Name: an in vitro hemodynamic loop model to investigate the hemocytocompatibility and host cell activation of vascular medical devices
Uploaded: 2020-08-21T13:00:00
Duration: 8 min 44 s
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Los autores están agradecidos a la Sra. Elena Denks por su asistencia técnica.

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El financiador [ebo kunze industriedesign, Im Dentel 17, 72639 Neuffen, Alemania] proporcionó un apoyo financiero en forma de consumibles y honorarios de publicación al autor de este manuscrito [Max Wacker]. Los financiadores no tuvieron ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Este estudio ha demostrado que el modelo de bucle hemodinámico in vitro presentado ofrece un método fiable para probar la compatibilidad sanguínea in vitro de dispositivos médicos de acuerdo con la norma ISO 10993-4.
Los pasos críticos en el protocolo incluyen el dibujo de sangre y el llenado de los tubos con sangre, donde se debe evitar el vacío excesivo o la agitación para evitar que los componentes sanguíneos se activan por el procedimiento de manipulación. Además, es muy importante congelar inmediatamente las muestras de plasma y mantenerlas sobre hielo después de la descongelación, ya que el complemento y la activación del sistema de coagulación pueden ser manipulados manteniendo las muestras a temperatura ambiente durante más tiempo.
Dado que este modelo tiene méritos y deméritos en comparación con otros modelos in vitro, hay que tener en cuenta varios factores al diseñar los experimentos.
En primer lugar, los bucles se pueden variar en longitud y diámetro para adaptarse a varias configuraciones experimentales. En caso de que la configuración incluya tubos de contraste de diferentes diámetros interiores, debe tenerse en cuenta que las diferencias de diámetro darán lugar a diferentes fuerzas de cizallamiento, afectando así a la coagulación y complementar la cascada7. En segundo lugar, la velocidad de rotación se estableció en 30 rpm en este experimento. Esto dará lugar a un flujo sanguíneo de aproximadamente 25 cm/s, que es comparable a la velocidad del flujo sanguíneo en los injertos de bypass de la arteria coronaria humana25. La tasa de deformación unitaria, generada por la rotación de los bucles, es el parámetro principal que iniciará cascadas bioquímicas de componentes sanguíneos, incluidas las células y las proteínas libres de células. Pero como la sangre es un fluido no newtoniano, la tasa de tensión también se verá influenciada por la curvatura del tubo, respectivamente, la longitud de los tubos que están cerrados a los bucles10. Siempre que se cambia la velocidad de rotación o el tamaño del bucle, es importante tener en cuenta que la correlación entre la velocidad de deformación unitaria y la velocidad de rotación no es lineal. La correlación entre la velocidad de rotación y la tasa de deformación unitaria no se examina suficientemente hasta hoy y se requieren más estudios para investigar estos parámetros particulares10,26,27. Sin embargo, basado en un modelo para la capa límite laminar, el diámetro de tubo dado de 5 mm y la velocidad de rotación de 25 cm/s, una estimación aproximada de la tensión de cizallamiento de la pared (WSS) indicaría valores entre 2,20-22,00 pascal para una distancia de 1,00-0,01 mm a la pared del tubo cuando se estima que la densidad de sangre es de 1060 kg*m-3 y la viscosidad cine kinetical se establece en 0.0025 pascal*s28,29. Curiosamente, también un análisis computacional más detallado de la dinámica de flujo en la curvatura de las arterias coronarias humanas mostró valores WSS que van desde 11.33 a 16.77 pascal a parámetros aproximadamente comparables para la velocidad, densidad y viscosidad de la sangre30.
Además de esta limitación, el modelo de bucle presentado es un sistema de presión menos, que no imita las relaciones de presión arterial intravasculares del sistema vascular humano.
La siguiente limitación importante es que la sangre está en contacto con el aire dentro de los bucles, lo que trae interferencias adicionales. Tal contacto sangre-aire se ve afectado por dos parámetros, que incluyen la permeabilidad al gas de los tubos y la retención de aire dentro de los bucles mientras se llenan de sangre. Cada material de tubo posee una cierta permeabilidad al gas que puede conducir a cambios significativos en las concentraciones de gas dentro de los tubos. Si bien algunos autores afirman que el efecto resultante de la permeabilidad del gas en la activación de los componentes sanguíneos sigue siendo poco claro31,se sabe que la función de los coaguladores de la sangre es altamente sensible a un pH-shift, que puede ser causado por la difusión de CO2 32,33,34. Aquí, hemos probado la biocompatibilidad de los tubos de perfusión sanguínea en condiciones de aire interior, comparables a los escenarios clínicos de perfusión extracorpórea de sangre. Para futuras mejoras del modelo presentado, la incubación de todo el modelo en una incubadora deCO2 y la realización de la validación del pH de la sangre antes y después de la incubación podrían ser útiles para estandarizar aún más este modelo.
Además, la interfaz sangre-aire dentro de los bucles puede conducir a la activación de proteínas plasmáticas y fracciones celulares de la sangre35,36. Los dispositivos accionados por bomba de rodillos sin aire dentro de los tubos pueden evitar el problema de la interfaz sangre-aire, pero sin duda inducen daños a las células sanguíneas con niveles elevados significativos de hemoglobina en comparación con el modelo de bucle aquí presentado, y la hemoglobina en plasma puede interferir con la sensibilidad de los analitos analizados en ELISA16. En este estudio hemos demostrado que el efecto hemolítico del propio modelo de bucle sigue siendo mínimo mientras se utilizan materiales biocompatibles como tubos de PVC recubiertos de heparina. Por lo tanto, el modelo no está causando daños celulares excesivos en comparación con los modelos impulsados por bombas, sino por otro lado induciendo proteínas plasmáticas debido al contacto con el aire sanguíneo. Cabe destacar que van Oeveren et al. desarrollaron un modelo de bucle basado en válvulas de bola evitando el aire dentro de los bucles16. Esta prometedora alternativa al modelo de bucle aquí presentado puede superar el problema de la interfaz de aire sanguíneo, sin embargo, en comparación con el modelo presentado aquí, la adhesión plaquetaria es aún mayor para el modelo de bucle basado en válvula de bola.
Con respecto al control estático, cabe señalar que el propio vidrio ha demostrado ser un potente activador del sistema coagulatorio37. Sin embargo, en la configuración presentada, la incubación en un vaso de precipitados de vidrio (control estático) no condujo a la activación excesiva de la célula huésped o la activación del sistema coagulatorio en comparación con los niveles basales directamente después de extraer la sangre. En conclusión, podría ser útil utilizar, por ejemplo, tubos de polipropileno, si el control estático muestra altos niveles de activación.
Independientemente de si se trata de un bucle basado o un modelo impulsado por bomba, estos modelos in vitro carecen por completo de las interacciones biológicas auténticas que son aportadas principalmente por un endotelio intacto, que es una superficie de contacto de sangre ideal. La razón detrás de este problema es más evidente cuando se está probando un dispositivo médico como un stent, lo que podría impartir diferentes resultados, en términos de activación y proteínas plasmáticas, durante su interacción con los componentes sanguíneos en presencia de endotelio. Esto declara ser un inconveniente importante de todos los sistemas in vitro discutidos que imitan el sistema circulatorio. Por lo tanto, para superar este problema, los nuevos sistemas microfluídicos que están completamente cubiertos con endotelio están ganando un interés inmenso, pero sin embargo en comparación con el modelo de bucle presentado aquí, todavía se limitan a acomodar volúmenes sanguíneos más pequeños y caudales mínimos38,39
Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que el modelo Chandler Loop sigue siendo un modelo robusto para la realización de pruebas estandarizadas sobre la biocompatibilidad sanguínea de dispositivos médicos vasculares en el campo de la investigación cardiovascular.

Las pruebas de hemocompatibilidad de dispositivos médicos son un paso crucial en el desarrollo de nuevos dispositivos como stents vasculares o tubos de perfusión para la oxigenación de membrana extracorpórea. Hasta hoy, los modelos animales se consideran como herramientas estándar para finalizar el procedimiento de prueba de los dispositivos médicos antes de su implementación en humanos. A partir de ahora, es necesario encontrar modelos in vitro alternativos que ayuden a minimizar las investigaciones en animales. En este estudio, por lo tanto, hemos explorado un modelo de bucle hemodinámico in vitro en miniatura. El objetivo de este método presentado es probar la compatibilidad in vitro de la sangre de los dispositivos médicos de acuerdo con la norma ISO 10993-4.
La norma ISO 10993-4 describe conjuntos estandarizados de parámetros clínicos a investigar en la muestra de sangre1. Brevemente, se trata de trombosis (agregación y recuento de plaquetas), coagulación (fibrinopéptido A, FPA), análisis hematológico (recuento completo de células sanguíneas), índice de hemólisis (hemoglobina plasmática libre) y el sistema de complemento (complejo de complemento terminal, sC5b9). Sin embargo, también se pueden tener en cuenta marcadores adicionales, como la elastasa polimorfonuclea polimorfonuclea (PMN), la interleucina 6 (IL-6) y el factor de necrosis tumoral - alfa (TNF) que refleja el estado de activación de los leucocitos para las mediciones. Para determinar y cuantificar las proteínas libres de células circulantes que están presentes en el plasma sanguíneo, el ensayo inmunoabsorbente ligado enzimático sándwich (ELISA) representa un método convencional y más fiable2,3. Del mismo modo, el fenotipo y el estado de activación de las células huésped (por ejemplo, leucocitos) se pueden cuantificar detectando la expresión de la superficie celular de las moléculas por citometría de flujo (FACS) que proporciona lecturas basadas en suspensión de una sola célula, donde los anticuerpos específicos con etiqueta fluorescente se unen a las moléculas de superficie celulardirigidas 4. La microscopía electrónica de barrido (SEM) también se recomienda para determinar la formación de trombos en el material probado por la norma ISO 10993-41. Este método se puede complementar con la microtomografía de rayos X (CCT), para realizar análisis estructurales del trombo, por ejemplo, su grosor, tamaño y localización en una imagen renderizada en 3D5.
La razón de ser detrás de usar este modelo hemodinámico in vitro es detectar los mejores dispositivos médicos compatibles y de mejor rendimiento mediante la comprensión de la dinámica fisiológica básica de los componentes sanguíneos como las plaquetas, que participan en la hemostasia primaria o leucocitos y su interacción con diferentes tipos de dispositivos vasculares. Estos sistemas in vitro son muy demandados, ya que reducen la necesidad de estudios en animales.
El modelo de bucle aquí presentado satisface estas demandas. Este modelo fue descrito por primera vez por A.B. Chandler en 1958 para la producción de trombos de sangre y, por lo tanto, también se llama Chandler Loop modelo6. Hasta ahora, este modelo se ha utilizado en una serie de experimentos y modificaciones para investigar la biocompatibilidad sanguínea de dispositivos médicos7,8,9,10,11,12,13,14. Consiste en tubos de polímero, que se llenan en parte de sangre y se forman en bucles re-closables. Estos bucles giran en un baño de agua con temperatura controlada para simular condiciones de flujo vascular con sus efectos hemoreológicos. Ya se han descrito métodos alternativos como modelos accionados por bomba o modelos que utilizan válvulas de bola mecánicas dentro de los bucles para inducir un flujo sanguíneo dentro de los tubos de polímero15,16. Sin embargo, la ventaja general del método aquí presentado es que la fuerza mecánica aplicada a las células sanguíneas y proteínas es baja, evitando la hemólisis, y no hay contacto entre la sangre y los conectores, que posiblemente podría conducir a turbulencias de flujo y activación de los componentes sanguíneos. Los principales factores de activación dentro del bucle son el propio material de prueba y el aire que está atrapado en su interior. Esto ayuda a minimizar las fuentes de error de medición y a proporcionar una alta reproducibilidad, incluso si la interfaz sangre-aire puede conducir a la desnaturalización deproteínas 17. También es posible investigar variedades de materiales de tubo y diámetros de stent sin restricciones de longitud o tamaño permitiendo así el uso de tubos de diferente longitud y diámetro interior. Además, también es posible investigar las hemocompatibilidades del huésped sobre el cierre inexacto del lazo y la exposición a la superficie del tubo sin recubrimiento. Otras aplicaciones médicas similares de este modelo de bucle hemodinámico in vitro es que también podría utilizarse para estudiar las interacciones entre la inmunoterapia (drogas) y los componentes sanguíneos durante el desarrollo preclínico o el cribado individual de la seguridad de los medicamentos antes del ensayo clínico de primera fase I, o para la generación de material trombo que se puede utilizar en experimentos posteriores18,19,20.
Este estudio describe un protocolo detallado para probar las hemocompatibilidades de tubos de perfusión y/o stents. Aquí, la comparación entre tubos de PVC sin recubrimiento y recubiertos (hepPVC: recubrimiento de heparina, poliPVC: recubrimiento con polímero bioactivo). Se redujo la activación de las plaquetas, pero se encontró una mayor activación del sistema de coagulación (FPA) para ambos tubos recubiertos en comparación con los tubos no recubiertos. Los tubos hepPVC utilizados aquí se modifican con heparina unida covalentemente para hacerlos resistentes a la tromborrea21 y ya han sido empleados en un modelo de bucle para optimizar y caracterizar diferentes parámetros22. Los tubos poliPVC utilizados en este estudio son tubos disponibles comercialmente utilizados en entornos clínicos de perfusión extracorpórea de sangre y están recubiertos con un polímero de heparina para reducir su trombogenidad23. A veces, en aplicaciones clínicas incluso se utilizan tubos de PVC sin recubrimiento. Por lo tanto, incluimos tubos de látex como un grupo de control positivo que mostró una activación excesiva de plaquetas, sistema de coagulación y factores solubles como IL-6, TNF y PMN elastasa. La formación de trombos se notó cuando se simulaba un cierre de bucle inexacto. Esto condujo a la activación del sistema de coagulación y complemento, así como leucocitos y plaquetas en comparación con las condiciones basales. Además, el contacto con la sangre con el material de stent aquí utilizado (stent de nitinol de metal puro, cubierto con politetrafluoroetileno expandido impregnado de carbono) condujo a una mayor activación de plaquetas y leucocitos en términos de la elastasa PMN. En general, el modelo presentado no indujo hemólisis en ninguno de los dispositivos vasculares probados, ya que eran comparables a las condiciones basales o estáticas, excepto en los tubos de látex, donde la hemólisis de glóbulos rojos (RBC) era obvia. Además, estos tubos de perfusión se pueden examinar por imágenes o por histología. Aunque las evaluaciones histológicas podrían ser factibles, nos centramos principalmente en ELISA y citometría de flujo para realizar estos experimentos y así permitir la viabilidad de realizar experimentos basados en el modelo aquí presentado para muchos laboratorios. Por lo tanto, este método representa un método factible para probar la biocompatibilidad en sangre de los dispositivos médicos vasculares de acuerdo con las recomendaciones de la norma ISO 10993-4. Además, este método se puede utilizar siempre que se pruebe una interacción entre la sangre y los materiales en condiciones de flujo, imitando las condiciones in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 ml tube, K3 EDTA</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>32332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td>Becton Dickinson BioSciences</td>
			<td>552843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>368512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa II cell analyzer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>647465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Citrate Tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>369714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer one-use holder</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>364815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Safety-Lok butterfly canula 21 G</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker glass ROTILABO short 10 ml</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>X686.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker glass ROTILABO short 50 ml</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>X688.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-human CD162 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-human CD41 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge ROTINA 420 | 420 R</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td>4701 | 4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHC Super modified, 5mm PVC tubing</td>
			<td>Corline Sweden</td>
			<td>1807-148</td>
			<td>Referred to as hepPVC tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular Precision Cutter</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 007-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Closing Unit (complete with tension bands)</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 008-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric tape Scotch Super 33+</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MMMA331933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA MAX Deluxe Set Human IL-6</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>430504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA MAX Deluxe Set Human TNF-a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>430204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,1 &#8211; 2,5 &#181;L, gray</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,5 &#8211; 10 &#181;L, gray</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 10 &#8211; 100 &#181;L, yellow</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 100 &#8211; 1,000 &#181;L, blue</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 20 &#8211; 200 &#181;L, yellow</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. sample bag, 0,5 &#8211; 5 mL, violet</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>3123000071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes polystyrene 5.0 ml round bottom</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum Gold Plus</td>
			<td>Bio-Sell</td>
			<td>FBS.GP.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>367116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluency plus stent 13.5 x 60 mm</td>
			<td>Angiomed GmbH &#38; Co</td>
			<td>FVM14060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free Hemoglobin fHb Reagent</td>
			<td>Bioanalytics GmbH</td>
			<td>004001-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS Tablets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves Vasco Nitril white L</td>
			<td>B. Braun Deutschland GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td>9208437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves Vasco Nitril white M</td>
			<td>B. Braun Deutschland GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td>9208429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25% aequous solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G6257-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin, 25.000 IE in 5 ml</td>
			<td>Rotexmedica, Trittau, Germany</td>
			<td>PZN 3862340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fibrinopeptide A (FPA) ELISA Kit</td>
			<td>H&#246;lzel Diagnostika</td>
			<td>abx253234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kodan tincture forte colourless</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td>104012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex tube, ID 5 mm</td>
			<td>Laborhandel24 GmbH</td>
			<td>305 0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loop Stand</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 009-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medimex venous tourniquet classic</td>
			<td>ROESER Medical GmbH</td>
			<td>310005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite 200 Pro M Plex</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>TEC006418I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate shaker PMS-1000i</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Metric non-phthalate PVC tubing, ID 5 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NALG8703-0508</td>
			<td>Referred to as PVC tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NexTemp (Standard) Single-Use Clinical Thermometer</td>
			<td>Medical Indicators</td>
			<td>2112-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp ELISA Plates, uncoated</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10256970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD16Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>302008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD62P (P-Selectin) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller, pipetus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips epT.I.P.S. 0.2 - 5 ml</td>
			<td>OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>5186480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips epT.I.P.S. standard 0,1 - 10&#181;l</td>
			<td>Th. Geyer GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>9409410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips epT.I.P.S. standard 2 - 200&#181;l</td>
			<td>Th. Geyer GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>0030 000.870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips epT.I.P.S. standard 50 - 1000&#181;l blue</td>
			<td>Th. Geyer GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>0030 000.919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMN (Neutrophil) Elastase Human ELISA Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BMS269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe stand ROTILABO combi</td>
			<td>CARL ROTH</td>
			<td>K082.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for rotation unit (12 slots 3/8 &#39;&#39; with variable slot width)</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 011-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10X)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-1184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotation Unit</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 010-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock micro test tubes 0.5 ml</td>
			<td>OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>5409320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock micro test tubes 1.5 ml</td>
			<td>OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>5409331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sc5b9 Human ELISA KIT</td>
			<td>TECOmedicalGroup</td>
			<td>A029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel no 10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9999403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope XL30 ESEM-FEG</td>
			<td>Philips</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 1000 ml, GL 45</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>X715.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 500 ml, GL 45</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>X714.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro cuvette 1.6 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67.746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10.0 ml</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 25.0 ml</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 5.0 ml</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tube, inner diameter 8 mm, outer diameter 12 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BURK8803-0812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprout mini centrifuge</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>552034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Solution for TMB Substrate</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>77316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swabs, sterile</td>
			<td>Fuhrmann GmbH</td>
			<td>32055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 ml</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled water basin</td>
			<td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany</td>
			<td>CLS 020-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butanol, 99.5%, extra pure, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10000730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB Substrate Set</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>421101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trillium PVC tube, 5 mm ID</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>161100107100103</td>
			<td>Referred to as polyPVC tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4974,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spektrometer Lambda 2</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>33539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vornado Mini Vortexer</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>55BV101-B-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XN-3000 workstation blood analyzer</td>
			<td>Sysmex Europe</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-CT Phoenix Nanotom S</td>
			<td>GE Sensing &#38; Inspection, Wunstorf, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro hemodynamic loop model to investigate the hemocytocompatibility and host cell activation of vascular medical devices

En este estudio, la hemocompatibilidad de tubos con un diámetro interno de 5 mm de cloruro de polivinilo (PVC) y recubiertos con diferentes conjugados bioactivos se comparó con tubos de PVC no recubiertos, tubos de látex y un stent para la aplicación intravascular que se colocó dentro de los tubos de PVC. La evaluación de la hemocompatibilidad se realizó utilizando un modelo de bucle hemodinámico in vitro recomendado por la norma ISO 10993-4. Los tubos se cortaron en segmentos de idéntica longitud y se cerraron para formar bucles evitando cualquier hueco en el empalme, luego se llenaron con sangre humana y se giraron en un baño de agua a 37 oC durante 3 horas. A partir de entonces, se recogió la sangre dentro de los tubos para el análisis del recuento de células sanguíneas enteras, la hemólisis (hemoglobina plasmática libre), el sistema de complemento (sC5b-9), el sistema de coagulación (fibrinopéptido A) y la activación de leucocitos (laastasa polimorfonuclear, factor de necrosis tumoral e interleucina-6). Se determinó la activación de la célula huésped para la activación plaquetaria, el estado de la integrina de leucocitos y los agregados plaquetario monocitocitos utilizando citometría de flujo. El efecto del cierre inexacto del bucle se examinó con microtomografía de rayos X y microscopía electrónica de barrido, que mostraba la formación de trombos en el empalme. Los tubos de látex mostraron la activación más fuerte de los componentes plasmáticos y celulares de la sangre, lo que indica una hemocompatibilidad deficiente, seguido por el grupo de stent y los tubos de PVC sin recubrimiento. Los tubos de PVC recubiertos no mostraron una disminución significativa en el estado de activación plaquetaria, pero mostraron un aumento en el complemento y la cascada de coagulación en comparación con los tubos de PVC sin recubrimiento. El modelo de bucle en sí no condujo a la activación de células o factores solubles, y el nivel de hemólisis era bajo. Por lo tanto, el modelo de bucle hemodinámico in vitro presentado evita la activación excesiva de los componentes sanguíneos por fuerzas mecánicas y sirve como método para investigar las interacciones in vitro entre la sangre del donante y los dispositivos médicos vasculares.

Todos los datos presentados, excepto las gráficas FACS, fueron analizados con un software de estadísticas. Las gráficas FACS se analizaron utilizando software de citometría de flujo.
El análisis del recuento completo de células sanguíneas no mostró diferencias significativas con respecto a los eritrocitos entre todas las condiciones analizadas (Figura 2). Sin embargo, las plaquetas y los leucocitos se redujeron drásticamente en el grupo de látex, lo que indica una muy mala biocompatibilidad del látex. Esto se subraya además por el aumento de los niveles de hemoglobina libre en el grupo de látex, lo que indica el hecho de que, a excepción del grupo de látex, ninguno de los otros dispositivos vasculares o condiciones condujo a una hemólisis extensa (Figura 2). Además, los tubos recubiertos de PVC, poliPVC y hepPVC, así como el stent probado no condujeron a la trombosis por medio de la pérdida de plaquetas y leucocitos, mientras que el látex exhibió la mayor pérdida de plaquetas y leucocitos, seguido de tubos de PVC sin recubrimiento que mostraron una tendencia disminuida.
Mientras que todos los dispositivos vasculares probados condujeron a una mayor activación del sistema de coagulación (FPA) y al componente de complemento (sC5b-9), los bucles hepPVC mostraron una tendencia a la disminución de los niveles de FPA y sC5b-9 en comparación específicamente con los bucles polyPVC(Figura 3). Curiosamente, los bucles de PVC y Gap sin recubrimiento mostraron niveles más bajos de FPA en comparación con polyPVC, aunque no alcanzando el nivel de significancia estadística. Sin embargo, los bucles de látex mostraron niveles significativamente mayores de FPA en comparación con las condiciones basales y estáticas.
De acuerdo con el recuento completo de células sanguíneas, los bucles de látex presentaban los niveles más altos de TNF, IL-6 y PMN elastase (Figura 4), alcanzando el nivel de significancia estadística en comparación con el resto de los grupos en términos de TNF e IL-6(Figura 4A,B), mientras que a las condiciones estáticas y basales en términos de la elastasa PMN (Figura 4C). Estos resultados indican la potente activación de leucocitos por látex. Los niveles basales de los marcadores de activación siempre fueron comparables a las condiciones estáticas, lo que indica una heparinización adecuada de la sangre.
Curiosamente, se demostró que los recuentos de plaquetas y leucocitos para bucles inducidos por brecha sólo se redujeron ligeramente con la activación moderada del sistema coagulatorio (FPA) y leucocitos (PMN elastasa), aunque el cierre incorrecto del bucle con turbulencias de flujo resultantes y el contacto sanguíneo a la superficie rugosa no revestida y cortante condujo a coágulos macroscópicamente visibles en el empalme(Figura 1F). Los coágulos y su distribución a lo largo de toda la superficie del empalme eran evidentes con las imágenes de TCT y SEM, mientras que no se encontró ningún coágulo cuando los bucles se cerraron con el dispositivo de cierre externo sin dejar ningún espacio entre las terminaciones del bucle (Figura 5).
El análisis citométrico de flujo de las células sanguíneas del huésped que se tiñeron con marcadores específicos de plaquetas, CD41 y el marcador de activación plaquetaria CD62P, se muestran en la Figura 6A,B. Aquí, los tubos de látex presentaban una intensidad de fluorescencia media extremadamente alta (IMF) para CD62P en las plaquetas sanguíneas, seguidos de stent, mientras que los tubos de poliPVC recubiertos de heparina presentaban una activación mínima de las plaquetas que representaban la propiedad antitrombógena de los tubos poliPVC. Además, los leucocitos se clasificaron sobre la base de la granularidad basada en CD45 y SSC (dispersión lateral) en (i) granulocitos; (ii) monocitos y iii) linfocitos(Figura 7),y la expresión de CD162+ integrina se detectó en cada subpoblación de leucocitos que se sabe que interactúan con el CD62P en las plaquetas24. Se notó que las expresiones de integrina se redujeron drásticamente en granulocitos y linfocitos en bucles de látex. Este resultado estuvo en línea con los niveles reducidos de frecuencias totales de leucocitos en los bucles de látex (Figura 2). En general, los niveles de integrina fueron más altos entre los monocitos en comparación con los granulocitos y linfocitos, lo que indica la probabilidad de que la interacción monocitos con plaquetas activadas. A este respecto, también se evaluaron los agregados plaquetarios monocitos manchando las células sanguíneas con CD14 (como marcador de monocitos) y CD41 (como marcador plaquetario) y, en última instancia, para identificar células dobles positivas, es decir, CD14+CD41+MPA (Figura 8). Aquí, notamos que el grupo stent exhibió los niveles más altos de expresión CD41 en la MPA, seguido por el grupo de látex, lo que indica una mayor tendencia a formar MPA, a pesar de la frecuencia reducida de monocitos (<1 %) en los bucles de látex.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig01.jpg"> Figura 1: Visión general del modelo de bucle hemodinámico in vitro y sus modificaciones. (A) Bucle para el experimento de separación con el sistema de cierre de bucle externo, sin dejar ningún hueco en el empalme. (B) Lazo hecho de tubo de PVC recubierto de poliPVC y stent interior (flecha). (C) Lazo de tubo de látex. (D) Bucle para el experimento de separación sin el sistema de cierre de bucle externo dejando un espacio entre las terminaciones de tubo (flecha). (E) Bucles colocados en la base del lazo dentro del baño de agua y llenos de sangre. (F) Thrombus dando como resultado un hueco en el empalme (flecha) después de la rotación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig02.jpg"> Figura 2: Resultados para el recuento de células sanguíneas y hemoglobina plasmática. (A) Cuentan los eritrocitos. (B) Recuento de plaquetas. (F) Cuentan los leucocitos. (D) Hemoglobina plasmática libre. Los resultados indican la mala biocompatibilidad del látex, lo que conduce a una hemólisis excesiva. Los datos se presentan como valor medio; las barras de error indican SEM. n.o 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig03.jpg"> Figura 3: Resultados para la activación del sistema de coagulación y complemento. (A) Activación del sistema de coagulación, medida por los niveles de Fibrinopéptido A (FPA) (B) Activación del sistema de complemento, medida por niveles de sC5b-9. Mientras que los tubos de látex evocaban niveles elevados significativos del FPA, la activación del complemento fue fuerte para todos los materiales probados. Los datos se presentan como valor medio, las barras de error indican SEM. *p<0.05, n-1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig04.jpg"> Figura 4: Marcadores de activación de leucocitos. (A) Factor de necrosis tumoral alfa (TNF). (B) Interleucina 6 (IL-6) (C) PMN Elastase. Los resultados indican una mayor activación de leucocitos debido a niveles elevados de los marcadores analizados, seguidos de bucles stent, que sólo condujeron a mayores niveles de PMN Elastase pero no TNF o IL-6. Los datos se presentan como valor medio, las barras de error indican SEM. *p<0.5; **p<0.01, n.o 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig05.jpg"> Figura 5: Imagen del empalme de los bucles. (A) tomografía μ-ordenador (-TC) de bucles con cierre incorrecto (brecha). Las áreas rojas indican material trombo. (B) Representación del lado luminal del tubo. La selección rectangular indica el área para escanear microscopía electrónica (SEM) (C). (D) de bucles con dispositivo de cierre de bucle externo y sin separación en el empalme, y (E) renderizado y vista de la superficie luminal. No se encontró material de trombo. (F) Imagen SEM de la selección rectangular en (E). No se encontró material de trombo en la superficie de corte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig06.jpg"> Figura 6: Gráfica FACS para activación plaquetaria (CD62P). (A) Gráfica representativa FACS (condición básica) que muestra la sangre CD41+ plaquetas. (B) Gráfico que muestra el estado de activación plaquetario reflejado por la intensidad media de fluorescencia (IMF) de los diferentes tipos de dispositivos vasculares en comparación con las condiciones estáticas RT y basales. Las barras de datos presentan datos de mediciones individuales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig07.jpg"> Figura 7: Gráfica FACS para leucocitos integrin (CD162). (A) Gráfica representativa del FACS (condición básica) que muestra la sangre CD45+ leucocitos y subgrupos (B) Gráfico que muestra el leucocitos CD162+ intensidad media de fluorescencia (FIN) de los diferentes tipos de dispositivos vasculares en comparación con las condiciones estáticas y basales. Las barras de datos presentan datos de mediciones individuales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig08.jpg"> Figura 8: Gráfica FACS para agregados de monocitos plaquetarias (CD41/CD14). (A) Gráfica representativa de FACS (condición básica) que muestra el gating para monocitos sanguíneos (CD45+/CD14+), plaquetas (CD41+) y agregados plaquetarios monocitos (CD41+/CD14+) (B) Gráfico que muestra la intensidad media de fluorescencia (MFI) cd41+ en agregados plaquetas monocitos para los diversos dispositivos vasculares en comparación con la línea de base y las condiciones basales. Las barras de datos presentan datos de mediciones individuales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

Aquí se presenta un protocolo para un modelo de bucle hemodinámico estandarizado. Este modelo permite probar la hemocompatibilidad de tubos de perfusión o stents vasculares para estar de acuerdo con la norma ISO (International Organization for Standardization) 10993-4.

Un modelo de bucle hemodinámico In Vitro para investigar la hemocitocompatibilidad y la activación de células host de dispositivos médicos vasculares

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive ...

Este modelo de bucle hemodinámico permite a los investigadores probar la compatibilidad hemo in vitro de dispositivos vasculares como tubos de perfusión o stents. en condiciones estandarizadas. Así que esta técnica no ejerce ningún impacto en la sangre por la fuerza mecánica y así evitar los resultados engañosos por la activación intrínseca de los componentes sanguíneos.Antes de intentar un experimento, se debe practicar el montaje adecuado de la pieza mecánica, la construcción perfecta del sistema de cierre de bucle y la carga lenta de sangre en los bucles. Para preparar el conjunto de bucle, utilice una cortadora de tubo para cortar piezas de tubo de 250 centímetros de largo y cinco milímetros de diámetro interior en una superficie plana. Y enchufe los terminaciones abiertos de los tubos en una pieza corta de tubo de silicio que se ajuste al diámetro exterior del tubo de investigación para generar una forma de bucle.Apriete cuidadosamente el tornillo de bloqueo del conector de la banda de tensión y ajuste la fuerza de cierre para que no quede ningún hueco entre las dos curvas. Si el tornillo de bloqueo está completamente apretado y la tensión de la banda de policarbonato parece demasiado baja para cerrar el espacio entre las dos flexiones, abra el sistema de bloqueo y corte unos milímetros de la banda de tensión. Para preparar un conjunto de bucle de stent, abra dos de los bucles y saque el tubo del sistema de banda de tensión.A continuación, inserte el stent en el centro del tubo según las instrucciones del fabricante. Cuando se haya generado el número adecuado de bucles para el experimento, asegure los bucles en la base de bucle de la unidad de rotación, fuera de un baño de agua de 37 grados y conecte la base del bucle a la unidad de rotación dentro del baño de agua. A continuación, llene una jeringa de 10 mililitros por cada dos bucles de sangre que se recogerán con 150 microlitros o solución de heparina recién preparada y utilice una mariposa de calibre 21 para recoger suavemente la sangre en las jeringas, teniendo cuidado de evitar la homolisis o la activación celular debido al vacío excesivo.Cuando se haya recogido toda la sangre, transfiera la sangre a un vaso de precipitados de vidrio y use una pipeta serológica de cinco mililitros, para mezclar suavemente la sangre y la heparina. Cuando se haya obtenido una solución homogénea con la punta de la pipeta no insertada completamente en el tubo, con cuidado, llene cada bucle con cinco mililitros de sangre. Cierre cada bucle después de que se haya llenado y confirme que el bucle, la banda de tensión y el bastidor están correctamente asegurados.A continuación, gire los bucles durante tres horas a 30 revoluciones por minuto. Al final de la rotación, deje que los bucles se pongan de pie en el bastidor durante dos minutos para dejar que la sangre se acumule en los fondos del lazo antes de abrir cuidadosamente los conectores y tirar de la sangre de duplicados en vasos de vidrio individuales de 10 mililitros. Cuando se haya recogido toda la sangre, enjuague cada tubo con 10 mililitros de PBS y use un bisturí para cortar cuidadosamente una muestra de un centímetro del extremo de cada tubo.Incubar las muestras durante la noche en 2%glutaraldehído a cuatro grados centígrados, seguido de una incubación de 15 minutos y un 1%tetróxido de osmio a temperatura ambiente. Al final de la incubación de tetróxido de osmio, deshidratar las muestras en una serie ascendente de etanol durante 20 minutos por concentración, seguida de una deshidratación de 30 minutos en 100% etanol. Al final de la incubación del 100% de etanol, deje que las muestras se sequen durante la noche a temperatura ambiente antes de tomar imágenes de las muestras mediante microscopía electrónica de barrido a una tensión de aceleración de cinco kilovoltas, utilizando un escáner de micro TC de rayos X.Para el análisis citométrico de flujo de las muestras de sangre. Transfiera 100 microlitros de sangre de cada muestra a cada uno de los nueve tubos FACS de cinco mililitros y fije las muestras con la adición de 100 microlitros de 4% de formaldehído de potencia por tubo durante 15 minutos a temperatura ambiente protegidos de la luz. Después del lavado, vuelva a suspender cada pellet en un mililitro de tampón de lisis de glóbulos rojos por tubo, para una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz.Al final de la incubación, lave las muestras por centrifugación en un mililitro de PBS por tubo y coloque las muestras sin sus sobrenadantes en hielo. Para preparar cuentas de compensación de manchas individuales, agregue cuatro gotas de cuentas positivas y cuatro gotas de cuentas negativas a volúmenes individuales de un mililitro de tampón FACS, y vórtice las soluciones para obtener suspensiones homogéneas de cuentas. Agregue 100 microlitros de cada solución a cada uno de los cuatro o cinco tubos FACS mililitros etiquetados como se indica y lave las perlas con un mililitro de tampón FACS por tubo.A continuación, añada 100 microlitros del cóctel de anticuerpos de vórtice adecuado a cada experimental y fluorescencia menos un tubo con una mezcla suave. Para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz. Al final de la incubación, lave las muestras con un mililitro de tampón FACS fresco por muestra y pellets resuspend en 250 microlitros de tampón FACS por tubo.Antes de analizar las perlas en las muestras celulares por citometría de flujo, de acuerdo con los protocolos estándar. Las distribuciones de células sanguíneas se pueden visualizar en toda la superficie de dos bloops empalmadas mediante micro TC y imágenes de microscopios electrónicos de barrido, mientras que no se observan coágulos en bucles cerrados sin huecos. El análisis de todo el recuento de células sanguíneas, no muestra diferencias significativas en el número de eritrocitos entre cualquiera de las condiciones probadas, el número de plaquetas y leucocitos, sin embargo, se reduce drásticamente en el grupo de bucles de látex y el número de hemoglobina libre se incrementan dramáticamente, lo que indica una muy pobre biocompatibilidad del látex.Mientras que todos los dispositivos vasculares probados inducen una mayor activación del sistema de coagulación y componente de complemento. Los bucles de PVC recubiertos de heparina exhiben una tendencia a la disminución de los niveles de ambos tipos de activaciones en comparación con los bucles de PVC recubiertos de polímero. Los bucles de látex exhiben los niveles más altos de TNF IL-6 y PMN elastase, destacando la potente activación de leucocitos por látex.Las plaquetas positivas CD41 recuperadas de tubos de látex, presentan una intensidad de fluorescencia media extremadamente alta para CD62P, mientras que la expresión integrada se reduce drásticamente en granulocitos y linfocitos. De interés, los niveles integrales son más altos en monocitos de tubos de látex, lo que sugiere interacciones plaquetarias activadas por monocitos. De hecho, la tinción de agregados plaquetarios monocitos revela una mayor tendencia a la agregación en bucles de látex y stent.A pesar de la frecuencia reducida de monocitos dentro de bucles de látex. Para evitar la activación intrínseca de los componentes sanguíneos es importante asegurar un cierre de bucle adecuado y manejar la sangre con cuidado. Así que siguiendo este procedimiento, es posible analizar la interacción entre proteínas alogénicas o TRUCKs y componentes sanguíneos que se utilizan en la inflamación o la investigación farmacéutica.

Research

JoVE Journal

Medicine

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Usando cuantitativa en tiempo real PCR para determinar quimerismo de células donantes en un modelo competitivo Trasplante de médula ósea murina

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Investigación

Medicina

Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula

Aspectos técnicos de la aortocava Fístula Ratón

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

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Excitotóxica Estimulación del cerebro Microslices como<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Carrera

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Monitoring of Systemic and Hepatic Hemodynamic Parameters in Mice

Monitoreo de Parámetros sistémicos y hemodinámicos hepática en ratones

The use of mouse models in experimental research is of enormous importance for the study of hepatic physiology and pathophysiological disturbances. ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Establecimiento de un modelo de xenoinjerto Humano mieloma múltiple en el pollo para estudiar el crecimiento del tumor, la invasión y la angiogénesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

Evaluación de perigenital Sensibilidad y Prostática mástil activación celular en un modelo de ratón de la separación materna neonatal

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the ...

Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video

Utilizando la técnica de la manga en un modelo murino de trasplante aórtico - un Video instructivo

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the ...

An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

Un optimizado Evans azul protocolo para evaluar la fuga Vascular en el ratón

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ...

Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow

Pruebas de hemocompatibilidad de implantes que contactan con la sangre en un modelo de bucle de flujo que imita el flujo sanguíneo humano

The growing use of medical devices (e.g., vascular grafts, stents, and cardiac catheters) for temporary or permanent purposes that remain in the ...

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

Lesión de isquemia-reperfusión de órganos mediante la simulación de cambios hemodinámicos en el modelo de trasplante de hígado de rata

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...