Name: an in vitro hemodynamic loop model to investigate the hemocytocompatibility and host cell activation of vascular medical devices
Uploaded: 2020-08-21T13:00:00
Duration: 8 min 44 s
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저자들은 엘레나 덴크스 씨의 기술 지원에 감사드립니다.

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펀더 [에보 쿤즈 인더스트리 디자인, 임 덴텔 17, 72639 니우펜, 독일]은 이 원고 [맥스 바커]의 저자에게 소모품 및 출판 수수료의 형태로 재정 지원을 제공했다. 펀더는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 추가적인 역할을 하지 않았습니다.

본 연구는 시험관 내 혈역학 루프 모델이 ISO 10993-4 표준에 따라 의료 기기의 체외 혈액 호환성을 테스트하는 신뢰할 수있는 방법을 제공하는 것으로 나타났습니다.
프로토콜의 중요한 단계는 혈액의 도면과 혈액으로 관을 채우는 포함, 어디 과도한 진공 또는 동요 처리 절차에 의해 활성화에서 혈액 구성 요소를 방지하기 위해 피해야한다. 더욱이, 플라즈마 샘플을 즉시 동결하고 해동 후 얼음에 보관하는 것이 매우 중요하며, 보완 및 응고 시스템 활성화는 샘플을 실온상온에 오래 유지함으로써 변조될 수 있기 때문에.
이 모델은 다른 시험관 내 모델과 비교할 때 장점과 단점을 모두 가지고 있기 때문에 실험을 설계하는 동안 여러 가지 요소를 고려해야합니다.
첫째, 루프는 다양한 실험 설정에 맞게 길이와 직경이 다양할 수 있습니다. 설정이 다양한 내부 직경의 대조 튜브를 포함하는 경우, 직경의 차이가 다른 전단 힘을 초래할 것이라는 점을 명심하여 응고 및 보완 캐스케이드7에영향을 미칩니다. 둘째, 이 실험에서 회전 속도가 30rpm으로 설정되었습니다. 이것은 인간 관상 동맥 우회 접목 25에 있는 혈류 속도에 필적하는 대략25cm/s의 혈류귀 귀착될 것입니다. 루프의 회전에 의해 생성되는 균주 속도는 세포 및 세포 없는 단백질을 포함한 혈액 성분의 생화학적 폭포를 시작하는 주요 파라미터입니다. 그러나 혈액은 비 뉴턴 유체이기 때문에, 균주 율은 또한 루프10에닫힌 튜브의 길이각각, 튜브 곡률에 의해 영향을 받을 것이다. 회전 속도 또는 루프 크기가 변경될 때마다 스트레인 속도와 회전 속도 간의 상관 관계가 선형이 아니라는 점을 고려해야 합니다. 회전 속도와 균주 속도 사이의 상관 관계는 오늘까지 충분히 검사되지 않으며 이러한 특정 매개 변수(10,26,27)를조사하기 위해 추가 연구가 필요합니다. 그러나, 라미나르 경계층을 위한 모델을 기반으로, 주어진 튜브 직경 5mm 및 25cm/s의 회전 속도, 벽 전단 응력 (WSS)의 대략적인 추정은 혈액 밀도가 1060 kg * m -3로 추정되고 기네티컬 점도가 0.0025 파스칼 * 28로 설정될 때 튜브의 벽에 1,00-0,01mm의 거리에 대해2.20-22.00파스칼 사이의 값을 나타냅니다. 흥미롭게도, 또한 인간 관상 동맥의 곡률에서 유동 역학의 보다 상세한 계산 분석은혈액(30)의속도, 밀도 및 점도에 대한 대략 비교 가능한 파라미터에서 11.33에서 16.77 파스칼에 이르는 WSS 값을 보여주었다.
이러한 제한 외에도 제시된 루프 모델은 인간 혈관 시스템의 내래 혈압 비율을 모방하지 않는 압력이 적은 시스템입니다.
다음 중요한 제한은 혈액이 루프 내부의 공기와 접촉하여 추가 간섭을 가져온다는 것입니다. 이러한 혈액 공기 접촉은 튜브의 가스 투과성과 혈액으로 채우는 동안 루프 내부의 공기 의 유지를 포함하는 두 가지 매개 변수에 의해 영향을 미칩니다. 모든 튜브 물질은 튜브 내부의 가스 농도에 상당한 변화를 초래할 수있는 특정 가스 투과성을 가지고 있습니다. 일부 저자들은 혈액 성분의 활성화에 대한 가스 투과성의 결과 효과가 불분명한31로남아 있다고 명시하고 있지만, 혈액 응고제의 기능은 pH-shift에 매우 민감하며, 이는CO2 확산32,33,34로인해 발생할 수 있다. 여기에서, 우리는 초보적인 혈액 관류의 임상 시나리오에 필적하는 실내 공기 조건하에서 혈액 관의 생체 적합성을 시험했습니다. 제시된 모델의 향후 개선을 위해CO2 인큐베이터에서 전체 모델의 배양및 인큐베이션 전후의 혈액 pH 유효성 검사를 수행하는 것이 이 모델을 더욱 표준화하는 데 유용할 수 있다.
또한, 루프 내부의 혈액-공기 계면은 혈장 단백질과 혈중 분획의 활성화로 이어질 수있다(35,36). 튜브 내부의 공기가 없는 롤러 펌프 구동 장치는 혈액-공기 인터페이스의 문제를 피할 수 있지만, 여기에 제시된 루프 모델에 비해 헤모글로빈의 상당한 높은 수준으로 혈액 세포에 손상을 유도하고, 혈장의 헤모글로빈은 ELISA16에서테스트된 유리사의 감도를 방해할 수 있다. 이 연구에서는 헤파린 코팅 PVC 튜브와 같은 생체 적합성 물질을 사용하는 동안 루프 모델 자체의 용혈 효과가 최소화된 것으로 나타났습니다. 따라서, 모델은, 한편으로는, 펌프 구동 모델에 비해 과도한 세포 손상을 일으키지 않고, 한편으로 는 혈액 공기 접촉으로 인한 혈장 단백질을 유도한다. 참고로, 반 오베렌 등은루프(16)내부의 공기를 피하는 볼 밸브 기반 루프 모델을 개발했다. 본 제시된 루프 모델에 대한 이러한 유망한 대안은 혈액-공기 인터페이스의 문제를 극복할 수 있지만, 여기에 제시된 모델에 비해, 혈소판 접착력은 볼 밸브 기반 루프 모델에 대해 여전히 높다.
정적 제어와 관련하여 유리 자체가 응고시스템(37)의강력한 활성제로 나타났다는 점에 유의해야 합니다. 그러나, 제시된 설정에서, 유리 비커(static control)에서의 인큐베이션은 혈액을 끌어낸 후 기준선 수준에 비해 응고 시스템의 과도한 숙주 세포 활성화 또는 활성화로 이어지지 않았다. 결론적으로, 정적 제어가 높은 수준의 활성화를 표시하는 경우 폴리 프로필렌 튜브와 같은 용도로 사용하는 것이 유용할 수 있습니다.
루프 기반이든 펌프 구동 모델이든 관계없이, 이러한 체외 모델은 주로 이상적인 혈액 접촉 표면인 온신구에 의해 주로 기여하는 본격적인 생물학적 상호 작용이 완전히 결여되어 있습니다. 이 문제의 근거는 스텐트와 같은 의료 기기가 시험될 때, 활성화 및 혈장 단백질의 관점에서, 내피 성분과의 상호 작용 중에 다른 결과를 부여할 수 있을 때 더 분명합니다. 이것은 순환 시스템을 모방하는 시험관 내 시스템에서 논의된 모든 것의 주요 단점이라고 선언합니다. 따라서,이 문제를 극복하기 위해, 완전히 내피로 덮여 새로운 미세 유체 시스템은 엄청난 관심을 얻고있다, 그러나 그럼에도 불구하고 여기에 제시 루프 모델에 비해, 그들은 여전히 작은 혈액 볼륨과 최소 유량을 수용제한38,39
따라서, 우리는 챈들러 루프 모델이 심혈관 연구 분야에서 혈관 의료 기기의 혈액 생체 적합성에 대한 표준화된 테스트를 수행하기위한 견고한 모델로 남아 있다고 결론을 내립니다.

의료 기기의 혈우호환성 테스트는 외피 막 산소화를 위한 혈관 스텐또는 관류관과 같은 새로운 장치의 개발에 중요한 단계입니다. 오늘날까지 동물 모델은 인간에서 구현되기 전에 의료 기기 를 테스트하는 절차를 마무리하는 표준 도구로 간주됩니다. 따라서동물에 대한 조사를 최소화하는 데 도움이 되는 체외 모델의 대안을 찾아야 합니다. 이 연구에서, 우리는, 따라서, 체외 혈역학 루프 모델의 소형을 탐구했다. 이 제시된 방법의 목표는 ISO 10993-4 표준에 따라 의료 기기의 체외 혈액 호환성을 테스트하는 것이다.
ISO 10993-4 표준은 혈액 표본1에서조사할 임상 파라미터의 표준화된 세트를 설명합니다. 간단히, 이들은 혈전증 (혈소판 응집 및 개수), 응고 (fibrinopeptide A, FPA), 혈액 학적 분석 (전혈 세포 수), 혈청 지수 (무료 혈장 헤모글로빈) 및 보완 시스템 (말기 보완 복합, sC5b9)이다. 그러나, 호중구 다형성 엘라스타제(PMN), 인터류키 6(IL-6) 및 종양 괴사 인자-알파(TNF)와 같은 추가 마커는 백혈구의 활성화 상태를 반영하는 측정을 위해서도 고려될 수 있다. 혈장에 존재하는 순환 세포 무료 단백질을 결정하고 정량화하기 위해, 샌드위치 효소 연결 면역조벤트 분석법(ELISA)은 종래의 가장 신뢰할 수 있는 방법2,3을나타낸다. 마찬가지로, 숙주 세포의 표현형 및 활성화 상태(예를 들어, 백혈구)는 단일 세포 현탁액 기반 판독을 제공하는 유혈 세포 측정(FACS)에 의해 분자의 세포 표면 발현을 검출함으로써 정량화될 수 있으며, 여기서 형광표시 특정 항체가 표적 세포 표면분자에결합된다. 스캐닝 전자 현미경 검사법(SEM)은 또한 ISO 10993-4 표준1에의해 테스트된 물질상 혈전 형성을 결정하는 것이 좋습니다. 이 방법은 X선 미세토모그래피(μCT)로 보완될 수 있으며, 3D 렌더링 된 이미지5에서혈전 의 두께, 크기 및 국소화와 같은 혈전의 구조적 분석을 수행할 수 있습니다.
체외 혈역학 모델을 사용하는 뒤에 근거는 혈소판과 같은 혈액 성분의 기본적인 생리적 역학을 이해하여 최고의 성능과 호환 의료 장치를 선별하는 것입니다, 이는 1 차 혈전 또는 백혈구및 혈관 장치의 다른 유형과의 상호 작용에 관여하는. 이러한 체외 시스템은 동물 연구의 필요성을 줄이기 때문에 매우 요구됩니다.
여기에 제시된 루프 모델은 이러한 요구를 충족시다. 이 모델은 1958년 A.B 챈들러가 혈액 혈전 생산을 위해 처음 설명되었으며, 따라서 챈들러 루프 모델6이라고도합니다. 지금까지, 본모델은 의료기기7,8,9,10,11,12,13,14의혈액 생체 적합성을 조사하기 위해 일련의 실험 및 수정에 사용되어 왔다. 그것은 부분적으로 혈액으로 채워지고 재 closable 루프로 형성되는 폴리머 튜브로 구성되어 있습니다. 이 루프는 온도 조절 수조에서 회전하여 출혈성 효과로 혈관 유동 조건을 시뮬레이션합니다. 고분자 튜브 내부의 혈류를 유도하기 위해 루프 내부의 기계적 볼 밸브를 사용하는 펌프 구동 모델 또는 모델과 같은 대체 방법은 이미15,16으로설명되었다. 그러나, 여기서 제시된 방법의 전반적인 장점은 혈액 세포및 단백질에 적용되는 기계적 힘이 낮고, 용혈을 피하고, 혈액과 커넥터 사이에 접촉이 없다는 것입니다, 이는 아마도 혈류 난류와 혈액 성분의 활성화로 이어질 수 있다는 것이다. 루프 내부의 주요 활성화 요소는 테스트 재료 자체와 내부에 갇혀있는 공기입니다. 이는 혈액-공기 인터페이스가 단백질데니션(17)으로이어질 수 있더라도 측정 오류의 원인을 최소화하고 높은 재현성을 제공하는 데 도움이 된다. 또한 길이 나 크기 제한없이 튜브 재료와 스텐트 직경의 종류를 조사하여 서로 다른 길이와 내지름의 튜브를 사용할 수 있습니다. 더욱이, 부정확한 루프 폐쇄에 대한 호스트 혈전성 및 코팅되지 않은 튜브 표면에 대한 노출도 조사할 수 있다. 시험관 내 혈역학 루프 모델의 다른 유사한 의료 응용은 또한 1차 임상 시험 전에 전임상 개발 또는 개별 약물 안전 스크리닝 동안 면역치료제(drug)와 혈액 성분 간의 상호작용을 연구하거나, 추가실험18,19,20에사용될 수 있는 혈전 물질의 생성을 위해 사용될 수 있다는 것이다.
이 연구는 관류 관 및 /또는 스텐트의 혈전성을 테스트하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 여기서, 코팅되지 않은 PVC 튜브(hepPVC: 헤파린 코팅, polyPVC: 생리활성 폴리머코팅)의 비교. 혈소판의 활성화를 낮췄지만, 응고 시스템(FPA)의 높은 활성화는 코팅되지 않은 튜브에 비해 코팅된 두 튜브 모두에 대해 발견되었다. 여기에 사용되는 hepPVC 튜브는 혈전저항성(21)을 만들기 위해 상주 바인딩 된 헤파린으로 변형되었으며 이미 다른 매개 변수(22)를최적화하고 특성화하기 위해 루프 모델에 사용되었습니다. 이 연구에서 사용되는 polyPVC 튜브는 초보성 혈액 관류의 임상 설정에 사용되는 시판되는 튜브이며혈전성(23)을줄이기 위해 헤파린 폴리머로 코팅된다. 때로는 임상 응용 분야에서도 코팅되지 않은 PVC 튜브가 사용됩니다. 따라서, 우리는 혈소판의 과도한 활성화를 보여 긍정적 인 대조군으로 라텍스 튜브를 포함, 응고 시스템, IL-6, TNF 및 PMN 엘라스타제와 같은 수용성 인자. 부정확한 루프 폐쇄를 시뮬레이션했을 때 혈전 형성이 발견되었습니다. 이것은 기준조건에 비교된 응고 및 보완 시스템뿐만 아니라 백혈구 및 혈소판의 활성화로 이어졌다. 더욱이, 여기서 사용되는 스텐트 물질(베어 메탈 니티놀 스텐트, 탄소함침 확장 폴리테트라플루오로로틸렌으로 덮여 있음)에 대한 혈액 접촉은 PMN 엘라스타제의 관점에서 더 높은 혈소판 및 백혈구 활성화로 이어졌다. 전반적으로, 제시된 모형은 적혈구 (RBC) 혈류가 명백한 라텍스 관을 제외하고, 기준선 또는 정적 조건에 비교되었기 때문에 시험된 혈관 장치 중 임의의 혈류를 유도하지 않았다. 더욱이, 이 관혈관은 화상 진찰또는 결투에 의해 검토될 수 있습니다. 조직학적 평가가 가능할 지 모르지만, 우리는 주로 ELISA및 유동 세포측정에 초점을 맞추어 이러한 실험을 수행하고 이를 통해 많은 실험실에 대한 본선 모델을 기반으로 실험을 수행할 수 있습니다. 따라서, 이러한 방법은 ISO 10993-4 표준의 권고에 따라 혈관 의료기기의 혈액 생체 적합성을 시험하는 실현 가능한 방법을 나타낸다. 더욱이, 이 방법은 혈액과 물질 간의 상호 작용이 유동 조건하에서 시험되어야 할 때마다 사용될 수 있고, 생체 내 조건을 모방할 수 있다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 ml tube, K3 EDTA</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>32332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td>Becton Dickinson BioSciences</td>
			<td>552843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>368512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa II cell analyzer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>647465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Citrate Tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>369714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer one-use holder</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>364815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Safety-Lok butterfly canula 21 G</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker glass ROTILABO short 10 ml</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>X686.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker glass ROTILABO short 50 ml</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>X688.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-human CD162 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-human CD41 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge ROTINA 420 | 420 R</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td>4701 | 4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHC Super modified, 5mm PVC tubing</td>
			<td>Corline Sweden</td>
			<td>1807-148</td>
			<td>Referred to as hepPVC tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular Precision Cutter</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 007-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Closing Unit (complete with tension bands)</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 008-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric tape Scotch Super 33+</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MMMA331933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA MAX Deluxe Set Human IL-6</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>430504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA MAX Deluxe Set Human TNF-a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>430204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,1 &#8211; 2,5 &#181;L, gray</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,5 &#8211; 10 &#181;L, gray</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 10 &#8211; 100 &#181;L, yellow</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 100 &#8211; 1,000 &#181;L, blue</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 20 &#8211; 200 &#181;L, yellow</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. sample bag, 0,5 &#8211; 5 mL, violet</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes polystyrene 5.0 ml round bottom</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum Gold Plus</td>
			<td>Bio-Sell</td>
			<td>FBS.GP.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>367116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluency plus stent 13.5 x 60 mm</td>
			<td>Angiomed GmbH &#38; Co</td>
			<td>FVM14060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free Hemoglobin fHb Reagent</td>
			<td>Bioanalytics GmbH</td>
			<td>004001-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS Tablets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves Vasco Nitril white L</td>
			<td>B. Braun Deutschland GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td>9208437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves Vasco Nitril white M</td>
			<td>B. Braun Deutschland GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td>9208429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25% aequous solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G6257-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin, 25.000 IE in 5 ml</td>
			<td>Rotexmedica, Trittau, Germany</td>
			<td>PZN 3862340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fibrinopeptide A (FPA) ELISA Kit</td>
			<td>H&#246;lzel Diagnostika</td>
			<td>abx253234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kodan tincture forte colourless</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td>104012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex tube, ID 5 mm</td>
			<td>Laborhandel24 GmbH</td>
			<td>305 0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loop Stand</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 009-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medimex venous tourniquet classic</td>
			<td>ROESER Medical GmbH</td>
			<td>310005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite 200 Pro M Plex</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>TEC006418I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate shaker PMS-1000i</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Metric non-phthalate PVC tubing, ID 5 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NALG8703-0508</td>
			<td>Referred to as PVC tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NexTemp (Standard) Single-Use Clinical Thermometer</td>
			<td>Medical Indicators</td>
			<td>2112-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp ELISA Plates, uncoated</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10256970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD16Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD62P (P-Selectin) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller, pipetus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips epT.I.P.S. 0.2 - 5 ml</td>
			<td>OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>5186480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips epT.I.P.S. standard 0,1 - 10&#181;l</td>
			<td>Th. Geyer GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>9409410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips epT.I.P.S. standard 2 - 200&#181;l</td>
			<td>Th. Geyer GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>0030 000.870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips epT.I.P.S. standard 50 - 1000&#181;l blue</td>
			<td>Th. Geyer GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>0030 000.919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMN (Neutrophil) Elastase Human ELISA Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BMS269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe stand ROTILABO combi</td>
			<td>CARL ROTH</td>
			<td>K082.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for rotation unit (12 slots 3/8 &#39;&#39; with variable slot width)</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 011-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10X)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-1184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotation Unit</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 010-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock micro test tubes 0.5 ml</td>
			<td>OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>5409320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock micro test tubes 1.5 ml</td>
			<td>OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>5409331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sc5b9 Human ELISA KIT</td>
			<td>TECOmedicalGroup</td>
			<td>A029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel no 10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9999403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope XL30 ESEM-FEG</td>
			<td>Philips</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 1000 ml, GL 45</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>X715.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 500 ml, GL 45</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>X714.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro cuvette 1.6 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67.746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10.0 ml</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 25.0 ml</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 5.0 ml</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tube, inner diameter 8 mm, outer diameter 12 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BURK8803-0812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprout mini centrifuge</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>552034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Solution for TMB Substrate</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>77316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swabs, sterile</td>
			<td>Fuhrmann GmbH</td>
			<td>32055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 ml</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled water basin</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 020-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butanol, 99.5%, extra pure, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10000730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB Substrate Set</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>421101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trillium PVC tube, 5 mm ID</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>161100107100103</td>
			<td>Referred to as polyPVC tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4974,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spektrometer Lambda 2</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>33539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vornado Mini Vortexer</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>55BV101-B-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XN-3000 workstation blood analyzer</td>
			<td>Sysmex Europe</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-CT Phoenix Nanotom S</td>
			<td>GE Sensing &#38; Inspection, Wunstorf, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro hemodynamic loop model to investigate the hemocytocompatibility and host cell activation of vascular medical devices

이 연구에서는, 폴리염화비닐(PVC)으로 만들어진 5mm의 내경을 가진 튜브의 혈투호환성은 코팅되지 않은 PVC 튜브, 라텍스 튜브 및 PVC 튜브 내부에 배치된 내트라바 내 적용을 위한 스텐트와 비교하였다. 혈역학평가는 ISO 표준 10993-4에서 권장하는 체외 혈역학 루프 모델을 사용하여 수행되었다. 튜브는 동일한 길이의 세그먼트로 절단하고 스플라이스의 틈새를 피하는 루프를 형성하기 위해 폐쇄된 다음 인간의 피로 채워져 3시간 동안 37°C의 수조에서 회전하였다. 그 후, 관 내부의 혈액은 전혈세포 수, 혈류(프리 플라즈마 헤모글로빈), 보완 시스템(sC5b-9), 응고 시스템(fibrinopeptide A), 및 백혈구 활성화(다형성 엘라스타제, 종양 괴사 인자 및 인터류크인-6)의 분석을 위해 수집되었다. 숙주 세포 활성화는 혈소판 활성화, 백혈구 인테그린 상태 및 유동 세포측정을 이용한 단핵혈소판 응재를 위해 결정되었다. 부정확한 루프 폐쇄의 효과는 엑스레이 미세토포그래피 및 주사 전자 현미경으로 검사되었으며, 이는 스플라이스에서 혈전 형성을 보였다. 라텍스 튜브는 혈액의 플라즈마 및 세포 성분 모두의 가장 강력한 활성화를 보여주었으며, 이는 혈우호환성이 좋지 않았으며 스텐트 그룹과 코팅되지 않은 PVC 튜브가 뒤따랐습니다. 코팅된 PVC 튜브는 혈소판 활성화 상태가 현저한 감소를 나타내지 않았지만 코팅되지 않은 PVC 튜브에 비해 보완 및 응고 계단식으로 증가했습니다. 루프 모델 자체는 세포 또는 수용성 인자의 활성화로 이어지지 않았고, 용해 수준이 낮았다. 따라서, 제시된 체외 혈역학 루프 모델은 기계적 힘에 의한 혈액 성분의 과도한 활성화를 방지하고 기증자 혈액과 혈관 의료 기기 간의 체외 상호 작용을 조사하는 방법으로 작용한다.

FACS 플롯을 제외한 모든 데이터는 통계 소프트웨어로 분석되었습니다. FACS 플롯은 유동 세포측정 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다.
전혈구 수의 분석은 모든 시험된조건(도 2)의적혈구에 대하여 어떤 유의한 차이를 보여주지 않았다. 그러나, 혈소판및 백혈구는 라텍스 단에서 급격하게 감소되어 라텍스의 생체 적합성이 매우 좋지 함을 나타냅니다. 이는 라텍스 군에서 자유 헤모글로빈의 수치가 증가하여 밑줄이 더 강조되어 라텍스 군을 제외하고는 다른 혈관 장치 나 조건 중 어느 것도 광범위한 용혈(도2)을초래하지 않는다는 사실을 나타낸다. 또한, 코팅된 PVC 튜브, 폴리PVC 및 hepPVC뿐만 아니라 테스트된 스텐트는 혈소판 및 백혈구 손실을 통해 혈전증으로 이어지지 않았으며, 라텍스는 가장 높은 혈소판과 백혈구 손실을 나타내었으며, 이어서 코팅되지 않은 PVC 튜브가 감소추세를 보였다.
모든 테스트된 혈관 장치는 응고 시스템(FPA) 및 보완 성분(sC5b-9)의 활성화가 증가했지만, hepPVC 루프는 특별히 폴리PVC루프(그림 3)에비해 FPA 및 sC5b-9의 감소된 수준에 대한 추세를 나타냈다. 흥미롭게도, 코팅되지 않은 PVC 및 갭 루프는 통계적 유의수준에 도달하지는 않았지만 폴리PVC에 비해 FPA 수준이 낮았습니다. 그럼에도 불구하고 라텍스 루프는 기준선 및 정적 조건에 비해 FPA 의 수치가 크게 증가했습니다.
전혈세포 수에 따라 라텍스 루프는TNF, IL-6 및 PMN 엘라스타제(도4)의최고 수준을 나타내었으며, TNF 및 IL-6(도 4A,B)의관점에서 나머지 그룹과 비교했을 때 통계적 유의수준에 도달하는 반면 PMN 엘라스테(그림4C)의관점에서 정적 및 기준 조건에 도달하였다. 이러한 결과는 라텍스에 의한 백혈구의 강력한 활성화를 나타낸다. 활성화 마커의 기준선 수준은 항상 혈액의 적절한 분리를 나타내는 정적 조건에 필적했다.
흥미롭게도, 갭 유도 루프에 대한 혈소판 및 백혈구 수는 응고 시스템(FPA)과 백혈구(PMN 엘라스타제)의 적당한 활성화로 약간 감소되었지만, 부적절한 루프 폐쇄는 코팅되지 않은 거친 절단 표면에 대한 흐류 난기류및 혈액 접촉으로 인해 매크로로 볼 수 있는clot(도1)로이어졌다. 전체 스플라이스 표면에 대한 혈전 및 분포는 μCT 및 SEM 이미지로 분명하게 드러났으며, 루프가 외부 클로징 장치로 닫히면 혈전이 발견되지 않았으며 루프 엔딩(그림5).
혈소판 특이적 마커, CD41 및 혈소판 활성화 마커 CD62P로 염색된 숙주 혈액 세포의 흐름 세포 측정 분석은 도 6A, B에도시된다. 여기서, 라텍스 튜브는 혈액 혈소판에 CD62P에 대한 매우 높은 중앙위형 형광 강도(MFI)를 나타내고, 그 다음에는 스텐트가 뒤따랐고, 헤파린 코팅 폴리PVC 튜브는 폴리PVC 튜브의 항혈전 특성을 나타내는 혈소판의 최소한의 활성화를 나타냈다. 더욱이, 백혈구는 CD45 및 SSC(측면 산란) 기반의 과립(i) 과립세포에 기초하여 분류되었다; (ii) 단핵구 및 (iii) 림프구(도7)와CD162 +인테그린의 발현은 혈소판(24)에서 CD62P와 상호작용하는 것으로 알려진백혈구의 각 하위 집단에서 검출되었다. 라텍스 루프의 과립구와 림프구에서 통합 된 표현이 크게 감소된 것으로 나타났습니다. 이 결과는 라텍스 루프에서 백혈구의 총 주파수의 낮은 수준에 부합하였다(그림2). 일반적으로, 통합 수준은 과립구 및 림프구에 비해 단핵구 사이에서 더 높았으며, 활성 혈소판과의 단일세포 상호 작용가능성을 나타낸다. 이와 관련하여, 단핵혈소혈소체는 또한 CD14(단화 마커로) 및 CD41(혈소판 마커로서)로 혈액세포를 염색하고 궁극적으로 이중 양성 세포 즉 CD14+CD41+MPA(도8)를식별하여 평가하였다. 여기서, 우리는 스텐트 그룹이 MPA에서 CD41 발현의 가장 높은 수준을 나타내고, 라텍스 그룹이 그 뒤를 이어, 단핵구의 빈도감소에도 불구하고 MPA를 형성하는 경향이 증가했음을 나타내는 것으로 나타났습니다(&1%) 라텍스 루프에서.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig01.jpg"> 그림 1: 체외 혈역학 루프 모델 및 수정 사항의 개요입니다. (A)외부 루프 닫기 시스템으로 갭 실험을 위한 루프, 스플라이스에 틈이 남지 않는다. (B)폴리PVC 코팅 PVC 튜브 및 내부 스텐츠로 만든 루프 (화살표). (C)라텍스 튜브로 만든 루프. (D)외부 루프 닫기 시스템이 없는 갭 실험을 위한 루프가 튜브 엔딩(arrow)사이의 간격을 두고 있다. (E)루프는 수조 내부의 루프 요람에 배치하고 피로 가득합니다. (F)회전 후 스플라이스(arrow)에서 간격을 형성한 혈전. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig02.jpg"> 그림 2: 혈액 세포 수 및 혈장 헤모글로빈에 대한 결과. (A)적혈구 수. (B)혈소판 수. (F)백혈구 수. (D)프리 플라즈마 헤모글로빈. 결과는 라텍스의 가난한 생체 적합성을 나타내며 과도한 용혈을 초래합니다. 데이터는 평균 값으로 표시됩니다. 오류 막대는 SEM. n=1을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig03.jpg"> 그림 3: 응고 및 보완 시스템의 활성화를 위한 결과. (A)응고 시스템 활성화, 피브리노펩타이드 A(FPA)(B)보완 시스템 활성화의 수준에 의해 측정된, sC5b-9의 수준에 의해 측정. 라텍스 튜브는 FPA의 상당한 높은 수준을 불러 일으켰지만, 모든 테스트 된 재료에 대한 보완 활성화가 강했습니다. 데이터는 평균 값으로 표시되며 오류 막대는 SEM을 나타냅니다. * p&0.05, n=1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig04.jpg"> 그림 4: 백혈구 활성화 마커. (A)종양 괴사 인자 알파(TNF). (B)인터류빈 6 (IL-6)(C)PMN 엘라스테아제. 결과는 분석된 마커의 높은 수준으로 인해 백혈구의 활성화가 증가하고, 스텐트 루프가 뒤따랐으며, 이는 PMN 엘라스타제에 대한 수치가 증가했지만 TNF 또는 IL-6은 아니라는 것을 나타낸다. 데이터는 평균 값으로 표시되며 오류 막대는 SEM을 나타냅니다. * p&0.5; **p&0.01, n=1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig05.jpg"> 그림 5: 루프의 스플라이스의 이미징. (A)부적절한 폐쇄(gap)를 가진 루프의 컴퓨터 단층 촬영(μCT)μ. 빨간색 영역은 혈전 물질을 나타냅니다. (B)튜브의 발광 측 렌더링. 직사각형 선택은 전자 현미경 검사(SEM)(C)를스캔하는 영역을 나타낸다. (D)외부 루프 닫기 장치와 스플라이스에서 간격이 없는 루프의 μCT 및(E)발광 표면의 렌더링 및 뷰. 혈전 물질은 발견되지 않았습니다. (F)직사각형 선택의 SEM 이미지(E). 절단 표면에서 혈전 물질이 발견되지 않았습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig06.jpg"> 그림 6: 혈소판 활성화를 위한 FACS 플롯(CD62P). (A)혈액 CD41+ 혈소판을 나타내는 대표적인 FACS 플롯(기본 상태). (b)정전기 RT 및 기준조건에 비해 다양한 유형의 혈관 장치의 평균 형광 강도(MFI)에 의해 반사되는 혈소판 활성화 상태를 나타내는 그래프. 데이터 막대는 단일 측정의 데이터를 표시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig07.jpg"> 그림 7: 백혈구 에스테그린(CD162)에 대한 FACS 플롯. (A)대표적인 FACS 플롯(기본 상태)은 정적 및 기준 조건에 비해 다양한 유형의 혈관 장치의 백혈구 CD162 +인테그린 평균 형광 강도(MFI)를 나타내는 혈액 CD45+ 백혈구 및 하위 집단(B) 그래프를 나타낸다. 데이터 막대는 단일 측정의 데이터를 표시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig08.jpg"> 그림 8: 혈소판 단화 골재에 대한 FACS 플롯(CD41/CD14). (A)대표적인 FACS 플롯(기본 상태)은 혈액 단핵구(CD45 +/CD14+),혈소판(CD41+)및 단핵혈소 집합체(CD41+/CD14+)(B)CD41+평균 형광 강도(MFI)를 나타내는 다양한 혈관 기재에 대한 단극식 및 비교된 단정체 조건에 대한 변성 강도(MFI)를 나타내는 게이팅을 나타내는 대표적인 FACS 플롯(기본 상태)을 비교하였다. 데이터 막대는 단일 측정의 데이터를 표시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

여기에 제시된 시험관 내 혈역학 루프 모델에 대한 표준화된 프로토콜이 있습니다. 이 모델은 ISO(국제표준화기구) 표준 10993-4에 따라 관류 관 또는 혈관 스텐트의 혈중 호환성을 테스트할 수 있습니다.

혈관 의료 기기의 혈혈성 호환성 및 호스트 세포 활성화를 조사하는 시험관 헤모역학 루프 모델

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive ...

이 혈역학 루프 모델을 사용하면 연구원이 관류 튜브 또는 스텐트와 같은 혈관 장치의 체외 헤모 호환성을 테스트 할 수 있습니다. 표준화된 조건하에서. 따라서이 기술은 기계적 힘에 의해 혈액에 어떤 영향을 미치지 않으므로 혈액 성분의 본질적 활성화에 의해 오해의 소지가있는 결과를 피합니다.실험을 시도하기 전에 적절한 기계적 부품 조립, 완벽한 루프 폐쇄 시스템 구성 및 루프에 느린 혈액 적재를 연습해야합니다. 루프 어셈블리를 준비하려면 튜브 커터를 사용하여 평평한 표면에 250센티미터 길이, 5밀리미터 의 내경 직경 조각을 절단합니다. 그리고 튜브의 개방 엔딩을 조사 튜브의 외경에 피트하는 실리콘 튜브의 짧은 조각으로 연결하여 루프 모양을 생성합니다.텐션 밴드 커넥터의 잠금 나사를 조심스럽게 조이고 닫는 힘을 조정하여 두 굽힘 사이에 간격이 남지 않도록 합니다. 잠금 나사가 완전히 강화되고 폴리 카보네이트 밴드의 장력이 너무 낮아두 벤딩 사이의 간격을 닫고 잠금 시스템을 열고 장력 대역의 몇 밀리미터를 자른경우. 스텐트 루프 어셈블리를 준비하려면 루프 두 개를 열고 튜브를 장력 밴드 시스템에서 꺼냅니다.그런 다음 제조업체의 지시에 따라 스텐트를 튜브 중앙에 삽입합니다. 실험에 적합한 루프 수가 생성되면 회전 장치의 루프 요람에서 루프를 확보하고, 37도 수조 의 외부및 루프 요람을 수조 내부의 회전 장치에 부착한다. 다음으로, 150 마이크로리터 또는 갓 준비된 헤파린 스톡 용액으로 채취하는 혈액 2개의 루프당 10밀리리터 주사기를 채우고 21 게이지 나비를 사용하여 주사기에 혈액을 부드럽게 수집하여 과도한 진공으로 인한 동종 분석이나 세포 활성화를 피하기 위해 주의를 기울입니다.모든 혈액이 수집되면 혈액을 유리 비커로 옮기고 5 밀리리터 세로지컬 파이펫을 사용하여 혈액과 헤파린을 부드럽게 혼합합니다. 피펫 팁이 튜브에 완전히 삽입되지 않은 균일한 용액을 획득하면 각 루프를 5 밀리리터의 혈액으로 채웁니다. 각 루프가 채워진 후 닫고 루프, 장력 밴드 및 랙이 제대로 고정되어 있는지 확인합니다.그런 다음 분당 30 회전에서 3 시간 동안 루프를 회전합니다. 회전의 끝에서 루프가 2 분 동안 랙에 서서 조심스럽게 커넥터를 열고 중복에서 개별 10 밀리리터 유리 비커로 혈액을 당기기 전에 혈액이 루프 바닥에 축적되도록합니다. 모든 혈액이 수집되면 PBS의 10 밀리리터로 각 튜브를 헹구고 메스를 사용하여 각 튜브의 끝에서 1 센티미터 샘플을 조심스럽게 잘라냅니다.샘플을 섭씨 4도에서 2%의 글루타랄데히드로 하룻밤 동안 배양하고, 실온에서 15분 동안 배양하고 1%의 오스뮴 테트로이드를 배양합니다. 오스뮴 테트산화물 배큐베이션의 끝에서, 농도 당 20 분 동안 상승 에탄올 계열에서 샘플을 탈수, 100 % 에탄올에서 30 분 탈수. 100% 에탄올 인큐베이션의 끝에서, 엑스레이 마이크로 CT 스캐너를 사용하여 5킬로볼트의 가속 전압에서 전자 현미경을 스캔하여 샘플을 이미징하기 전에 실온에서 밤새 건조시 샘플을 보자.혈액 샘플의 유동 세포 측정 분석을 위해. 각 샘플에서 100마이크로리터의 혈액을 9개의 밀리리터 FACS 튜브로 옮기고 빛으로부터 보호되는 실온에서 15분 동안 튜브당 4%의 포름알데히드100마이크로리터를 추가하여 샘플을 수정합니다. 세척 후 각 펠릿을 튜브 당 적혈구 용해 버퍼 1 밀리리터로 다시 중단하고 실온에서 5 분 동안 실내 온도에서 잠식하여 빛으로부터 보호합니다.인큐베이션의 끝에서, 튜브 당 PBS의 1 밀리리터에서 원심 분리에 의해 샘플을 세척하고 얼음에 자신의 슈퍼 나티츠없이 샘플을 배치. 단일 얼룩 보정 비즈를 준비하려면 개별 1 밀리리터 버퍼에 4 방울의 양수와 네 방울의 네 방울의 부정적인 구슬을 추가하고 균일 한 비드 서스펜션을 얻기 위한 솔루션을 소용돌이시다. 각 솔루션의 마이크로리터 100개를 표시된 대로 표지된 4밀리리터 FACS 튜브에 추가하고 튜브당 FACS 버퍼 1밀리리터로 구슬을 세척합니다.다음으로 각 실험 및 형광에 적절한 소용돌이 항체 칵테일 100 마이크로리터를 추가하여 부드러운 혼합으로 한 튜브를 빼냅니다. 실온에서 30분 동안 인큐베이션을 통해 빛으로부터 보호합니다. 인큐베이션이 끝나면 시료당 1밀리리터의 신선한 FACS 버퍼로 샘플을 세척하고 튜브당 FACS 버퍼 250마이크로리터에서 펠릿을 재보페수합니다.표준 프로토콜에 따르면 세포 측정을 유동하여 세포 샘플에 있는 구슬을 분석하기 전에. 혈액 세포 분포는 마이크로 CT에 의해 접합된 두 개의 블루프의 전체 표면에 걸쳐 시각화될 수 있고 전자 현미경 이미징을 스캐닝하는 반면 틈새없이 닫힌 루프에서 혈전이 관찰되지 않습니다. 전혈구 수의 분석은, 시험된 조건, 혈소판 및 백혈구 수 사이 적혈구 수에 있는 중요한 다름을 보여주지 않습니다, 라텍스 루프 단에서 급격하게 감소되고 자유로운 헤모글로빈 수는 극적으로 증가하여 라텍스의 생체 적합성이 매우 나쁘다는 것을 나타낸다.모든 시험된 혈관 장치는 응고 시스템 및 칭찬 구성 요소의 증가된 활성화를 유도합니다. 헤파린 코팅 PVC 루프는 폴리머 코팅, PVC 루프에 비해 두 유형의 활성화 수준이 감소하는 추세를 나타낸다. 라텍스 루프는 TNF IL-6 및 PMN 엘라스타제의 최고 수준을 나타내며 라텍스에 의한 백혈구의 강력한 활성화를 강조합니다.CD41 양혈소는 라텍스 튜브에서 회수되고 CD62P에 대한 매우 높은 중간 형광 강도를 나타내며, 통합식은 과립구및 림프구에서 크게 감소된다. 관심의, 일체 수준은 라텍스 튜브에서 단핵구에서 더 높은, 단세포 활성화 혈소판 상호 작용을 제안. 실제로 단핵혈소판 응고에 대한 염색은 라텍스 및 스텐트 루프에서 응집되는 경향이 증가합니다.라텍스 루프 내에서 단핵구의 빈도가 감소했음에도 불구하고. 본질적인 혈액 분대 활성화를 피하기 위하여는 적당한 루프 폐쇄를 확인하고 주의로 혈액을 취급하는 것이 중요합니다. 따라서 이 절차에 따라 염증 또는 제약 연구에 사용되는 동종 단백질 또는 TRUCKs 및 혈액 성분 간의 상호 작용을 분석할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

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연구

의학

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Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta ...

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The use of mouse models in experimental research is of enormous importance for the study of hepatic physiology and pathophysiological disturbances. ...

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