Name: an in vitro hemodynamic loop model to investigate the hemocytocompatibility and host cell activation of vascular medical devices
Uploaded: 2020-08-21T13:00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices at JoVE.com

Os autores agradecem à Sra. Elena Denks por sua assistência técnica.

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O funder [ebo kunze industriedesign, Im Dentel 17, 72639 Neuffen, Alemanha] forneceu um apoio financeiro na forma de consumíveis e taxas de publicação para o autor deste manuscrito [Max Wacker]. Os financiadores não apresentaram qualquer papel adicional na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou elaboração do manuscrito.

Este estudo mostrou que o modelo de loop hemodinâmico in vitro apresentado oferece um método confiável para testar a compatibilidade sanguínea in vitro de dispositivos médicos de acordo com o padrão ISO 10993-4.
As etapas críticas do protocolo incluem o extração de sangue e o preenchimento dos tubos com sangue, onde o vácuo excessivo ou agitação devem ser evitados para evitar que os componentes sanguíneos sejam ativados pelo procedimento de manuseio. Além disso, é muito importante congelar imediatamente as amostras de plasma e mantê-las no gelo após o descongelamento, pois a ativação do sistema de complementação e coagulação pode ser adulterada mantendo as amostras em temperatura ambiente por mais tempo.
Uma vez que este modelo tem méritos e deméritos quando comparados a outros modelos in vitro, vários fatores devem ser levados em conta ao projetar os experimentos.
Primeiro, os loops podem ser variados em comprimento e diâmetro para caber várias configurações experimentais. Caso a configuração inclua tubos contrastantes de diâmetros internos variados, deve-se ter em mente que as diferenças de diâmetro resultarão em diferentes forças de corte, afetando assim a coagulação e a cascata complementar7. Em segundo lugar, a velocidade de rotação foi definida para 30 rpm neste experimento. Isso resultará em um fluxo sanguíneo de aproximadamente 25 cm/s, o que é comparável à velocidade de fluxo sanguíneo nos enxertos de bypass da artéria coronária humana25. A taxa de tensão, gerada pela rotação dos loops, é o principal parâmetro que iniciará cascatas bioquímicas de componentes sanguíneos, incluindo células e proteínas livres de células. Mas como o sangue é um fluido não newtoniano, a taxa de tensão também será influenciada pela curvatura do tubo, respectivamente o comprimento dos tubos que estão fechados para loops10. Sempre que a velocidade de rotação ou o tamanho do loop é alterado, é importante considerar que a correlação entre a taxa de tensão e a velocidade de rotação não é linear. A correlação entre a velocidade de rotação e a taxa de tensão não é suficientemente examinada até hoje e estudos adicionais são necessários para investigar esses parâmetros específicos10,26,27. No entanto, com base em um modelo para a camada de limite laminar, o diâmetro dado do tubo de 5 mm e a velocidade de rotação de 25 cm/s, uma estimativa aproximada do estresse da tesoura da parede (W SSS) indicaria valores entre 2,20-22,00 pascal para uma distância de 1,00-0,01 mm à parede do tubo quando a densidade sanguínea é estimada em 1060 kg*m-3 e a viscosidade cinética é definida para 0,0025 pascal*s28,29. Curiosamente, também uma análise computacional mais detalhada da dinâmica do fluxo na curvatura das artérias coronárias humanas mostrou valores WSS variando de 11,33 a 16,77 pascal em parâmetros aproximadamente comparáveis para a velocidade, densidade e viscosidade do sangue30.
Além dessa limitação, o modelo de loop apresentado é um sistema sem pressão, que não imita as relações intravasculares de pressão arterial do sistema vascular humano.
A próxima limitação importante é que o sangue está em contato com o ar dentro dos laços, o que traz interferências adicionais. Tal contato sangue-ar é impactado por dois parâmetros, que inclui a permeabilidade gasosa dos tubos e a retenção de ar dentro dos laços enquanto os enche com sangue. Cada material do tubo possui uma certa permeabilidade de gás que pode levar a mudanças significativas nas concentrações de gás dentro dos tubos. Embora alguns autores adquiram que o efeito resultante da permeabilidade do gás na ativação de componentes sanguíneos permanece incerto31, sabe-se que a função dos coaguladores sanguíneos é altamente sensível a uma mudança de pH, que pode ser causada pela difusão de CO2 32,33,34. Aqui, testamos a biocompatibilidade dos tubos de perfusão sanguínea sob condições de ar interior, comparáveis aos cenários clínicos de perfusão sanguínea extracorpórea. Para melhorias futuras do modelo apresentado, a incubação de todo o modelo em uma incubadora de CO2 e a realização da validação do pH sanguíneo antes e depois da incubação podem ser úteis para padronizar ainda mais esse modelo.
Além disso, a interface sangue-ar dentro dos laços pode levar à ativação de proteínas plasmáticas e frações celulares do sangue35,36. Os dispositivos acionados pela bomba de rolo sem ar dentro dos tubos podem evitar a questão da interface sangue-ar, mas certamente induzem danos às células sanguíneas com níveis elevados significativos de hemoglobina em comparação com o modelo de loop aqui apresentado, e a hemoglobina no plasma pode interferir com a sensibilidade de analitos testados em ELISA16. Neste estudo, mostramos que o efeito hemolítico do modelo de loop em si permanece mínimo ao usar materiais biocompatíveis, como tubos de PVC revestidos de heparina. Assim, o modelo é, por um lado, não causar danos celulares excessivos em comparação com modelos acionados pela bomba, mas, por outro lado, induzir proteínas plasmáticas devido ao contato com o ar no sangue. Note-se que van Oeveren et al. desenvolveram um modelo de loop baseado em válvula de esfera evitando o ar dentro dos loops16. Esta alternativa promissora ao modelo de loop aqui apresentado pode superar o problema da interface sangue-ar, no entanto, em comparação com o modelo apresentado aqui, a adesão plaqueta ainda é maior para o modelo de loop baseado em válvula de esfera.
Em relação ao controle estático, nota-se que o vidro em si tem se mostrado um potente ativador do sistema coagulatório37. No entanto, na configuração apresentada, a incubação em um copo de vidro (controle estático) não levou à ativação excessiva da célula hospedeira ou ativação do sistema coagulatório em comparação com os níveis de linha de base logo após o desenho do sangue. Em conclusão, pode ser útil usar, por exemplo, tubos de polipropileno, se o controle estático mostrar altos níveis de ativação.
Independentemente de ser um modelo baseado em loop ou de bomba, esses modelos in vitro não possuem completamente as interações biológicas autênticas que são principalmente contribuídas por um endotélio intacto, que é uma superfície ideal de contato sanguíneo. A lógica por trás dessa questão é mais evidente quando um dispositivo médico como um stent está sendo testado, o que pode dar diferentes resultados, em termos de ativação e proteínas plasmáticas, durante sua interação com componentes sanguíneos na presença de endotélio. Isso declara ser uma grande desvantagem de todos os sistemas in vitro discutidos imitando o sistema circulatório. Assim, para superar essa questão, novos sistemas microfluidos que estão completamente cobertos com endotélio estão ganhando imenso interesse, mas, no entanto, em comparação com o modelo de loop apresentado aqui, eles ainda estão limitados a acomodar volumes sanguíneos menores e taxas mínimas de fluxo38,39
Assim, concluímos que o modelo Chandler Loop continua sendo um modelo robusto para a realização de testes padronizados sobre a biocompatibilidade sanguínea de dispositivos médicos vasculares no campo da pesquisa cardiovascular.

O teste de hemocompatibilidade de dispositivos médicos é um passo crucial no desenvolvimento de novos dispositivos, como stents vasculares ou tubos de perfusão para oxigenação de membrana extracorpórea. Até hoje, os modelos animais são considerados como ferramentas padrão para finalizar o procedimento de teste dos dispositivos médicos antes de sua implementação em humanos. A partir de agora, é necessário encontrar modelos in vitro alternativos que ajudem ainda mais na minimização das investigações sobre animais. Neste estudo, temos explorado, portanto, um modelo de loop hemodinâmico in vitro em miniatura. O objetivo deste método apresentado é testar a compatibilidade sanguínea in vitro dos dispositivos médicos de acordo com a norma ISO 10993-4.
O padrão ISO 10993-4 descreve conjuntos padronizados de parâmetros clínicos a serem investigados na amostra de sangue1. Resumidamente, são trombose (agregação e contagem de plaquetas), coagulação (fibrinopeptídeo A, FPA), análise hematológica (contagem completa de células sanguíneas), índice de hemolise (hemoglobina plasmática livre) e sistema de complementação (complexo terminal de complemento, sC5b9). No entanto, marcadores adicionais, como elastase polimorfonuclear de neutrófilo (PMN), interleucina 6 (IL-6) e fator de necrose tumoral - alfa (TNF) refletindo o estado de ativação dos leucócitos também podem ser contabilizados para as medições. Para determinar e quantificar as proteínas livres de células circulantes presentes no plasma de sangue, o ensaio imunosorbente ligado ao sanduíche (ELISA) representa um método convencional e mais confiável2,3. Da mesma forma, o fenotipo e o status de ativação das células hospedeiras (por exemplo, leucócitos) podem ser quantificados detectando a expressão da superfície celular das moléculas por citometria de fluxo (FACS) que fornece leituras baseadas em suspensão celular única, onde anticorpos específicos rotulados fluorescentes se ligam às moléculas de superfície celular alvo4. A microscopia eletrônica de varredura (SEM) também é recomendada para determinar a formação de trombos no material testado pelo padrão ISO 10993-41. Este método pode ser complementado com microtomografia de raios-X (μCT), para realizar análises estruturais do trombo, por exemplo, sua espessura, tamanho e localização em uma imagem renderizada 3D5.
A lógica por trás do uso desse modelo hemodinâmico in vitro é a triagem para os dispositivos médicos de melhor desempenho e compatíveis, entendendo a dinâmica fisiológica básica dos componentes sanguíneos, como plaquetas, que estão envolvidos na hemostase primária ou leucócitos e sua interação com diferentes tipos de dispositivos vasculares. Tais sistemas in vitro são altamente demandados, pois reduzem a necessidade de estudos em animais.
O modelo de loop aqui apresentado atende a essas exigências. Este modelo foi descrito pela primeira vez por A.B. Chandler em 1958 para a produção de trombo de sangue e é, portanto, também chamado chandler loop modelo6. Até agora, este modelo tem sido usado em uma série de experimentos e modificações para investigar a biocompatibilidade sanguínea dos dispositivos médicos7,8,9,10,11,12,13,14. Consiste em tubos de polímero, que são parcialmente preenchidos com sangue e moldados em laços re-closable. Estes laços giram em um banho de água controlado pela temperatura para simular condições de fluxo vascular com seus efeitos hemorheológicos. Métodos alternativos como modelos ou modelos acionados por bombas que usam válvulas mecânicas de esfera dentro das alças para induzir um fluxo sanguíneo dentro dos tubos de polímero já foram descritos15,16. No entanto, a vantagem geral do método aqui apresentado é que a força mecânica aplicada às células sanguíneas e proteínas é baixa, evitando a hemólise, e não há contato entre sangue e conectores, o que poderia possivelmente levar a turbulências de fluxo e ativação de componentes sanguíneos. Os principais fatores de ativação dentro do loop são o próprio material de teste e o ar que está preso dentro. Isso ajuda a minimizar as fontes de erro de medição e a fornecer uma alta reprodutibilidade, mesmo que a interface sangue-ar possa levar à desnaturação proteica17. Também é possível investigar variedades de materiais de tubulação e diâmetros de stent sem restrições de comprimento ou tamanho, permitindo assim o uso de tubos de diferentes comprimentos e diâmetro interno. Além disso, hemocompatibilidades hospedeiras sobre fechamento de loop impreciso e exposição à superfície do tubo não revestida também são possíveis de investigar. Outras aplicações médicas similares deste modelo de loop hemodinâmico in vitro é que ele também pode ser usado para estudar as interações entre imunoterapêuticas (drogas) e componentes sanguíneos durante o desenvolvimento pré-clínico ou triagem individual de segurança de drogas antes do primeiro teste clínico da fase I, ou para a geração de material thrombus que pode ser usado em experimentos adicionais18,19,20.
Este estudo descreve um protocolo detalhado para testar as hemocompatibilidades de tubos de perfusão e/ou stents. Aqui, a comparação entre tubos de PVC não revestidos e revestidos (hepPVC: revestimento de heparina, poliPVC: revestimento com polímero bioativo). A ativação reduzida das plaquetas, mas uma maior ativação do sistema de coagulação (FPA) foi encontrada para ambos os tubos revestidos em comparação com os tubos não revestidos. Os tubos de hepPVC utilizados aqui são modificados com heparina covalentemente ligada para torná-los tromboressistentes21 e já foram empregados em um modelo de loop para otimizar e caracterizar diferentes parâmetros22. Os tubos de polipvc utilizados neste estudo são tubos comercialmente disponíveis usados em ambientes clínicos de perfusão sanguínea extracorpórea e são revestidos com um polímero de heparina para reduzir sua trombogenicidade23. Às vezes, em aplicações clínicas até mesmo tubos de PVC não revestidos são usados. Por isso, incluímos tubos de látex como um grupo de controle positivo que mostrou ativação excessiva de plaquetas, sistema de coagulação e fatores solúveis como IL-6, TNF e PMN elastase. A formação de trombos foi notada quando o fechamento de loop impreciso foi simulado. Isso levou à ativação do sistema de coagulação e complementação, bem como leucócitos e plaquetas em comparação com as condições da linha de base. Além disso, o contato sanguíneo com o material de stent aqui usado (stent nitinol metálico nu, coberto com politetrafluoroetileno expandido impregnado de carbono) levou a uma maior ativação de plaquetas e leucócitos em termos de elastase PMN. No geral, o modelo apresentado não induziu hemólise em nenhum dos dispositivos vasculares testados, pois eram comparáveis às condições básicas ou estáticas, exceto os tubos de látex, onde a hemolise de glóbulos vermelhos (RBC) era óbvia. Além disso, esses tubos de perfusão podem ser examinados por imagem ou por histologia. Embora as avaliações histológicas possam ser viáveis, focamos principalmente na ELISA e na citometria de fluxo para realizar esses experimentos e, assim, possibilitando a viabilidade da realização de experimentos baseados no modelo aqui apresentado para muitos laboratórios. Assim, este método representa um método viável para testar a biocompatibilidade sanguínea dos dispositivos médicos vasculares de acordo com as recomendações da norma ISO 10993-4. Além disso, este método pode ser utilizado sempre que uma interação entre sangue e materiais deve ser testada em condições de fluxo, imitando as condições in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 ml tube, K3 EDTA</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>32332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td>Becton Dickinson BioSciences</td>
			<td>552843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>368512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa II cell analyzer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>647465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Citrate Tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>369714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer one-use holder</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>364815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Safety-Lok butterfly canula 21 G</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker glass ROTILABO short 10 ml</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>X686.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker glass ROTILABO short 50 ml</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>X688.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-human CD162 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-human CD41 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge ROTINA 420 | 420 R</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td>4701 | 4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHC Super modified, 5mm PVC tubing</td>
			<td>Corline Sweden</td>
			<td>1807-148</td>
			<td>Referred to as hepPVC tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular Precision Cutter</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 007-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Closing Unit (complete with tension bands)</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 008-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric tape Scotch Super 33+</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MMMA331933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA MAX Deluxe Set Human IL-6</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>430504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA MAX Deluxe Set Human TNF-a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>430204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,1 &#8211; 2,5 &#181;L, gray</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,5 &#8211; 10 &#181;L, gray</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 10 &#8211; 100 &#181;L, yellow</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 100 &#8211; 1,000 &#181;L, blue</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 20 &#8211; 200 &#181;L, yellow</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. sample bag, 0,5 &#8211; 5 mL, violet</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes polystyrene 5.0 ml round bottom</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum Gold Plus</td>
			<td>Bio-Sell</td>
			<td>FBS.GP.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>367116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluency plus stent 13.5 x 60 mm</td>
			<td>Angiomed GmbH &#38; Co</td>
			<td>FVM14060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free Hemoglobin fHb Reagent</td>
			<td>Bioanalytics GmbH</td>
			<td>004001-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS Tablets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves Vasco Nitril white L</td>
			<td>B. Braun Deutschland GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td>9208437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves Vasco Nitril white M</td>
			<td>B. Braun Deutschland GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td>9208429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25% aequous solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G6257-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin, 25.000 IE in 5 ml</td>
			<td>Rotexmedica, Trittau, Germany</td>
			<td>PZN 3862340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fibrinopeptide A (FPA) ELISA Kit</td>
			<td>H&#246;lzel Diagnostika</td>
			<td>abx253234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kodan tincture forte colourless</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td>104012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex tube, ID 5 mm</td>
			<td>Laborhandel24 GmbH</td>
			<td>305 0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loop Stand</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 009-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medimex venous tourniquet classic</td>
			<td>ROESER Medical GmbH</td>
			<td>310005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite 200 Pro M Plex</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>TEC006418I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate shaker PMS-1000i</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Metric non-phthalate PVC tubing, ID 5 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NALG8703-0508</td>
			<td>Referred to as PVC tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NexTemp (Standard) Single-Use Clinical Thermometer</td>
			<td>Medical Indicators</td>
			<td>2112-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp ELISA Plates, uncoated</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10256970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD16Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD62P (P-Selectin) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller, pipetus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips epT.I.P.S. 0.2 - 5 ml</td>
			<td>OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>5186480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips epT.I.P.S. standard 0,1 - 10&#181;l</td>
			<td>Th. Geyer GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>9409410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips epT.I.P.S. standard 2 - 200&#181;l</td>
			<td>Th. Geyer GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>0030 000.870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips epT.I.P.S. standard 50 - 1000&#181;l blue</td>
			<td>Th. Geyer GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>0030 000.919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMN (Neutrophil) Elastase Human ELISA Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BMS269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe stand ROTILABO combi</td>
			<td>CARL ROTH</td>
			<td>K082.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for rotation unit (12 slots 3/8 &#39;&#39; with variable slot width)</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 011-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10X)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-1184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotation Unit</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 010-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock micro test tubes 0.5 ml</td>
			<td>OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>5409320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock micro test tubes 1.5 ml</td>
			<td>OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>5409331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sc5b9 Human ELISA KIT</td>
			<td>TECOmedicalGroup</td>
			<td>A029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel no 10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9999403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope XL30 ESEM-FEG</td>
			<td>Philips</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 1000 ml, GL 45</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>X715.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 500 ml, GL 45</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>X714.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro cuvette 1.6 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67.746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10.0 ml</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 25.0 ml</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 5.0 ml</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tube, inner diameter 8 mm, outer diameter 12 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BURK8803-0812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprout mini centrifuge</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>552034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Solution for TMB Substrate</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>77316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swabs, sterile</td>
			<td>Fuhrmann GmbH</td>
			<td>32055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 ml</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled water basin</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 020-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butanol, 99.5%, extra pure, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10000730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB Substrate Set</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>421101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trillium PVC tube, 5 mm ID</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>161100107100103</td>
			<td>Referred to as polyPVC tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4974,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spektrometer Lambda 2</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>33539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vornado Mini Vortexer</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>55BV101-B-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XN-3000 workstation blood analyzer</td>
			<td>Sysmex Europe</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-CT Phoenix Nanotom S</td>
			<td>GE Sensing &#38; Inspection, Wunstorf, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro hemodynamic loop model to investigate the hemocytocompatibility and host cell activation of vascular medical devices

Neste estudo, a hemocompatibilidade de tubos com diâmetro interno de 5 mm feito de cloreto de polivinil (PVC) e revestido com diferentes conjugados bioativos foi comparada a tubos de PVC não revestidos, tubos de látex e um stent para aplicação intravascular que foi colocado dentro dos tubos de PVC. A avaliação da hemocompatibilidade foi feita utilizando-se um modelo de loop hemodinâmico in vitro que é recomendado pela norma ISO 10993-4. Os tubos foram cortados em segmentos de comprimento idêntico e fechados para formar laços evitando qualquer lacuna na emenda, depois preenchidos com sangue humano e girados em um banho de água a 37 °C por 3 horas. Depois disso, foi coletado sangue dentro dos tubos para análise de contagem total de células sanguíneas, hemolise (hemoglobina plasmática livre), sistema de complementação (sC5b-9), sistema de coagulação (fibrinopeptídeo A) e ativação leucócito (elastase polimorfonuclear, fator necrose tumoral e interleucina-6). A ativação de células hospedeiras foi determinada para ativação de plaquetas, status de integrin leucócito e agregados de plaquetas monocitos usando citometria de fluxo. O efeito do fechamento impreciso do loop foi examinado com microtomografia de raios-X e microscopia eletrônica de varredura, que mostrou formação de trombos na emenda. Os tubos de látex mostraram a ativação mais forte tanto do plasma quanto dos componentes celulares do sangue, indicando uma hemocompatibilidade ruim, seguido pelo grupo de stent e tubos de PVC não revestidos. Os tubos de PVC revestidos não apresentaram uma diminuição significativa no estado de ativação de plaquetas, mas apresentaram aumento na cascata de complemento e coagulação em comparação com tubos de PVC não revestidos. O modelo de loop em si não levou à ativação de células ou fatores solúveis, e o nível de hemólise era baixo. Portanto, o modelo de loop hemodinâmico in vitro apresentado evita a ativação excessiva de componentes sanguíneos por forças mecânicas e serve como método para investigar interações in vitro entre sangue doador e dispositivos médicos vasculares.

Todos os dados apresentados, exceto as parcelas FACS, foram analisados com um software estatístico. As parcelas FACS foram analisadas por meio do software de citometria de fluxo.
A análise da contagem completa de células sanguíneas não mostrou diferenças significativas em relação aos eritrócitos entre todas as condições testadas(Figura 2). Mas, plaquetas e leucócitos foram drasticamente reduzidas no grupo de látex, indicando uma biocompatibilidade muito ruim de látex. Isso é ainda sublinhado pelo aumento dos níveis de hemoglobina livre no grupo látex, indicando o fato de que, com exceção do grupo de látex, nenhum dos outros dispositivos vasculares ou condições levou a uma hemolise extensa(Figura 2). Além disso, os tubos de PVC revestidos, o policpvc e o hepPVC, bem como o stent testado não levaram à trombose por meio de perda de plaquetas e leucócitos, enquanto o látex apresentou a maior perda de plaquetas e leucócitos, seguido por tubos de PVC não revestidos que apresentaram tendência reduzida.
Enquanto todos os dispositivos vasculares testados levaram ao aumento da ativação do sistema de coagulação (FPA) e componente complementar (sC5b-9), os loops de hepPVC apresentaram uma tendência para a diminuição dos níveis de FPA e sC5b-9 quando comparados especificamente aos loops de policpvc(Figura 3). Curiosamente, os loops de PVC e Gap não revestidos apresentaram níveis mais baixos de FPA em comparação com o poliPVC, embora não atingindo o nível de significância estatística. No entanto, os loops de látex apresentaram níveis significativamente maiores de FPA quando comparados às condições de base e estáticas.
De acordo com toda a contagem de células sanguíneas, os loops de látex apresentaram os mais altos níveis de TNF, IL-6 e PMN elastase(Figura 4),atingindo o nível de significância estatística quando comparados com o resto dos grupos em termos de TNF e IL-6(Figura 4A,B),enquanto as condições estáticas e de linha de base em termos de elastase PMN(Figura 4C). Estes resultados indicam a potente ativação de leucócitos por látex. Os níveis de linha de base dos marcadores de ativação sempre foram comparáveis às condições estáticas, indicando uma heparinização adequada do sangue.
Curiosamente, mostrou-se que as contagens de plaquetas e leucócitos para loops induzidos por lacunas foram apenas ligeiramente reduzidas com ativação moderada do sistema coagulatório (FPA) e leucócitos (PMN elastase), embora o fechamento de loop inadequado com turbulências de fluxo resultantes e contato sanguíneo à superfície de corte não revestida e áspera levou a coágulos macroscopicamente visíveis na emenda(Figura 1F). Os coágulos e sua distribuição sobre toda a superfície da emenda ficaram evidentes com imagens μCT e SEM, enquanto nenhum coágulo foi encontrado quando os loops foram fechados com o dispositivo de fechamento externo não deixando nenhuma lacuna entre as terminações do loop(Figura 5).
A análise citométrica de fluxo das células sanguíneas hospedeiras que foram manchadas com marcadores específicos de plaquetas, CD41 e marcador de ativação de plaquetas CD62P, são mostradas na Figura 6A,B. Aqui, os tubos de látex apresentaram intensidade de fluorescência mediana extremamente alta (MFI) para CD62P em plaquetas sanguíneas, seguidos por stent, enquanto os tubos de polipVC revestidos de heparina apresentaram ativação mínima de plaquetas que retratam propriedade anti-trombogênica de tubos de polipVC. Além disso, os leucócitos foram classificados com base na granularidade baseada em CD45 e SSC (dispersão lateral) em (i) granuócitos; (ii) monócitos e (iii) linfócitos(Figura 7),e a expressão de CD162+ integrin foi detectada em cada subpopulação de leucócitos que são conhecidos por interagir com o CD62P nas plaquetas24. Notou-se que as expressões integrinas foram drasticamente reduzidas em granulócitos e linfócitos em loops de látex. Este resultado foi em linha com os níveis reduzidos de frequências totais de leucócitos nas alças de látex(Figura 2). Em geral, os níveis de integrin foram mais elevados entre os monócitos quando comparados aos granulócitos e linfócitos, indicando a probabilidade de interação monocito com plaquetas ativadas. Nesse sentido, os agregados de plaquetas monócitos também foram avaliados pela coloração das células sanguíneas com CD14 (como marcador monócito) e CD41 (como marcador de plaqueta) e, em última instância, para identificar células duplas positivas, ou seja, CD14+CD41+MPA (Figura 8). Aqui, notamos que o grupo de stent apresentou os mais altos níveis de expressão CD41 no MPA, seguido pelo grupo de látex, indicando uma tendência aumentada para formar MPA, apesar da frequência reduzida de monócito (<1 %) nos loops de látex.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral do modelo de loop hemodinâmico in vitro e suas modificações. (A) Loop para o experimento de lacuna com sistema externo de fechamento de loop, não deixando nenhuma lacuna na emenda. (B) Laço feito de tubo de PVC revestido de polipVC e stent dentro (seta). (C) Loop feito de tubo de látex. (D) Loop para o experimento de lacuna sem o sistema de fechamento de loop externo deixando uma lacuna entre as terminações do tubo (seta). (E) Laços colocados no berço de laço dentro do banho de água e cheios de sangue. (F) Trombo resultando em uma lacuna na emenda (seta) após a rotação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig02.jpg"> Figura 2: Resultados para contagem de células sanguíneas e hemoglobina plasmática. (A) Eritrócitos contam. (B) Contagem de plaquetas. (F) Leucócitos contam. (D) Hemoglobina de plasma livre. Os resultados indicam a baixa biocompatibilidade do látex, levando a hemólise excessiva. Os dados são apresentados como valor médio; as barras de erro indicam SEM. n=1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig03.jpg"> Figura 3: Resultados para ativação do sistema de coagulação e complementação. (A) Ativação do sistema de coagulação, medida por níveis de Fibrinopeptide A (FPA) (B) Complementar a ativação do sistema, medida por níveis de sC5b-9. Enquanto os tubos de látex evocavam níveis elevados significativos da FPA, a ativação complementar foi forte para todos os materiais testados. Os dados são apresentados como valor médio, as barras de erro indicam SEM. *p<0,05, n=1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig04.jpg"> Figura 4: Marcadores de ativação de leucócitos. (A) Fator de necrose tumoral alfa (TNF). (B) Interleucina 6 (IL-6) (C) PMN Elastase. Os resultados indicam aumento da ativação de leucócitos devido aos níveis elevados dos marcadores analisados, seguidos por laços de stent, que só levaram a níveis aumentados para PMN Elastase, mas não TNF ou IL-6. Os dados são apresentados como valor médio, as barras de erro indicam SEM. *p<0.5; **p<0,01, n=1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig05.jpg"> Figura 5: Imagem da emenda dos laços. (A) μ tomografia computadorizada (μCT) de loops com fechamento inadequado (lacuna). As áreas vermelhas indicam material trombo. (B) Renderização do lado luminal do tubo. A seleção retangular indica a área para a microscopia eletrônica de varredura (SEM) (C). (D) μCT de loops com dispositivo de fechamento de loop externo e nenhuma lacuna na emenda, e (E) renderização e visão da superfície luminal. Nenhum material de trombo foi encontrado. (F) IMAGEM SEM da seleção retangular em (E). Nenhum material de trombo foi encontrado na superfície de corte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig06.jpg"> Figura 6: Parcela FACS para ativação de plaquetas (CD62P). (A) Gráfico FACS representativo (condição básica) mostrando o sangue CD41+ plaquetas. (B) Gráfico mostrando o estado de ativação plaquetária refletido pela intensidade média de fluorescência (FI) dos diferentes tipos de dispositivos vasculares em comparação com as condições estáticas de TR e linha de base. As barras de dados apresentam dados de medições únicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig07.jpg"> Figura 7: Trama FACS para leucócito integrin (CD162). (A) Gráfico representativo FACS (condição básica) mostrando o sangue CD45+ leucócitos e subgrupos(B) Gráfico mostrando a intensidade de fluorescência média leucócitos (MFI) dos diferentes tipos de dispositivos vasculares em comparação com as condições estáticas e de linha de base. As barras de dados apresentam dados de medições únicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig08.jpg"> Figura 8: Gráfico FACS para agregados de monócitos plaquetas (CD41/CD14). (A) Gráfico representativo FACS (condição básica) mostrando a gating para monócitos sanguíneos (CD45+/CD14+), plaquetas (CD41+) e agregados de plaquetas monocitos (CD41+/CD14+) (B) Gráfico mostrando o CD41+ intensidade média de fluorescência (MFI) nos agregados de plaquetas monócitos para os diversos dispositivos vasculares em comparação com as condições estáticas e de linha de base. As barras de dados apresentam dados de medições únicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

Apresentado aqui é um protocolo para um modelo de loop hemodinâmico in vitro padronizado. Este modelo permite testar a hemocompatibilidade de tubos de perfusão ou stents vasculares de acordo com a norma ISO (Organização Internacional para Padronização) 10993-4.

Um modelo de loop hemodinâmico in vitro para investigar a hemocitocompatibilidade e ativação celular hospedeira de dispositivos médicos vasculares

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive ...

Este modelo de loop hemodinâmico permite que os pesquisadores testem a compatibilidade in vitro de hemo de dispositivos vasculares, como tubos de perfusão ou stents. em condições padronizadas. Assim, esta técnica não exerce qualquer impacto sobre o sangue por força mecânica e, assim, evita os resultados enganosos pela ativação intrínseca dos componentes sanguíneos.Antes de tentar um experimento, deve ser praticada a montagem adequada da peça mecânica, a construção perfeita do sistema de fechamento de loops e a carga lenta de sangue nas alças. Para preparar o conjunto de laços, use um cortador de tubos para cortar peças internas de 250 centímetros de comprimento e cinco milímetros de diâmetro interno em uma superfície plana. E conecte as terminações abertas dos tubos em um pequeno pedaço de tubo de silício que encaixe o diâmetro externo do tubo investigativo para gerar uma forma de loop.Aperte cuidadosamente o parafuso de travamento do conector da banda de tensão e ajuste a força de fechamento para que não fique nenhuma lacuna entre as duas dobras. Se o parafuso de bloqueio estiver totalmente apertado e a tensão da faixa de policarbonato parecer muito baixa para fechar a distância entre as duas dobras, abra o sistema de bloqueio e corte alguns milímetros da faixa de tensão. Para preparar um conjunto de loop stent, abra dois dos loops e tire o tubo do sistema de banda de tensão.Em seguida, insira o stent no meio do tubo, conforme instruído pelo fabricante. Quando o número apropriado de loops para o experimento tiver sido gerado, fixe as alças no berço de loop da unidade de rotação, fora de um banho de água de 37 graus e conecte o suporte de laço à unidade de rotação dentro do banho de água. Em seguida, encha uma seringa de 10 mililitros para cada duas alças de sangue a serem coletadas com 150 microliters ou solução de estoque de heparina recém-preparada e use uma borboleta calibre 21 para coletar suavemente sangue nas seringas, tomando o cuidado de evitar a homolise ou ativação celular devido ao vácuo excessivo.Quando todo o sangue tiver sido coletado, transfira o sangue para um copo de vidro e use uma pipeta sorológica de cinco mililitros, para misturar suavemente o sangue e a heparina. Quando uma solução homogênea tiver sido obtida com a ponta pipeta não totalmente inserida no tubo, cuidadosamente, encha cada laço com cinco mililitros de sangue. Feche cada loop depois de preenchido e confirme que o laço, a banda de tensão e o rack estão devidamente protegidos.Em seguida, gire os loops por três horas a 30 revoluções por minuto. No final da rotação, deixe que os laços fiquem no rack por dois minutos para deixar o sangue acumular na parte inferior do laço antes de abrir cuidadosamente os conectores e puxar o sangue das duplicatas em béquers de vidro individuais de 10 mililitros. Quando todo o sangue tiver sido coletado enxágue cada tubo com 10 mililitros de PBS e use um bisturi para cortar cuidadosamente uma amostra de um centímetro da extremidade de cada tubo.Incubar as amostras durante a noite em 2% glutaraldeído a quatro graus celsius, seguido por uma incubação de 15 minutos e 1% de tetroxida de ósmio à temperatura ambiente. Ao final da incubação do tetroxida de ósmio, desidratar as amostras em uma série ascendente de etanol por 20 minutos por concentração, seguida de uma desidratação de 30 minutos em 100% etanol. No final da incubação de 100% de etanol, deixe as amostras secarem durante a noite à temperatura ambiente antes de examinar as amostras através da varredura de microscopia eletrônica em uma tensão de aceleração de cinco quilovolts, usando um scanner microCácido de raios-X.Para análise citométrica de fluxo das amostras de sangue. Transfira 100 microliters de sangue de cada amostra para cada um dos nove tubos FACS de cinco mililitros e fixe as amostras com a adição de 100 microliters de 4% de formaldeído por tubo por 15 minutos à temperatura ambiente protegido da luz. Após a lavagem, suspenda-se cada pelota em um mililitro de tampão de lise de glóbulos vermelhos por tubo, para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente, protegido da luz.No final da incubação, lave as amostras por centrifugação em um mililitro de PBS por tubo e coloque as amostras sem seus sobrenantes no gelo. Para preparar contas de compensação de manchas únicas, adicione quatro gotas de contas positivas e quatro gotas negativas a volumes individuais de um mililitro de buffer FACS e o vórtice das soluções para obter suspensões homogêneas de contas. Adicione 100 microliters de cada solução a cada um dos quatro ou cinco tubos FACS mililitros rotulados como indicado e lave as contas com um mililitro de tampão FACS por tubo.Em seguida, adicione 100 microliters do coquetel de anticorpos de vórtice apropriado a cada experimental e fluorescência menos um tubo com mistura suave. Para uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente, protegido da luz. No final da incubação, lave as amostras com um mililitro de tampão FACS fresco por amostra e resuspende pelotas em 250 microliters de tampão FACS por tubo.Antes de analisar as contas em amostras de células por citometria de fluxo, de acordo com os protocolos padrão. As distribuições de células sanguíneas podem ser visualizadas em toda a superfície de duas bloops emendadas por microCC e imagens de microscópio eletrônico de varredura, enquanto nenhum coágulo é observado em laços fechados sem lacunas. A análise de toda a contagem de células sanguíneas não mostra diferenças significativas nos números de eritrócitos entre qualquer uma das condições testadas, números plaquetas e leucócitos, no entanto, são drasticamente reduzidos no grupo de loop de látex e os números de hemoglobina livre são dramaticamente aumentados, indicando uma biocompatibilidade muito ruim do látex.Enquanto todos os dispositivos vasculares testados induzem uma ativação aumentada do sistema de coagulação e componente de elogio. Os laços de PVC revestidos de heparina apresentam uma tendência para a diminuição dos níveis de ambos os tipos de ativações em comparação com os laços de PVC revestidos de polímero. Os loops de látex exibem os mais altos níveis de TNF IL-6 e PMN elastase, destacando a potente ativação de leucócitos por látex.As plaquetas positivas CD41 recuperadas de tubos de látex, apresentam uma intensidade de fluorescência mediana extremamente alta para CD62P, enquanto a expressão integrada é drasticamente reduzida em granulócitos e linfócitos. De interesse, os níveis integrais são mais elevados em monócitos de tubos de látex, sugerindo interações de plaquetas ativadas por monócitos. De fato, a coloração para agregados de plaquetas monócitos revela uma tendência aumentada de agregação em laços de látex e stent.Apesar da frequência reduzida de monócitos dentro de loops de látex. Para evitar a ativação intrínseca do componente sanguíneo é importante garantir um fechamento adequado do laço e manusear o sangue com cuidado. Assim, seguindo este procedimento, é possível analisar a interação entre proteínas aogenéricas ou TRUCKs e componentes sanguíneos que são usados em inflamação ou pesquisa farmacêutica.

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Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

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Excitotóxico Estimulação do Microslices cérebro como um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de AVC

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

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Lesão por Isquemia-Reperfusão de Órgãos simulando alterações hemodinâmicas no modelo de transplante de fígado de rato

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...