Name: an in vitro hemodynamic loop model to investigate the hemocytocompatibility and host cell activation of vascular medical devices
Uploaded: 2020-08-21T13:00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices at JoVE.com

Les auteurs remercient Mme Elena Denks pour son assistance technique.

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Cette étude a montré que le modèle de boucle hémodynamique in vitro présenté offre une méthode fiable pour tester la compatibilité sanguine in vitro des dispositifs médicaux conformément à la norme ISO 10993-4.
Les étapes critiques du protocole comprennent le présage de sang et le remplissage des tubes avec du sang, où le vide excessif ou l’agitation doit être évitée pour empêcher les composants sanguins de l’activation par la procédure de manipulation. En outre, il est très important de congeler immédiatement les échantillons de plasma et de les garder sur la glace après la décongélation, car l’activation du système de complément et de coagulation peut être altérée en gardant les échantillons à température ambiante pendant une plus longue période.
Étant donné que ce modèle a à la fois des mérites et des déméritations par rapport à d’autres modèles in vitro, plusieurs facteurs doivent être pris en compte lors de la conception des expériences.
Tout d’abord, les boucles peuvent être variées en longueur et en diamètre pour s’adapter à diverses configurations expérimentales. Dans le cas où la configuration comprend des tubes contrastés de diamètres intérieurs variables, il convient de garder à l’esprit que les différences de diamètre se traduira par différentes forces de cisaillement, affectant ainsi la coagulation et compléter la cascade7. Deuxièmement, la vitesse de rotation a été réglée à 30 rpm dans cette expérience. Ceci aura comme conséquence un flux sanguin d’approximativement 25 cm/s, qui est comparable à la vitesse de flux sanguin dans les greffes humaines de déviation de déviationd’artère coronaire 25. Le taux de tension, généré par la rotation des boucles, est le paramètre principal qui initiera des cascades biochimiques de composants sanguins, y compris des cellules et des protéines sans cellules. Mais comme le sang est un fluide non newtonien, le taux de tension sera également influencé par la courbure du tube, respectivement la longueur des tubes qui sont fermés aux boucles10. Chaque fois que la vitesse de rotation ou la taille de la boucle est modifiée, il est important de considérer que la corrélation entre la vitesse de contrainte et la vitesse de rotation n’est pas linéaire. La corrélation entre la vitesse de rotation et le taux de contrainte n’est pas suffisamment examinée jusqu’à aujourd’hui et d’autres études sont nécessaires pour étudier ces paramètresparticuliers 10,26,27. Toutefois, sur la base d’un modèle de couche limite laminaire, le diamètre donné du tube de 5 mm et la vitesse de rotation de 25 cm/s, une estimation approximative du stress du cisaillement mural (WSS) indiquerait des valeurs comprises entre 2,20 et 22,00 pascal pour une distance de 1 00 à 0,01 mm jusqu’à la paroi du tube lorsque la densité sanguine est estimée à 1 060 kg*m-3 et que la viscosité kinétique est fixée à 0,0025 pascal*s28,29. Fait intéressant, également une analyse computationnelle plus détaillée de la dynamique du débit dans la courbure des artères coronaires humaines a montré des valeurs WSS allant de 11,33 à 16,77 pascal à des paramètres à peu près comparables pour la vitesse, la densité et la viscosité du sang30.
Outre cette limitation, le modèle de boucle présenté est un système de pression moins, qui n’imite pas les rapports intravasculaires de pression artérielle du système vasculaire humain.
La prochaine limitation importante est que le sang est en contact avec l’air à l’intérieur des boucles, ce qui apporte des interférences supplémentaires. Un tel contact sang-air est impacté par deux paramètres, qui incluent la perméabilité du gaz des tubes et la rétention d’air à l’intérieur des boucles tout en les remplissant de sang. Chaque matériau de tube possède une certaine perméabilité de gaz qui peut conduire à des changements significatifs dans les concentrations de gaz à l’intérieur des tubes. Alors que certains auteurs affirment que l’effet qui en résulte de la perméabilité du gaz sur l’activation des composantssanguins reste incertain 31, il est connu que la fonction des coagulateurs sanguins est très sensible à un décalage de pH, qui peut être causé par la diffusion du CO2 32,33,34. Ici, nous avons testé la biocompatibilité des tubes de perfusion de sang dans des conditions d’air intérieur, comparables aux scénarios cliniques de perfusion extracorporeal de sang. Pour les améliorations futures du modèle présenté, l’incubation de l’ensemble du modèle dans un incubateur de CO2 et la validation du pH sanguin avant et après l’incubation pourraient être utiles pour normaliser davantage ce modèle.
En outre, l’interface sang-air à l’intérieur des boucles peut conduire à l’activation des protéines plasmatiques et des fractionscellulaires du sang 35,36. Les dispositifs entraînés par pompe à rouleaux sans air à l’intérieur des tubes peuvent éviter la question de l’interface sang-air, mais ils induisent certainement des dommages aux cellules sanguines avec des niveaux élevés significatifs d’hémoglobine par rapport au modèle de boucle ici présenté, et l’hémoglobine dans le plasma peut interférer avec la sensibilité des analytes testés dans ELISA16. Dans cette étude, nous avons montré que l’effet hémolytique du modèle de boucle lui-même reste minime tout en utilisant des matériaux biocompatibles tels que les tubes de PVC enduits d’héparine. Ainsi, le modèle n’est pas, d’une part, causer des dommages cellulaires excessifs par rapport aux modèles entraînés par la pompe, mais d’autre part induire des protéines plasmatiques dues au contact de l’air sanguin. Fait à noter, van Oeveren et coll. ont mis au point un modèle de boucle à soupapes à billes évitant l’air à l’intérieur desboucles 16. Cette alternative prometteuse au modèle de boucle ici présenté peut surmonter le problème de l’interface sang-air, cependant, par rapport au modèle présenté ici, l’adhérence plaquettaire est encore plus élevé pour le modèle de boucle à base de valve à billes.
En ce qui concerne le contrôle statique, il convient de noter que le verre lui-même s’est montré être un activateur puissant du système coagulant37. Cependant, dans la configuration présentée, l’incubation dans un bécher en verre (contrôle statique) n’a pas mené à l’activation ou à l’activation excessive de cellules d’hôte du système coagulant comparé aux niveaux de ligne de base directement après avoir dessiné le sang. En conclusion, il pourrait être utile d’utiliser par exemple des tubes en polypropylène, si le contrôle statique montre des niveaux élevés d’activation.
Qu’il s’agisse d’un modèle en boucle ou d’un modèle à pompe, ces modèles in vitro n’ont absolument pas les interactions biologiques authentiques qui sont principalement contribuées par un endothélium intact, qui est une surface idéale de contact avec le sang. La raison d’être de cette question est plus évidente lorsqu’un dispositif médical comme un stent est testé, ce qui pourrait donner des résultats différents, en termes d’activation et de protéines plasmatiques, lors de son interaction avec les composants sanguins en présence d’endothélium. Ceci déclare être un inconvénient majeur de tous les systèmes in vitro discutés imitant le système circulatoire. Par conséquent, pour surmonter ce problème, les nouveaux systèmes microfluidiques qui sont entièrement recouverts d’endothélium gagnent un immense intérêt, mais néanmoins par rapport au modèle de boucle présenté ici, ils sont encore limités pour accueillir des volumes sanguins plus petits et des débitsminimaux 38,39
Ainsi, nous concluons que le modèle Chandler Loop reste un modèle robuste pour effectuer des tests normalisés sur la biocompatibilité sanguine des dispositifs médicaux vasculaires dans le domaine de la recherche cardiovasculaire.

L’essai d’hémocompatibilité des dispositifs médicaux est une étape cruciale dans le développement de nouveaux dispositifs tels que des enchevêtrements vasculaires ou des tubes de perfusion pour l’oxygénation extracorporeal de membrane. Jusqu’à aujourd’hui, les modèles animaux sont considérés comme des outils standard pour finaliser la procédure de test des dispositifs médicaux avant sa mise en œuvre chez l’homme. Désormais, il est nécessaire de trouver d’autres modèles in vitro qui aident davantage à minimiser les enquêtes sur les animaux. Dans cette étude, nous avons donc exploré un modèle miniature en boucle hémodynamique in vitro. L’objectif de cette méthode présentée est de tester la compatibilité sanguine in vitro des dispositifs médicaux conformément à la norme ISO 10993-4.
La norme ISO 10993-4 décrit des ensembles normalisés de paramètres cliniques à étudier sur l’échantillon de sang1. En bref, il s’agit de thrombose (agrégation et dénombrement des plaquettes), de coagulation (fibrinopeptide A, FPA), d’analyse hématologique (nombre de cellules sanguines entières), d’indice d’hémolyse (hémoglobine plasmatique libre) et du système de complément (complexe terminal de complément, sC5b9). Cependant, d’autres marqueurs, tels que l’élastase polymorphonucléaire de neutrophile (PMN), l’interleukine 6 (IL-6) et le facteur de nécrose de tumeur - alpha (TNF) reflétant le statut d’activation des leucocytes peuvent également être expliqués pour des mesures. Pour déterminer et quantifier les protéines libres de cellules circulant qui sont présentes dans le plasma sanguin, l’analyse immunosorbent liée enzymatique de sandwich (ELISA) représente une méthode conventionnelle et la plusfiable 2,3. De même, le phénotype et l’état d’activation des cellules hôtes (p. ex., les leucocytes) peuvent être quantifiés en détectant l’expression de surface cellulaire des molécules par cytométrie d’écoulement (FACS) qui fournit des readouts basés sur la suspension cellulaire unique, où les anticorps spécifiques étiquetés fluorescents se lient aux molécules ciblées de surfacecellulaire 4. La microscopie électronique à balayage (SEM) est également recommandée pour déterminer la formation de thrombus sur le matériau testé par la norme ISO 10993-41. Cette méthode peut être complétée par une microtomographie aux rayons X (μCT), pour effectuer une analyse structurelle du thrombus par exemple, son épaisseur, sa taille et sa localisation dans une image rendue 3D5.
La raison d’être de l’utilisation de ce modèle hémodynamique in vitro est de dépister les dispositifs médicaux les plus performants et compatibles en comprenant la dynamique physiologique de base des composants sanguins tels que les plaquettes, qui sont impliqués dans l’hémostase primaire ou les leucocytes et leur interaction avec différents types d’appareils vasculaires. Ces systèmes in vitro sont très demandés car ils réduisent le besoin d’études sur les animaux.
Le modèle de boucle présenté ici répond à ces exigences. Ce modèle a d’abord été décrit par A.B. Chandler en 1958 pour la production de thrombi de sang et est, par conséquent, également appelé Chandler Loop modèle6. Jusqu’à présent, ce modèle a été utilisé dans une série d’expériences et de modifications pour étudier la biocompatibilité sanguine des dispositifsmédicaux 7,8,9,10,11,12,13,14. Il se compose de tubes polymères, qui sont partiellement remplis de sang et formés en boucles refermables. Ces boucles tournent dans un bain d’eau à température contrôlée pour simuler les conditions d’écoulement vasculaire avec ses effets hémorologiques. Des méthodes alternatives telles que les modèles entraînés par pompe ou les modèles qui utilisent des valves mécaniques à billes à l’intérieur des boucles pour induire un flux sanguin à l’intérieur des tubespolymères ont déjà été décrits 15,16. Cependant, l’avantage global de la méthode présentée ici est que la force mécanique appliquée aux cellules sanguines et aux protéines est faible, évitant l’hémolyse, et il n’y a aucun contact entre le sang et les connecteurs, qui pourrait éventuellement mener aux turbulences de flux et à l’activation des composants sanguins. Les principaux facteurs d’activation à l’intérieur de la boucle sont le matériau d’essai lui-même et l’air qui est emprisonné à l’intérieur. Ceci aide à réduire au minimum des sources d’erreur de mesure et à fournir une reproductibilité élevée, même si l’interface sang-air peut mener à la dénaturation deprotéine 17. Il est également possible d’étudier des variétés de matériaux tubulaires et de diamètres de stent sans restrictions de longueur ou de taille permettant ainsi l’utilisation de tubes de longueur et de diamètre intérieur différents. De plus, il est également possible d’étudier les hémocompatibilités de l’hôte lors de la fermeture inexacte des boucles et de l’exposition à la surface du tube non encoated. D’autres applications médicales similaires de ce modèle de boucle hémodynamique in vitro est qu’il pourrait également être utilisé pour étudier les interactions entre l’immunothérapie (médicaments) et les composants sanguins pendant le développement préclinique ou le dépistage individuel de l’innocuité des médicaments avant le premier essai clinique de phase I chez l’homme, ou pour la génération de matériaux thrombus qui peuvent être utilisés dans d’autresexpériences 18,19,20.
Cette étude décrit un protocole détaillé pour tester les hémocompatibilités des tubes de perfusion et/ou des enchevêtrés. Ici, la comparaison entre les tubes de PVC non encoated et enduits (hepPVC : revêtement d’héparine, polyPVC : revêtement avec un polymère bioactif). L’activation abaissée des plaquettes, mais une activation plus élevée du système de coagulation (FPA) ont été trouvées pour les deux tubes enduits par rapport aux tubes non encoated. Les tubes hepPVC utilisés ici sont modifiés avec de l’héparine covalente liée pour les rendre thromborésistants21 et ont déjà été utilisés dans un modèle de boucle pour optimiser et caractériser différents paramètres22. Les tubes en polyPVC utilisés dans cette étude sont des tubes disponibles dans le commerce utilisés dans les milieux cliniques de perfusion sanguine extracorporelle et sont recouverts d’un polymère héparine pour réduire leur thrombogénicité23. Parfois, dans les applications cliniques, même les tubes de PVC non encoated sont utilisés. Par conséquent, nous avons inclus des tubes de latex comme groupe témoin positif qui a montré l’activation excessive des plaquettes, du système de coagulation, et des facteurs solubles comme IL-6, TNF et elastase de PMN. La formation de Thrombus a été remarquée lorsque la fermeture inexacte de la boucle a été simulée. Ceci a mené à l’activation du système de coagulation et de complément aussi bien que des leucocytes et des plaquettes comparés aux conditions de base. En outre, le contact de sang au matériel de stent ici utilisé (stent nitinol en métal nu, couvert de polytetrafluoroethylène étendu imprégné de carbone) a mené à l’activation plus élevée de plaquette et de leucocyte en termes d’élasstase de PMN. Dans l’ensemble, le modèle présenté n’a induit l’hémolyse dans aucun des dispositifs vasculaires examinés car ils étaient comparables aux conditions de ligne de base ou statiques, excepté les tubes de latex, où l’hémolyse de globule rouge (RBC) était évidente. En outre, ces tubes de perfusion peuvent être examinés soit par imagerie, soit par histologie. Bien que des évaluations histologiques puissent être réalisables, nous nous sommes principalement concentrés sur l’ELISA et la cytométrie de flux pour effectuer ces expériences et ainsi permettre les faisabilités de mener des expériences basées sur le modèle présenté ici pour de nombreux laboratoires. Ainsi, cette méthode représente une méthode réalisable pour tester la biocompatibilité sanguine des dispositifs médicaux vasculaires conformément aux recommandations de la norme ISO 10993-4. En outre, cette méthode peut être utilisée chaque fois qu’une interaction entre le sang et les matériaux doit être testée dans des conditions d’écoulement, imitant les conditions in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 ml tube, K3 EDTA</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>32332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td>Becton Dickinson BioSciences</td>
			<td>552843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>368512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa II cell analyzer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>647465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Citrate Tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>369714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer one-use holder</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>364815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Safety-Lok butterfly canula 21 G</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker glass ROTILABO short 10 ml</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>X686.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker glass ROTILABO short 50 ml</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>X688.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-human CD162 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-human CD41 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge ROTINA 420 | 420 R</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td>4701 | 4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHC Super modified, 5mm PVC tubing</td>
			<td>Corline Sweden</td>
			<td>1807-148</td>
			<td>Referred to as hepPVC tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular Precision Cutter</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 007-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Closing Unit (complete with tension bands)</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 008-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric tape Scotch Super 33+</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MMMA331933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA MAX Deluxe Set Human IL-6</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>430504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA MAX Deluxe Set Human TNF-a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>430204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,1 &#8211; 2,5 &#181;L, gray</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,5 &#8211; 10 &#181;L, gray</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 10 &#8211; 100 &#181;L, yellow</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 100 &#8211; 1,000 &#181;L, blue</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 20 &#8211; 200 &#181;L, yellow</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. sample bag, 0,5 &#8211; 5 mL, violet</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes polystyrene 5.0 ml round bottom</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum Gold Plus</td>
			<td>Bio-Sell</td>
			<td>FBS.GP.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>367116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluency plus stent 13.5 x 60 mm</td>
			<td>Angiomed GmbH &#38; Co</td>
			<td>FVM14060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free Hemoglobin fHb Reagent</td>
			<td>Bioanalytics GmbH</td>
			<td>004001-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS Tablets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves Vasco Nitril white L</td>
			<td>B. Braun Deutschland GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td>9208437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves Vasco Nitril white M</td>
			<td>B. Braun Deutschland GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td>9208429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25% aequous solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G6257-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin, 25.000 IE in 5 ml</td>
			<td>Rotexmedica, Trittau, Germany</td>
			<td>PZN 3862340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fibrinopeptide A (FPA) ELISA Kit</td>
			<td>H&#246;lzel Diagnostika</td>
			<td>abx253234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kodan tincture forte colourless</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td>104012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex tube, ID 5 mm</td>
			<td>Laborhandel24 GmbH</td>
			<td>305 0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loop Stand</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 009-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medimex venous tourniquet classic</td>
			<td>ROESER Medical GmbH</td>
			<td>310005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite 200 Pro M Plex</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>TEC006418I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate shaker PMS-1000i</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Metric non-phthalate PVC tubing, ID 5 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NALG8703-0508</td>
			<td>Referred to as PVC tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NexTemp (Standard) Single-Use Clinical Thermometer</td>
			<td>Medical Indicators</td>
			<td>2112-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp ELISA Plates, uncoated</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10256970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD16Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD62P (P-Selectin) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller, pipetus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips epT.I.P.S. 0.2 - 5 ml</td>
			<td>OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>5186480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips epT.I.P.S. standard 0,1 - 10&#181;l</td>
			<td>Th. Geyer GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>9409410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips epT.I.P.S. standard 2 - 200&#181;l</td>
			<td>Th. Geyer GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>0030 000.870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips epT.I.P.S. standard 50 - 1000&#181;l blue</td>
			<td>Th. Geyer GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>0030 000.919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMN (Neutrophil) Elastase Human ELISA Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BMS269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe stand ROTILABO combi</td>
			<td>CARL ROTH</td>
			<td>K082.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for rotation unit (12 slots 3/8 &#39;&#39; with variable slot width)</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 011-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10X)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-1184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotation Unit</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 010-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock micro test tubes 0.5 ml</td>
			<td>OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>5409320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock micro test tubes 1.5 ml</td>
			<td>OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>5409331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sc5b9 Human ELISA KIT</td>
			<td>TECOmedicalGroup</td>
			<td>A029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel no 10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9999403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope XL30 ESEM-FEG</td>
			<td>Philips</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 1000 ml, GL 45</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>X715.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 500 ml, GL 45</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>X714.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro cuvette 1.6 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67.746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10.0 ml</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 25.0 ml</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 5.0 ml</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tube, inner diameter 8 mm, outer diameter 12 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BURK8803-0812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprout mini centrifuge</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>552034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Solution for TMB Substrate</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>77316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swabs, sterile</td>
			<td>Fuhrmann GmbH</td>
			<td>32055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 ml</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled water basin</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 020-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butanol, 99.5%, extra pure, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10000730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB Substrate Set</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>421101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trillium PVC tube, 5 mm ID</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>161100107100103</td>
			<td>Referred to as polyPVC tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4974,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spektrometer Lambda 2</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>33539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vornado Mini Vortexer</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>55BV101-B-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XN-3000 workstation blood analyzer</td>
			<td>Sysmex Europe</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-CT Phoenix Nanotom S</td>
			<td>GE Sensing &#38; Inspection, Wunstorf, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro hemodynamic loop model to investigate the hemocytocompatibility and host cell activation of vascular medical devices

Dans cette étude, l’hémocompatibilité des tubes avec un diamètre intérieur de 5 mm fait de chlorure de polyvinyle (PVC) et recouvert de différents conjugués bioactifs a été comparée à des tubes de PVC non encoated, tubes de latex, et un endoprothent pour l’application intravasculaire qui a été placé à l’intérieur des tubes de PVC. L’évaluation de l’hémocompatibilité a été faite à l’aide d’un modèle de boucle hémodynamique in vitro qui est recommandé par la norme ISO 10993-4. Les tubes ont été coupés en segments de longueur identique et fermés pour former des boucles évitant tout écart à l’épissage, puis remplis de sang humain et tournés dans un bain d’eau à 37 °C pendant 3 heures. Par la suite, le sang à l’intérieur des tubes a été recueilli pour l’analyse du nombre de cellules sanguines entières, de l’hémolyse (hémoglobine plasmatique libre), du système de complément (sC5b-9), du système de coagulation (fibrinopeptide A) et de l’activation des leucocytes (élastase polymorphonucléaire, facteur de nécrose tumorale et interleukine-6). L’activation de cellules hôtes a été déterminée pour l’activation de plaquette, le statut d’intégrine de leucocyte et les agrégats de plaquette de monocyte utilisant la cytométrie de flux. L’effet de la fermeture inexacte de boucle a été examiné avec la microtomographie de rayon X et la microscopie électronique de balayage, qui a montré la formation de thrombus à l’épissage. Les tubes de latex ont montré l’activation la plus forte des composants plasmatiques et cellulaires du sang, indiquant une mauvaise hémocompatibilité, suivie par le groupe d’endonts et les tubes de PVC non encoated. Les tubes enduits de PVC n’ont pas montré une diminution significative de l’état d’activation de plaquette, mais ont montré une augmentation de la cascade de complément et de coagulation comparée aux tubes non cirés de PVC. Le modèle de boucle lui-même n’a pas mené à l’activation des cellules ou des facteurs solubles, et le niveau d’hémolyse était bas. Par conséquent, le modèle de boucle hémodynamique in vitro présenté évite l’activation excessive des composants sanguins par des forces mécaniques et sert de méthode pour étudier les interactions in vitro entre le sang du donneur et les dispositifs médicaux vasculaires.

Toutes les données présentées, à l’exception des parcelles FACS, ont été analysées à l’aide d’un logiciel de statistiques. Les parcelles FACS ont été analysées à l’aide d’un logiciel de cytométrie de flux.
L’analyse du nombre de cellules sanguines entières n’a montré aucune différence significative en ce qui concerne les érythrocytes entre toutes les affections testées (figure 2). Mais, les plaquettes et les leucocytes ont été considérablement réduits dans le groupe de latex, indiquant une biocompatibilité très pauvre du latex. Ceci est également souligné par l’augmentation des niveaux d’hémoglobine libre dans le groupe de latex, ce qui indique le fait que, sauf pour le groupe de latex, aucun des autres dispositifs vasculaires ou conditions n’a conduit à une hémolyse étendue (Figure 2). En outre, les tubes enduits de PVC, le polyPVC et l’hepPVC, aussi bien que le stent examiné n’ont pas mené à la thrombose au moyen de la perte de plaquette et de leucocyte, alors que le latex a exhibé la perte la plus élevée de plaquette et de leucocyte, suivie des tubes non encoated de PVC qui ont montré une tendance diminuée.
Bien que tous les dispositifs vasculaires testés aient mené à l’activation accrue du système de coagulation (FPA) et du composant de complément (sC5b-9), les boucles d’hepPVC ont montré une tendance pour des niveaux diminués de FPA et de sC5b-9 par rapport spécifiquement aux boucles de polyPVC (figure 3). Fait intéressant, les boucles de PVC et gap non encoated ont montré des niveaux inférieurs de FPA comparés au polyPVC, bien qu’n’atteignant pas le niveau de signification statistique. Néanmoins, les boucles de latex ont montré des niveaux sensiblement accrus de FPA par rapport aux conditions de ligne de base et statiques.
Conformément au nombre de cellules sanguines entières, les boucles de latex présentaient les niveaux les plus élevés deTNF, IL-6 et PMN elastase (figure 4), atteignant le niveau de signification statistique par rapport au reste des groupes en termes de TNF et IL-6 (Figure 4A,B), tandis que pour les conditions statiques et de base en termes d’élasstase PMN (Figure 4C). Ces résultats indiquent l’activation puissante des leucocytes par latex. Les niveaux de base des marqueurs d’activation étaient toujours comparables aux conditions statiques, indiquant une héparinisation appropriée du sang.
Fait intéressant, il a été démontré que le nombre de plaquettes et de leucocytes pour les boucles induites par l’écart n’a été que légèrement réduit avec l’activation modérée du système coagulatoire (FPA) et des leucocytes (élasstase PMN), bien qu’une fermeture incorrecte de la boucle avec des turbulences d’écoulement résultantes et un contact sanguin avec la surface de coupe rugueuse non cintrée ont conduit à des caillots macroscopiquement visibles à l’épissage(figure 1F). Les caillots et sa distribution sur toute la surface de l’épissage étaient évidents avec des images μCT et SEM, tandis qu’aucun caillot n’a été trouvé lorsque les boucles ont été fermées avec le dispositif de fermeture externe ne laissant aucun écart entre les terminaisons de boucle (figure 5).
L’analyse cytométrique de flux des cellules sanguines hôtes qui ont été tachées avec des marqueurs spécifiques plaquettes, CD41 et marqueur d’activation plaquettaires CD62P, sont indiquées dans la figure 6A,B. Ici, les tubes de latex ont exhibé l’intensité médiane excessivement élevée de fluorescence (IMF) pour CD62P sur des plaquettes de sang, suivies de stent, tandis que les tubes en polyPVC enduits d’héparine ont exhibé l’activation minimale des plaquettes dépeignant la propriété anti-thrombogenic des tubes de polyPVC. En outre, les leucocytes ont été classifiés sur la base de la granularité à base de CD45 et de SSC (dispersion latérale) en (i) granulocytes; (ii) les monocytes et (iii) les lymphocytes (figure 7), et l’expression de CD162+ intégrine a été détectée sur chaque sous-population de leucocytes qui sont connus pour interagir avec le CD62P sur les plaquettes24. On l’a remarqué que les expressions d’intégrine ont été considérablement réduites sur des granulocytes et des lymphocytes dans des boucles de latex. Ce résultat était conforme aux niveaux réduits de fréquences totales des leucocytes dans les boucles de latex (figure 2). En général, les niveaux d’intégrine étaient plus élevés parmi les monocytes par rapport aux granulocytes et aux lymphocytes, indiquant la probabilité pour l’interaction de monocyte avec les plaquettes activées. À cet égard, les agrégats de plaquettes monocytes ont également été évalués en soudant les cellules sanguines avec cd14 (comme marqueur monocyte) et CD41 (comme marqueur plaquettaires) et, en fin de compte, pour identifier les cellules doubles positives, c’est-à-dire CD14+CD41+MPA (Figure 8). Ici, nous avons remarqué que le groupe de stent a exhibé les niveaux les plus élevés d’expression de CD41 sur le MPA, suivi par le groupe de latex, indiquant une tendance accrue à former MPA, en dépit de la fréquence réduite du monocyte (<1 %) dans les boucles de latex.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig01.jpg"> Figure 1 : Aperçu du modèle de boucle hémodynamique in vitro et de ses modifications. ( A )Bouclepour l’expérience d’écart avec le système externe de fermeture de boucle, ne laissant aucune lacune à l’épissage. (B) Boucle faite de tube en PVC enduit de polyPVC et en stent à l’intérieur (flèche). (C) Boucle en tube de latex. (D) Boucle pour l’expérience d’écart sans le système de fermeture de boucle externe laissant un espace entre les terminaisons de tube (flèche). (E) Boucles placées dans le berceau de boucle à l’intérieur du bain d’eau et remplies de sang. (F) Thrombus résultant en un écart à l’épissage (flèche) après rotation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig01large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig02.jpg"> Figure 2 : Résultats pour le nombre de cellules sanguines et l’hémoglobine plasmatique. (A) Les érythrocytes comptent. (B) Les plaquettes comptent. (F) Les leucocytes comptent. (D) Hémoglobine plasmatique gratuite. Les résultats indiquent la biocompatibilité pauvre du latex, menant à l’hémolyse excessive. Les données sont présentées comme valeur moyenne; les barres d’erreur indiquent SEM. n=1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig02large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig03.jpg"> Figure 3 : Résultats pour l’activation du système de coagulation et de complément. (A) Activation du système de coagulation, mesurée par les niveaux de Fibrinopeptide A (FPA) (B) Activation du système de complément, mesurée par des niveaux de sC5b-9. Tandis que les tubes de latex ont évoqué des niveaux élevés significatifs de la FPA, l’activation de complément était forte pour tous les matériaux examinés. Les données sont présentées comme valeur moyenne, les barres d’erreur indiquent SEM. *p<0.05, n=1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig03large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig04.jpg"> Figure 4 : Marqueurs d’activation des leucocytes. (A) Facteur alpha de nécrose tumorale (TNF). (B) Interleukin 6 (IL-6) (C) PMN Elastase. Les résultats indiquent une activation accrue des leucocytes en raison des niveaux élevés des marqueurs analysés, suivis des boucles en stent, qui ont seulement mené aux niveaux accrus pour PMN Elastase mais pas TNF ou IL-6. Les données sont présentées comme valeur moyenne, les barres d’erreur indiquent SEM. *p<0.5; **p<0.01, n=1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig04large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig05.jpg"> Figure 5 : Imagerie de l’épissage des boucles. (A) μ-ordinateur (μCT) de boucles avec fermeture incorrecte (écart). Les zones rouges indiquent le matériau thrombus. (B) Rendu du côté luminal du tube. La sélection rectangulaire indique la zone de numérisation de la microscopie électronique (SEM) (C). (D) μCT de boucles avec dispositif de fermeture de boucle externe et pas d’espace à l’épissage, et (E) rendu et vue de la surface luminale. Aucun matériau thrombus n’a été trouvé. (F) IMAGE SEM de la sélection rectangulaire dans (E). Aucun matériau thrombus n’a été trouvé sur la surface de coupe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig05large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig06.jpg"> Figure 6 : Parcelle FACS pour l’activation des plaquettes (CD62P). (A) Parcelle représentative FACS (état de base) montrant le sang CD41+ plaquettes. (B) Graphique montrant l’état d’activation des plaquettes reflété par l’intensité moyenne de fluorescence (IMF) des différents types d’appareils vasculaires par rapport à la RT statique et les conditions de base. Les barres de données présentent les données à partir de mesures individuelles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig06large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig07.jpg"> Figure 7 : Parcelle facs pour l’intégrine leucocyte (CD162). (A) Parcelle représentative facs (condition de base) montrant le sang CD45+ leucocytes et sous-groupes (B) Graphique montrant le leucocyte CD162+ intensité moyenne de fluorescence intégrine (IMF) des différents types de dispositifs vasculaires par rapport aux conditions statiques et de base. Les barres de données présentent les données à partir de mesures individuelles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig07large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig08.jpg"> Figure 8 : Parcelle FACS pour les agrégats de monocytes plaquettes (CD41/CD14). (A) Parcelle représentative facs (condition de base) montrant le glas des monocytes sanguins (CD45+/CD14+), plaquettes (CD41+) et agrégats plaquettes monocytes (CD41+/CD14+) ( B )Graphiquemontrant l’intensité de fluorescence CD41+ moyenne (IMF) sur les agrégats de plaquettes monocytes pour les différents dispositifs vasculaires par rapport aux conditions statiques et de base. Les barres de données présentent les données à partir de mesures individuelles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig08large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

Présenté ici est un protocole pour un modèle standardisé en boucle hémodynamique in vitro. Ce modèle permet de tester l’hémocompatibilité des tubes de perfusion ou des en-uns vasculaires conformément à la norme ISO (Organisation internationale pour la normalisation) 10993-4.

Un modèle de boucle hémodynamique in vitro pour étudier l’hémocytocompatibilité et l’activation cellulaire hôte des dispositifs médicaux vasculaires

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive ...

Ce modèle de boucle hémodynamique permet aux chercheurs de tester la compatibilité in vitro de l’hémo des dispositifs vasculaires tels que les tubes de perfusion ou les enchevêtrés. dans des conditions normalisées. Ainsi, cette technique n’exerce aucun impact sur le sang par la force mécanique et évite ainsi les résultats trompeurs par l’activation intrinsèque des composants sanguins.Avant de tenter une expérience, il faut pratiquer un assemblage de pièces mécaniques approprié, une construction parfaite du système de fermeture de boucle et une charge sanguine lente dans les boucles. Pour préparer l’assemblage de la boucle, utilisez un coupe-tube pour couper 250 centimètres de long, cinq millimètres de diamètre intérieur morceaux de tube sur une surface plane. Et branchez les terminaisons ouvertes des tubes dans un court morceau de tube de silicium raccordant le diamètre extérieur du tube d’investigation pour générer une forme de boucle.Serrez soigneusement la vis de verrouillage du connecteur de bande de tension et ajustez la force de fermeture de sorte qu’il n’y ait pas d’espace entre les deux flexions. Si la vis de verrouillage est complètement resserrée et que la tension de la bande de polycarbonate semble trop faible pour combler l’écart entre les deux flexions, ouvrez le système de verrouillage et coupez quelques millimètres de la bande de tension. Pour préparer un assemblage de boucle stent, ouvrez deux des boucles et sortez le tube du système de bande de tension.Insérez ensuite le stent au milieu du tube selon les instructions du fabricant. Lorsque le nombre approprié de boucles pour l’expérience ont été générés sécuriser les boucles dans le berceau de boucle de l’unité de rotation, en dehors d’un bain d’eau de 37 degrés et attacher le berceau de boucle à l’unité de rotation à l’intérieur du bain d’eau. Ensuite, remplissez une seringue de 10 millilitres pour chaque deux boucles de sang à recueillir avec 150 microlitres ou solution fraîchement préparée de stock d’héparine et utilisez un papillon de calibre 21 pour recueillir doucement le sang dans les seringues, en prenant soin d’éviter l’homolyse ou l’activation cellulaire due à un vide excessif.Lorsque tout le sang a été recueilli transférer le sang à un bécher en verre et utiliser une pipette sérologique de cinq millilitres, pour mélanger doucement le sang et l’héparine. Lorsqu’une solution homogène a été obtenue avec la pointe pipette pas complètement insérée dans le tube, remplissez soigneusement chaque boucle de cinq millilitres de sang. Fermez chaque boucle une fois qu’elle a été remplie et confirmez que la boucle, la bande de tension et le rack sont correctement fixés.Faites ensuite pivoter les boucles pendant trois heures à 30 révolutions par minute. À la fin de la rotation, laissez les boucles rester dans la grille pendant deux minutes pour laisser le sang s’accumuler au fond de la boucle avant d’ouvrir soigneusement les connecteurs et de tirer le sang des doublons en beakers en verre de 10 millilitres individuels. Lorsque tout le sang a été recueilli rincer chaque tube avec 10 millilitres de PBS et utiliser un scalpel pour couper soigneusement un échantillon d’un centimètre de l’extrémité de chaque tube.Incuber les échantillons pendant la nuit dans 2% de glutaraldehyde à quatre degrés Celsius, suivi d’une incubation de 15 minutes et 1% de tétoxyde d’osmium à température ambiante. À la fin de l’incubation du tétoxyde d’osmium, déshydrater les échantillons dans une série ascendante d’éthanol pendant 20 minutes par concentration, suivi d’une déshydratation de 30 minutes dans 100% d’éthanol. À la fin de l’incubation 100% éthanol, laissez sécher les échantillons pendant la nuit à température ambiante avant d’imaginer les échantillons en scannant la microscopie électronique à une tension d’accélération de cinq kilovolts, à l’aide d’un micro scanner à rayons X.Pour l’analyse cytométrique de flux des échantillons de sang. Transférez 100 microlitres de sang de chaque échantillon dans chacun des neuf tubes FACS de cinq millilitres et fixez les échantillons avec l’ajout de 100 microlitres de formaldéhyde de 4 % par tube pendant 15 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. Après lavage, suspendez chaque granulé dans un millilitre de tampon de lyse de globule rouge par tube, pendant une incubation de cinq minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière.À la fin de l’incubation, laver les échantillons par centrifugation dans un millilitre de PBS par tube et placer les échantillons sans leurs surnatants sur la glace. Pour préparer une seule tache perles de compensation ajouter quatre gouttes de perles positives et quatre gouttes de perles négatives à des volumes individuels d’un millilitre de tampon FACS, et vortex les solutions pour obtenir des suspensions de perles homogènes. Ajouter 100 microlitres de chaque solution à chacun des tubes FACS de quatre ou cinq millilitres étiquetés comme indiqué et laver les perles avec un millilitre de tampon FACS par tube.Ajouter ensuite 100 microlitres du cocktail d’anticorps vortex approprié à chaque expérimental et fluorescence moins un tube avec mélange doux. Pendant 30 minutes d’incubation à température ambiante, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, lavez les échantillons avec un millilitre de tampon FACS frais par échantillon et réutilisez les granulés dans 250 microlitres de tampon FACS par tube.Avant d’analyser les perles sur les échantillons de cellules par cytométrie d’écoulement, selon les protocoles standard. Les distributions de cellules sanguines peuvent être visualisées sur toute la surface de deux bloops épissés par micro CT et la numérisation de l’imagerie au microscope électronique alors qu’aucun caillot n’est observé en boucle fermée sans lacunes. L’analyse du nombre entier de cellules sanguines, ne montre pas de différences significatives dans les nombres d’érythrocytes entre l’une des conditions testées, le nombre de plaquettes et de leucocytes cependant, sont considérablement réduits dans le groupe de boucle de latex et les nombres libres d’hémoglobine sont considérablement augmentés, indiquant une biocompatibilité très pauvre du latex.Tandis que tous les dispositifs vasculaires examinés induisent une activation accrue du système de coagulation et du composant de compliment. Les boucles de PVC enduites d’héparine présentent une tendance à la diminution des niveaux des deux types d’activations par rapport aux boucles en PVC recouvertes de polymère. Les boucles de latex présentent les niveaux les plus élevés d’élastase TNF IL-6 et PMN, mettant en évidence l’activation puissante des leucocytes par latex.Les plaquettes positives CD41 récupérées dans les tubes de latex présentent une intensité médiane de fluorescence excessivement élevée pour le CD62P, tandis que l’expression intégrée est considérablement réduite sur les granulocytes et les lymphocytes. D’intérêt, les niveaux intégraux sont plus élevés dans les monocytes des tubes de latex, suggérant des interactions activées de plaquette de monocyte. En effet, la coloration des agrégats de plaquettes monocytes révèle une tendance accrue à l’agrégation dans les boucles en latex et en stent.Malgré la fréquence réduite des monocytes dans les boucles de latex. Pour éviter l’activation intrinsèque des composants sanguins, il est important d’assurer une fermeture de boucle appropriée et de manipuler le sang avec soin. Ainsi, à la suite de cette procédure, il est possible d’analyser l’interaction entre les protéines allogéniques ou TRUCKs et les composants sanguins qui sont utilisés dans l’inflammation ou la recherche pharmaceutique.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Recherche

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