘米的样品。在4摄氏度下在2%谷胱甘肽中孵育样品，随后在室温下孵育15分钟，在室温下孵育1%的三氧化二氮。在三氧化二氮孵育结束时，每浓度在上升乙醇系列中脱水样品20分钟，随后在100%乙醇中脱水30分钟。在100%乙醇孵育结束时，使用X射线微型CT扫描仪，在以5千伏的加速度电压扫描电子显微镜对样品进行成像之前，让样品在室温下干燥过夜。用于血液样本的流动细胞测量分析。将每个样品中100微升的血液转移到9个5毫升的FACS管中，并在室温下将每管添加100微升4%的甲醛，在室温下固定15分钟。洗涤后，将每个颗粒重新悬浮在每管一毫升红细胞解液缓冲液中，在室温下孵育五分钟，防止光线。在孵育结束时，将样品用离心每管一毫升PBS洗净，将样品中没有超级钠的样品放在冰上。为了准备单染色补偿珠添加四滴正珠和四滴负珠到个别一毫升体积的FACS缓冲液，并涡旋溶液，以获得均匀的珠悬浮液。在每个标有指示的四到五毫升的 FACS 管中加入 100 微升每个溶液，每个管用一毫升的 FACS 缓冲液清洗珠子。接下来，在每个实验和荧光减去一管与温和混合中加入100微升适当的涡流抗体鸡尾酒。在室温下孵育30分钟，不受光线影响。在孵育结束时，用每粒样品一毫升的新鲜 FACS 缓冲液清洗样品，并在每管 250 微升的 FACS 缓冲液中重新填充颗粒。在根据标准方案通过流式细胞仪分析细胞样本上的珠子之前。通过微CT和扫描电子显微镜成像，可以在拼接两个bloop的整个表面上可视化血细胞分布，而没有在没有间隙的闭环中观察到血块。分析整个血细胞计数，没有显示红细胞数之间的任何测试条件，血小板和白细胞数之间的显著差异，然而，在乳胶循环组和自由血红蛋白数量急剧增加，表明乳胶的生物相容性很差。虽然所有测试的血管设备诱导凝血系统和恭维组件的激活增加。与聚合物涂层PVC循环相比，肝素涂层PVC环表现出两种活化水平下降的趋势。乳胶环表现出最高水平的TNF IL-6和PMN弹性酶，突出了乳胶对白细胞的强效活化。CD41正血小板从乳胶管中回收，CD62P的中值荧光强度极高，而粒细胞和淋巴细胞的整合表达则大幅减少。感兴趣的是，乳胶管的单核细胞中整体水平较高，表明单核细胞激活血小板相互作用。事实上，单细胞血小板集料的染色表明乳胶和支架循环中聚集趋势增加。尽管乳胶环内单核细胞的频率降低。为了避免内在血液成分激活，重要的是要确保适当的环闭合和小心处理血液。因此，按照这个程序，可以分析异基因蛋白或TRUCK和用于炎症或药物研究的血液成分之间的相互作用。

Research

JoVE Journal

Medicine

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

采用实时定量PCR检测供体细胞植入一个具有竞争力的小鼠骨髓移植模型

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

科研

医学

Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula

在的鼠标Aortocaval瘘的技术方面

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

脑Microslices的兴奋性刺激作为<em&gt;在体外</em&gt;中风模型

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Monitoring of Systemic and Hepatic Hemodynamic Parameters in Mice

全身及肝脏血流动力学参数的监测小鼠

The use of mouse models in experimental research is of enormous importance for the study of hepatic physiology and pathophysiological disturbances. ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

建立一个人类多发性骨髓瘤异种移植模型中的鸡，研究肿瘤的生长，侵袭和血管生成

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

的Perigenital敏感性和前列腺肥大细胞活化新生母婴分离的小鼠模型评估

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the ...

Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video

套筒技术在主动脉移植小鼠模型中的应用-教学视频

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the ...

An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

一种优化的埃文斯蓝协议对小鼠血管泄漏的评估

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ...

Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow

流循环模型中血液接触植入物的血液相容性测试模拟人类血流

The growing use of medical devices (e.g., vascular grafts, stents, and cardiac catheters) for temporary or permanent purposes that remain in the ...

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

器官缺血-输液损伤模拟大鼠肝脏移植模型的血动力学变化

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...